NGS檢測(cè)乙型肝炎病毒耐藥基因突變情況及其臨床意義

王創(chuàng)俊王慶曹治家楊學(xué)習(xí)

·論著·

NGS檢測(cè)乙型肝炎病毒耐藥基因突變情況及其臨床意義

王創(chuàng)俊1王慶1曹治家1楊學(xué)習(xí)2★

目的檢測(cè)乙型肝炎患者的HBV YMDD突變情況，探究下一代測(cè)序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）檢測(cè)HBV耐藥基因突變的可行性及患者性別與其YMDD突變的相關(guān)性，并為臨床用藥提供參考。方法運(yùn)用NGS測(cè)序技術(shù)對(duì)收集的100例臨床樣本進(jìn)行HBV YMDD突變的檢測(cè)，并與臨床檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)Sanger測(cè)序法的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果運(yùn)用NGS檢測(cè)100例HBV樣本，其中YMDD野生型88例，HBV YMDD耐藥基因突變12例，與Sanger測(cè)序法的測(cè)序結(jié)果完全相符。結(jié)論本研究結(jié)果顯示，NGS技術(shù)可用于HBV耐藥基因突變檢測(cè)，患者性別與HBV耐藥突變無(wú)明顯相關(guān)性。

NGS；HBV；耐藥基因突變

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染呈世界性分布，據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Orga?nization，WHO）的數(shù)據(jù)顯示，全球約有2.4億感染者，每年約有80萬(wàn)人死于與HBV相關(guān)的肝臟疾?。?］。根據(jù)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心的統(tǒng)計(jì)數(shù)字，截止至2015年7月份，中國(guó)乙肝病毒感染者達(dá)到9 000萬(wàn)［2］。目前臨床上對(duì)乙型肝炎主要的治療方法是抗病毒治療，國(guó)內(nèi)外普遍使用的藥物有干擾素和核苷（酸）類。其中拉米夫定（Lamivudine，LAM）別稱3TC，作為第一個(gè)被批準(zhǔn)使用的核苷類治療藥物，因其抑制病毒復(fù)制能力強(qiáng)及使用方便且療效確切，適用于不同階段的肝病患者，是長(zhǎng)期治療的合理選擇。但因其無(wú)法清除肝細(xì)胞內(nèi)病毒的超螺旋cDNA，患者長(zhǎng)期用藥時(shí)，易發(fā)生耐受的情況［3?4］。另外，HBV復(fù)制過(guò)程中存在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程，逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校正活性且病毒復(fù)制速率又保持在較高水平，因此產(chǎn)生了大量的核苷酸錯(cuò)配，使HBV在宿主體內(nèi)表現(xiàn)為大量的基因序列有差別［5］。HBV酪氨酸?甲硫氨酸?天門冬氨酸?天門冬氨酸（YMDD）變異對(duì)拉米夫定用藥產(chǎn)生影響，基因組變異為rt180、rt204和rt207［6］。

本研究運(yùn)用Ion Torrent ProtonTM測(cè)序系統(tǒng)［4］對(duì)收集的100例臨床樣本進(jìn)行HBV耐藥基因變異的檢測(cè)，并與臨床檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)的Sanger測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，驗(yàn)證NGS檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)乙肝患者的HBV YMDD突變的可行性，探究患者性別與HBV耐藥基因變異的相關(guān)性，為臨床治療方案的調(diào)整提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本

選取福建協(xié)和醫(yī)院經(jīng)臨床確診為HBV耐藥的血清樣本100例，其中男性68例，女性32例，年齡22～65歲，平均年齡（37.02±12.07）歲；陰陽(yáng)性質(zhì)控品各1例。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

本實(shí)驗(yàn)主要儀器信息見(jiàn)表1。

1.2.2 試劑

本實(shí)驗(yàn)主要試劑信息見(jiàn)表2。

表1 儀器信息Table 1The information of instruments

表2 試劑信息Table 2The information of reagents

1.3 方法

1.3.1 樣本DNA提取

使用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑盒（離心柱法），嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，使用Qubit?3.0熒光計(jì)或同類儀器對(duì)提取后的核酸進(jìn)行定量。提取后的DNA保存于-20℃。1.3.2DNA文庫(kù)構(gòu)建

提取得到的DNA樣本經(jīng)過(guò)定性PCR方法擴(kuò)增后采用生工SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，使用Ion AmpliSeq?Library Kit 2.0（Life Technologies公司，美國(guó)）進(jìn)行HBV樣本文庫(kù)構(gòu)建。具體建庫(kù)流程如：末端補(bǔ)平→產(chǎn)物純化→連接接頭→產(chǎn)物純化→擴(kuò)增產(chǎn)物→產(chǎn)物純化→文庫(kù)定量→完成建庫(kù)。

文庫(kù)構(gòu)建完畢存放于4℃冰箱，留待后續(xù)模板制備、模板富集實(shí)驗(yàn)用。

1.3.3 上機(jī)測(cè)序

1.3.3.1 混合文庫(kù)

將1.3.2中得到的DNA文庫(kù)濃度稀釋到200 pmol/L，等體積混合后，留待下一步實(shí)驗(yàn)操作。

1.3.3.2 模板制備和模板富集

使用Ion PITMHi?QTMOT2 Reagents 200 kit（Life Technologies公司，美國(guó)）試劑盒，在Ion One TouchTM2.0 System儀器（Life Technologies公司，美國(guó)）上嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作［7］，對(duì)上一步實(shí)驗(yàn)得到的樣本文庫(kù)進(jìn)行模板制備和模板富集。

1.3.3.3 DA8600測(cè)序儀測(cè)序

使用Ion PITMHi?Q?Sequencing 200 Kit（Life Technologies公司，美國(guó)）試劑盒，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作對(duì)上一步實(shí)驗(yàn)?zāi)０逯苽浜湍０甯患占降幕旌衔膸?kù)樣本進(jìn)行基因測(cè)序。

測(cè)序質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：1）陽(yáng)性質(zhì)控品：以6 μL陽(yáng)性質(zhì)控品作為待檢品，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為相應(yīng)型別的陽(yáng)性。2）陰性質(zhì)控品：以6 μL陰性質(zhì)控品作為待檢品，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為相應(yīng)型別的陰性。3）以上1）、2）需要同時(shí)滿足，否則需要重新實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 對(duì)照實(shí)驗(yàn)

使用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的乙型肝炎病毒耐藥基因突變檢測(cè)試劑盒（PCR?測(cè)序法）（國(guó)食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2014第3401444號(hào)）對(duì)100例樣本進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證NGS測(cè)序技術(shù)測(cè)序結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 HBV YMDD突變檢測(cè)結(jié)果

NGS測(cè)序技術(shù)檢測(cè)得到的結(jié)果為，100例HBV樣本中，共檢出HBV YMDD野生型88例，HBV YMDD突變型12例（其中YIDD變異8例，YVDD變異4例），且與對(duì)照方法Sanger測(cè)序結(jié)果比對(duì)正確率100％，如表3。

2.2 HBV YMDD突變與年齡的相關(guān)性

HBV耐藥基因野生型（YMDD）樣本中，男性59例，女性29例；HBV耐藥基因突變樣本中，男性8例，女性4例，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表4）。

表3 HBV耐藥基因突變NGS檢測(cè)結(jié)果Table 3The results of HBV drug?resistance gene sequencing

對(duì)表4數(shù)據(jù)做卡方檢驗(yàn)，假設(shè)H0=患者性別與HBV耐藥基因突變不相關(guān)，H1=患者性別與HBV耐藥基因相關(guān)。由卡方檢驗(yàn)公式，得x2=1.950 4＜ x2（0.05，1）=3.84，即P＞0.05，拒絕H1，接受H0。結(jié)論：患者性別與HBV耐藥基因突變不相關(guān)。

表4 HBV耐藥基因突變與性別的相關(guān)性Table 4The correlation between patients’gender and HBV YMDD mutation

2.32 種檢測(cè)方法相關(guān)性分析

100例樣本中，經(jīng)對(duì)照方法Sanger測(cè)序法檢測(cè)，HBV耐藥基因野生型有88例；HBV耐藥基因突變型有12例，其中YIDD突變有8例，YVDD突變有4例。則HBV耐藥基因檢測(cè)率為12.0％［7］。經(jīng)NGS測(cè)序技術(shù)檢測(cè)，乙肝耐藥基因突變型有12例，其中YIDD突變有8例，YVDD突變有4例；野生型（YMDD）有88例。Sanger測(cè)序法和NGS測(cè)序法兩者檢測(cè)結(jié)果均一致，靈敏性、特異性、準(zhǔn)確性均為100％，見(jiàn)表5。

表52 種測(cè)序技術(shù)測(cè)序結(jié)果比較Table 5The results comparision of NGS and Sanger Sequencing

由表5中數(shù)據(jù)可得，本次實(shí)驗(yàn)的靈敏性=100％×［a/（a+c）］，特異性=100％×［d/（b+d）］，總符合率= 100％×［（a+d）/（b+c）］。靈敏性即待考評(píng)試劑檢出突變病例占病例組總數(shù)的比例，又稱真陽(yáng)性率。即靈敏性=12/（12+0）×100％=100％。特異性指待考評(píng)試劑檢出無(wú)突變病例占對(duì)照組總數(shù)的比例，又稱真陰性率。即特異性=88/（0+88）×100％=100％。準(zhǔn)確性指真陽(yáng)性和真陰性占總樣本數(shù)的比例。即準(zhǔn)確性=（12+88）/100×100％=100％。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)主要運(yùn)用NGS測(cè)序技術(shù)對(duì)100例樣本進(jìn)行檢測(cè)，NGS是基于半導(dǎo)體技術(shù)，基因測(cè)序芯片的每個(gè)微孔里的微球表面含有樣品DNA序列的分子拷貝。本次檢測(cè)結(jié)果為100例樣本中，HBV耐藥基因野生型88例，突變型12例。此外，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置目前臨床檢測(cè)基因突變的“金標(biāo)準(zhǔn)”測(cè)序法——Sanger測(cè)序法測(cè)序結(jié)果作為對(duì)照，比對(duì)發(fā)現(xiàn)NGS測(cè)序技術(shù)與“金標(biāo)準(zhǔn)”測(cè)序法的測(cè)序結(jié)果完全相符，靈敏性、特異性、準(zhǔn)確性均為100％。

在HBV病毒的耐藥機(jī)制中DNA多聚酶扮演著極其重要的角色。HBV基因組正股（短鏈）在DNA多聚酶作用下延伸合成閉合環(huán)狀DNA（cccDNA），以此為模板在宿主肝細(xì)胞酶的作用下轉(zhuǎn)錄成復(fù)制中間體——前基因組RNA，再以此為模板在病毒RNA指導(dǎo)的DNA多聚酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）作用下逆轉(zhuǎn)錄成第一股子代DNA。在DNA多聚酶作用下以第一股子代DNA為模板合成第二股子代DNA。該雙股DNA部分環(huán)化，完成HBV基因組的復(fù)制。拉米夫定通過(guò)與HBV DNA多聚酶結(jié)構(gòu)域P區(qū)序列發(fā)生特異性結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)抑制酶活性，從而有效抑制HBV DNA的復(fù)制［9］。在長(zhǎng)期服用拉米夫定過(guò)程中，患者容易產(chǎn)生耐受，主要是DNA多聚酶P基因區(qū)的酪氨酸?甲硫氨酸?天門冬氨酸?天門冬氨酸（YMDD）序列發(fā)生變異［10］，甲硫氨酸（M）被纈氨酸（V）或異亮氨酸（I）替代，使人體對(duì)拉米夫定產(chǎn)生耐受，造成病情加重甚至死亡的嚴(yán)重后果［11?12］。

本次研究提示，YIDD和YVDD變異株的檢出率并不一致，YIDD變異株檢出率比YVDD變異株檢出率高，與方莉等［12］及鄭瑞英等［13］的結(jié)果相符，后續(xù)可設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證是否突變類型與治療方案相關(guān)。普冬等［14］提示，臨床上應(yīng)用拉米夫定治療的患者，YMDD變異株檢測(cè)率會(huì)隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)而增加。分析其原因，本研究認(rèn)為HBV位點(diǎn)突變情況及檢出情況提示HBV病毒群的演變符合達(dá)爾文進(jìn)化論的規(guī)律。部分位點(diǎn)的變異對(duì)其復(fù)制能力沒(méi)有顯著影響，部分位點(diǎn)的變異可能會(huì)使子代病毒的復(fù)制能力增強(qiáng)或降低。對(duì)于HBV病毒群，臨床上應(yīng)用拉米夫定對(duì)其有一個(gè)壓力選擇的影響，因此在臨床上體現(xiàn)為YMDD變異株檢出率的差別。研究后續(xù)或可深入探究驗(yàn)證其耐藥突變位點(diǎn)變異對(duì)病毒復(fù)制能力的影響。

由于YMDD變異直接影響臨床使用拉米夫定的療效和預(yù)后判定，因此，臨床上應(yīng)用拉米夫定的乙型肝炎患者檢測(cè)了解HBV耐藥基因變異情況，有利于及時(shí)調(diào)整制定治療方案，對(duì)改善乙肝患者病情和有效治療疾病有著相當(dāng)重要的意義。

本研究中對(duì)NGS檢測(cè)HBV耐藥基因YMDD突變的可行性進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)采用NGS測(cè)序技術(shù)可準(zhǔn)確檢測(cè)出HBV耐藥基因突變，對(duì)臨床中乙肝患者HBV耐藥基因檢測(cè)及用藥具有重要意義。但對(duì)于NGS測(cè)序技術(shù)檢測(cè)HBV耐藥基因突變所需樣本DNA用量及可檢出的最低突變頻率并沒(méi)有進(jìn)行深入研究，后續(xù)我們將對(duì)此進(jìn)行進(jìn)一步的探討，為臨床上乙肝耐藥基因的檢測(cè)提供參考依據(jù)。

［1］Science Daily，Université de Genève.Counterattack of the hepatitis B virus［EB/OL］.https：//www.science?daily.com/releases/2016/03/160316151110.htm，2016?03?16/2016?09?20.

［2］中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).2015年全國(guó)法定傳染病疫情概況［EB/OL］.http：//www. nhfpc.gov.cn/jkj/s3578/201602/b9217ba14e17452aad9e 45a5bcce6b65.shtml，2016?02?18/2016?09?20.

［3］許瑞元，王爾莉，曹霜，等.乙型肝炎病毒耐藥突變基因檢測(cè)在臨床中的應(yīng)用［J］.實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2014，32（2）：179?180.

［4］Locarnini S.Hepatitis B viral resistance，mechanism and diagnosis［J］.J Hepatol，2003，39：s124?s132.

［5］張欣欣，王銘杰.新一代測(cè)序技術(shù)在HBV變異研究中的應(yīng)用［J］.臨床肝膽病雜志，2015，31（4）：514?519.

［6］楊瑞峰，魏來(lái).乙型肝炎病毒耐藥變異及其檢測(cè)的臨床意義［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，33（7）：697?700.

［7］馬達(dá)，王惠民，邵可可.乳化液PCR的研究進(jìn)展及應(yīng)用［J］.臨床檢驗(yàn)雜志，2012，30（10）：857?860.

［8］Kabayashi S，Ide T，Sata M.Detection of YMDD morif in some Lamivudine?untreated asymptomatic hepatitis B virus carrier［J］.J Hepatol，2001，34（4）：584?586.

［9］Glinoer D.The importance of iodine nutrition during pregnancy［J］.Public Health Nutr，2007，10（12A）：1542?1546.

［10］Blumenthal N，Byth K，Eastman CJ.Iodine intaka and thyroid function in pregnant women in a private clinical practice in northwestern sydney before manda?tory fortification of bread with iodised salt［J］.J Thy?roid Res，2012，798（963）：1?6.

［11］Vermiglio F，Lo Presti VP，Moleti M，et al.Attention deficit and hyperactivity disorders in the offspring of mothers exposed to mild?moderate iodine deficiency；apossible novel iodine deficiency disorder in developed countries［J］.J Clin Endocrinal Metab，2004，89（12）：6054?6060.

［12］方莉，趙維皎，陳瑩，等.乙型肝炎病毒YMDD變異株的檢測(cè)及其臨床意義［J］.國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2015，36（15）：2197?2199.

［13］鄭瑞英，萬(wàn)謨彬，孝成忠，等.拉米夫定耐藥患者乙型肝炎病毒的基因突變［J］.中華傳染病雜志，2007，25（7）：412?415.

［14］普冬，吳芳華，劉紅偉.乙型肝炎患者YMDD變異的檢測(cè)及意義［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2008，5（24）：1506?1507.

Next generation Sequencing in study of drug?resistance genes and the clinical significance of hepatitis B virus

WANG Chuangjun1,WANG Qing1,CAO Zhijia1,YANG Xuexi2★
(1.Guangzhou Darui Biotechnology Co.，LTD.,Guangzhou,Guangdong,China,510665;2.Institute of Antibody Engineering,School of Laboratory Medicine and Biotechnology,Southern Medical University, Guangzhou,Guangdong,China,510515)

ObjectiveTo explore the feasibility of HBV resistance mutation detection by next generation sequencing(NGS)technology as well as to examine the correlation of the patient's gender with his or her YMDD mutation.Thus,it can provide a reference for clinical diagnostic agents.MethodsNGS technology was used in this study to detect the HBV YMDD mutation from 100 collected cases of clinical samples.These results were compared with the Sanger sequencing results,which is the gold standard for clinical detection.ResultsIn these 100 cases of HBV samples,88 cases of HBV YMDD wild type and 12 cases YMDD resistant mutation were detected.The sequencing results were the same as the Sanger sequencing results.ConclusionsThe results of this study showed NGS technology can be used to detect HBV resistance mutations.Furthermore,the patient's gender has no signifi cantcorrelation with the HBV resistance mutations.

NGS;HBV;Resistance gene mutations

廣州市健康醫(yī)療協(xié)同創(chuàng)新重大專項(xiàng)（201400000004?1）

1.廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司，廣東，廣州510665 2.南方醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)與生物技術(shù)學(xué)院抗體工程研究所，廣東，廣州510515

★通訊作者：楊學(xué)習(xí)，E?mail：yxxzb@sohu.com