肺癌患者EGFR及KRAS基因突變檢測(cè)方法的建立和臨床應(yīng)用

張潔明楊學(xué)習(xí)

·論著·

肺癌患者EGFR及KRAS基因突變檢測(cè)方法的建立和臨床應(yīng)用

張潔明1楊學(xué)習(xí)2★

目的本研究擬在評(píng)估二代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)在肺癌臨床分子診斷中應(yīng)用的可行性。方法本研究選取108例肺癌石蠟包埋樣本（formalin fixed paraffin embedded，F(xiàn)FPE），同時(shí)進(jìn)行一代測(cè)序（sanger sequencing）和NGS檢測(cè)樣本中EGFR和KRAS基因的突變情況。結(jié)果在108例肺癌樣本中，一代測(cè)序檢出突變?cè)诙鷾y(cè)序中均檢出，另外NGS還檢測(cè)出目標(biāo)區(qū)域外其他突變。結(jié)論NGS的檢測(cè)準(zhǔn)確性可達(dá)到100％。NGS可以應(yīng)用于肺癌臨床分子診斷，同時(shí)NGS能給臨床提供更詳細(xì)的基因突變信息，為分子靶向治療提供依據(jù)，更具有市場(chǎng)潛力及應(yīng)用前景。

二代測(cè)序；肺癌；EGFR；KRAS

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一［1?2］，同時(shí)其也是我國(guó)發(fā)病率及致死率最高的癌癥。近年來(lái)，分子靶向藥物因其特異、高效、副作用小的特點(diǎn)而得到了廣泛推廣和臨床應(yīng)用。但由于腫瘤異質(zhì)性產(chǎn)生藥物敏感性差異，在給予靶向治療前，需確認(rèn)特定靶點(diǎn)基因的狀態(tài)，從而評(píng)估每位患者對(duì)特定藥物的敏感性和毒副反應(yīng)的大小，有針對(duì)性地使用抗癌藥物［3］。

肺癌靶向藥物治療的相關(guān)基因包括EGFR和KRAS［4?5］，其突變狀態(tài)的檢查在臨床治療中的意義日益凸顯。目前常規(guī)分子病理檢測(cè)方法是采用實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）技術(shù)或一代測(cè)序技術(shù)。qPCR技術(shù)對(duì)單個(gè)基因已知突變進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，一代測(cè)序可以測(cè)定單個(gè)基因指定突變位點(diǎn)的附近序列（限于單個(gè)外顯子）。但以上方法僅限于已知突變，且通量低（一般一個(gè)反應(yīng)只能檢測(cè)一個(gè)突變或一個(gè)外顯子）、靈敏度低，難以檢出樣本中低豐度突變及未知突變。

第二代測(cè)序具有高通量、自動(dòng)化、低成本的特征，它能在很短的時(shí)間內(nèi)完成對(duì)上百億堿基的測(cè)序，滿(mǎn)足極短時(shí)間內(nèi)對(duì)基因組進(jìn)行高分辨率的檢測(cè)的要求［6］，它能夠一次檢測(cè)多個(gè)基因的多個(gè)突變熱點(diǎn)附近的序列，從而同時(shí)鑒別出已知和未知的突變類(lèi)型，節(jié)省腫瘤樣本DNA用量，檢測(cè)性?xún)r(jià)比高［7?8］。本研究采用Ion Torrent測(cè)序法測(cè)定肺癌患者石蠟包埋組織樣本EGFR和KRAS基因突變情況。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

QIAamp?DNA FFPE Tissue Kit購(gòu)自德國(guó)Qia?gen公司；Ion AmpliseqTMlibrary kit 2.0，Ion PI?Template OT2 Kit v3，Ion PITMHi?QTMSequencing 200 Kit均購(gòu)自美國(guó)Life Technology公司；Nuclease?Free Water購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司；無(wú)水乙醇（分析純）購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)；基因測(cè)序儀（DA8600）由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供；ABI 3500由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供。

1.2 研究對(duì)象

隨機(jī)選取2013年至2015年間寧波市第二醫(yī)院在病理學(xué)上確診為非小細(xì)胞肺癌的石蠟包埋組織樣本108例。男性患者58例，女性患者50例，年齡在35歲到88歲之間。研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理會(huì)審核批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書(shū)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取

使用QIAamp?DNA FFPE Tissue Kit提取石蠟包埋組織樣本DNA。通過(guò)脫蠟，溶解細(xì)胞，吸附DNA，除雜等步驟獲取DNA。

1.3.2 二代測(cè)序

二代測(cè)序有4個(gè)步驟，分別是基因組DNA提取，文庫(kù)構(gòu)建，上機(jī)測(cè)序和生物信息學(xué)分析，具體內(nèi)容見(jiàn)圖1。根據(jù)測(cè)序需要，使用Ion AmpliseqTMli? brary kit 2.0將提取的DNA構(gòu)建成文庫(kù)DNA。PCR特異性擴(kuò)增目的片段，在DNA片段兩端加上通用測(cè)序接頭，PCR擴(kuò)增文庫(kù)DNA，磁珠純化去除雜質(zhì)。建庫(kù)后使用核酸定量?jī)x測(cè)定文庫(kù)DNA的濃度。PI芯片一次上機(jī)測(cè)序能得到的數(shù)據(jù)在10 G左右，根據(jù)每個(gè)樣本測(cè)序數(shù)據(jù)需求量和測(cè)序深度確定混樣個(gè)數(shù)，混合樣本，再測(cè)定混樣后DNA濃度，稀釋到200 pmol/μL，取800 pmolDNA做模板制備。稀釋倍數(shù)公式如下。使用Ion PI?Template OT2 Kit v3制備測(cè)序模板。在PCR反應(yīng)體系中加入文庫(kù)DNA和模板載體，油包水PCR，富集測(cè)序模板去除雜質(zhì)及擴(kuò)增失敗的測(cè)序模板。使用Ion PITMHi?QTMSequencing 200 Kit在基因測(cè)序儀（DA8600）上測(cè)序。初始化測(cè)序儀，測(cè)序模板loading入測(cè)序芯片，上機(jī)測(cè)序。

稀釋倍數(shù)=Qubit濃度（ng/μL）×107/（200× 660×2）。

1.3.3 二代測(cè)序數(shù)據(jù)分析

圖1 二代測(cè)序流程圖Figure 1Progress of NGS

上機(jī)測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)Torrent source進(jìn)行后續(xù)信息分析。運(yùn)行Variant Caller和Coverage Analysis插件，得到樣本的分析結(jié)果。點(diǎn)擊“篩選”，在“檢測(cè)結(jié)果”選項(xiàng)中，篩選保留“雜合突變”和“純合突變”，當(dāng)“突變頻率”值≥5％時(shí)，檢測(cè)結(jié)果為相應(yīng)基因突變型別；“突變頻率”值＜5％時(shí)，檢測(cè)結(jié)果為相應(yīng)基因位點(diǎn)野生型。在“突變熱點(diǎn)”選項(xiàng)中顯示“Hotspot”的基因突變?yōu)槌Ｒ?jiàn)突變，其指示的COSMIC ID可以在COSM網(wǎng)站獲取相應(yīng)的基因突變信息；在“突變熱點(diǎn)”選項(xiàng)中顯示“Novel”的基因突變?yōu)楹币?jiàn)突變或新突變。Coverage Analysis可顯示“測(cè)序深度”及“覆蓋度”，評(píng)估測(cè)序質(zhì)量。按照上述方法，對(duì)收集的石蠟包埋組織樣本進(jìn)行EGFR和KRAS基因測(cè)序。

1.3.4 一代測(cè)序

108例FFPE樣本使用一代測(cè)序方法進(jìn)行檢測(cè)（本實(shí)驗(yàn)室自行檢測(cè)），結(jié)果作為對(duì)照。使用步驟1.3.1提取的DNA，進(jìn)行PCR對(duì)目的片段擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增效果，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物純化，測(cè)序反應(yīng)體系配置，測(cè)序反應(yīng)前擴(kuò)增，使用達(dá)瑞生物購(gòu)置的ABI 3500一代測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.3.5 一代測(cè)序數(shù)據(jù)分析

搜索待測(cè)突變區(qū)域前序列，比對(duì)基因序列，若同時(shí)具有突變堿基峰，則為雜合突變；若只出現(xiàn)野生堿基峰，則為野生型；若只出現(xiàn)突變堿基峰，則為純合突變。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序結(jié)果

本次研究收集108例肺癌組織樣本，二代測(cè)序結(jié)果顯示EGFR基因野生型87例，EGFR基因突變型共21例，其中L858R突變有15例，E746_A750delELREA突變有3例，L747?T751del、V769_D770insASV均只有1例，雙突變G719S及S768I有1例。KRAS基因突變情況，KRAS基因野生型75例，KRAS基因突變型共33例，其中Gly12Asp突變有15例，Gly12Cys突變有5例，Gly12Val突變有4例，Gly13Asp突變有4例，Gly12Ala突變有2例，Gly12Ser、Gly12Arg均有1例，雙突變Gly12Asp及Gly12Cys有1例。

針對(duì)EGFR第18～21號(hào)外顯子、KRAS第2號(hào)外顯子進(jìn)行一代測(cè)序。結(jié)果顯示EGFR基因野生型87例，EGFR基因突變型共21例，其中L858R突變有15例，E746_A750delELREA突變有3例，L747?T751del、V769_D770insASV均只有1例，雙突變G719S及S768I有1例。KRAS基因野生型75例，KRAS基因突變型共33例，其中Gly12Asp突變有15例，Gly12Cys突變有5例，Gly12Val突變有4例，Gly13Asp突變有4例，Gly12Ala突變有2例，Gly12Ser、Gly12Arg均有1例，雙突變Gly12Asp及Gly12Cys有1例。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，文章篇幅有限僅展現(xiàn)10例樣本。

2.22 種測(cè)序方法結(jié)果對(duì)比

比對(duì)一代測(cè)序結(jié)果，一代測(cè)序檢出突變二代測(cè)序均有檢出。EGFR基因檢測(cè)2種方法均為陽(yáng)性共21例，兩種方法均為陰性87例，一代測(cè)序陽(yáng)性二代測(cè)序陰性共0例，一代測(cè)序陰性二代測(cè)序陽(yáng)性共0例。靈敏性即二代測(cè)序檢出突變病例占對(duì)照組檢出突變病例的比例，又稱(chēng)真陽(yáng)性率。特異性指二代測(cè)序檢出無(wú)突變病例占對(duì)照組未檢出突變總數(shù)的比例，又稱(chēng)真陰性率。準(zhǔn)確性指真陽(yáng)性和真陰性占總樣本數(shù)的比例。二者檢測(cè)結(jié)果一致，靈敏性、特異性、準(zhǔn)確性均為100％。KRAS基因檢測(cè)兩種方法均為陽(yáng)性共33例，2種方法均為陰性75例，一代測(cè)序陽(yáng)性二代測(cè)序陰性共0例，一代測(cè)序陰性二代測(cè)序陽(yáng)性共0例。二者檢測(cè)結(jié)果一致，靈敏性、特異性、準(zhǔn)確性均為100％。

表1 測(cè)序檢測(cè)結(jié)果Table 1Sequencing results in detail

表2 二代測(cè)序檢測(cè)結(jié)果Table 2NGS results in detail

2.3 二代測(cè)序靈敏性

二代測(cè)序還檢測(cè)出其他突變，這些都是在一代測(cè)序檢測(cè)位點(diǎn)外或突變頻率較低的突變。表2為其中5例樣本的檢測(cè)結(jié)果。

3 討論

本次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)2個(gè)基因6個(gè)外顯子上的突變情況，其中EGFR基因第18～21號(hào)外顯子、KRAS基因第2、3號(hào)外顯子。實(shí)驗(yàn)中108例樣本二代測(cè)序結(jié)果與一代測(cè)序目標(biāo)檢測(cè)區(qū)域結(jié)果相符。另外，二代測(cè)序還檢測(cè)出樣本存在其他基因突變，如TP53、PTEN、CTNNB1、PIK3CA、BRAF。二代測(cè)序技術(shù)具有高通量的特點(diǎn)，能一次檢測(cè)多個(gè)基因的多個(gè)位點(diǎn)，節(jié)省樣本DNA用量，僅需少量樣本即可檢測(cè)大部分基因突變情況，減少采集樣本的難度及降低患者痛苦。一代測(cè)序可檢測(cè)單個(gè)基因突變位點(diǎn)附近的全部序列，但通量低（一般單個(gè)測(cè)序反應(yīng)只能檢測(cè)單個(gè)外顯子），只能對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行定性檢測(cè)而不能定量檢測(cè)，且其檢測(cè)靈敏度不及二代測(cè)序，難以檢出樣本中低豐度突變，當(dāng)某一外顯子存在多種突變時(shí)，一代測(cè)序的峰圖易受干擾，難以判斷突變類(lèi)型，所以一代測(cè)序難以將復(fù)雜突變樣本準(zhǔn)確檢出其突變型。二代測(cè)序可以節(jié)省大量檢測(cè)時(shí)間，特別是需要同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因的情況下，更快得到檢測(cè)結(jié)果，及時(shí)進(jìn)行治療。另外，二代測(cè)序還可以發(fā)現(xiàn)其他基因上的突變，可以為臨床醫(yī)生提供更多的信息，更利于治療藥物的選擇；還可以發(fā)現(xiàn)新的肺癌相關(guān)基因。二代測(cè)序與一代測(cè)序檢測(cè)結(jié)果高度一致，二代測(cè)序在檢測(cè)時(shí)間和檢測(cè)通量上比一代測(cè)序更有優(yōu)勢(shì)，更能滿(mǎn)足目前臨床檢測(cè)及科研實(shí)驗(yàn)的需求。

研究發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞腫瘤個(gè)體化用藥指導(dǎo)治療中，及時(shí)了解癌變組織基因突變狀態(tài)至關(guān)重要。根據(jù)自身情況使用相應(yīng)的治療藥物可以有效地控制病情的發(fā)展［9?10］。根據(jù)2014年美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）的《非小細(xì)胞肺癌臨床實(shí)踐指南（中國(guó)版）》，KRAS突變和EGFR?TKI內(nèi)源性耐藥有關(guān)，KRAS野生型患者建議接受EGFR?TKI治療［10］。目前化療藥物對(duì)癌癥細(xì)胞針對(duì)性弱，部分患者本身基因存在突變對(duì)藥物產(chǎn)生耐性，并且化療藥物副作用大，療程長(zhǎng)，治療效果不明顯。靶向治療藥物針對(duì)性強(qiáng)，副作用低，通過(guò)測(cè)序檢測(cè)患者基因突變狀態(tài)有利于醫(yī)生選擇治療藥物，及時(shí)控制病情，降低患者痛苦和負(fù)擔(dān)。本次檢測(cè)出EGFR突變型21例，KRAS野生型75例，這些患者對(duì)TKI敏感，建議使用吉非替尼、厄洛替尼、尼洛替尼等藥物治療?；驒z測(cè)可以及時(shí)了解患者基因突變情況，為臨床用藥提供指導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)個(gè)性化用藥。本次檢測(cè)僅針對(duì)肺癌相關(guān)基因EG?FR和KRAS，但二代測(cè)序可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因，如NRAS、BRAF、TP53等。NRAS突變存在于造血系統(tǒng)的惡性腫瘤［11］，在急性粒細(xì)胞白血病及骨髓異常增生綜合征中NRAS突變率為25％。BRAF突變存在于結(jié)直腸癌和黑色素瘤［12］。KRAS突變也發(fā)生在胰腺癌和結(jié)直腸癌中［13?14］。大部分甲狀腺癌存在3種癌基因（KRAS、HRAS、NRAS）的突變［15］。TP53突變存在于多種癌癥當(dāng)中。癌癥發(fā)生并不局限于單個(gè)基因，而某個(gè)基因突變也可能存在于多種癌癥［16］。二代測(cè)序不局限于肺癌臨床檢測(cè)，也可以應(yīng)用于其他癌癥當(dāng)中，二代測(cè)序具有強(qiáng)大的發(fā)展?jié)摿褪袌?chǎng)前景。

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A new method of gene mutation status detection onEGFRandKRASof lung cancer patients and the assessment of clinical application

ZHANG Jieming1，YANG Xuexi2★
（1.Guangzhou Darui Biotechnology Co.，LTD.，Guangzhou，Guangdong，China，510665；2.Institute of Antibody Engineering，School of Laboratory Medicine and Biotechnology，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510515）

ObjectiveThe feasibility of application of next generation sequencing(NGS) technology in clinical molecular diagnosis of lung cancer was evaluated in this study.MethodsIn this study,the variants of the EGFR and KRAS genes from 108 paraffin?embedded tissues of lung cancer were detected by both Sanger sequencing and NGS.The variants detected by Sanger sequencing were as also detected by NGS.ResultsIn 108 cases,NGS detected all the mutations which sanger sequencing detected. In addition,NGS also detected other gene mutation status that Sanger sequencing missed.ConclusionThe detection accuracy of NGS could reach 100％.NGS could be used in clinical diagnosis of lung cancer,and NGS can provide more detailed gene mutation information for clinical diagnosis,which provides the basis for molecular targeted therapy.Moreover NGS also has the market potential and application prospects.

Next generation sequencing；Lung cancer；EGFR；KRAS

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目應(yīng)用型專(zhuān)項(xiàng)資金（2015B020233009）

1.廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司，廣東，廣州510665 2.南方醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)與生物技術(shù)學(xué)院抗體工程研究所，廣東，廣州510515

★通訊作者：楊學(xué)習(xí)，E?mail：yxxzb@sohu.com