長(zhǎng)期食用黃豆對(duì)小鼠腸道微生物的影響研究

劉余，肖新云，唐標(biāo)，鞏一丁,尹抗抗*（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208）

長(zhǎng)期食用黃豆對(duì)小鼠腸道微生物的影響研究

劉余，肖新云，唐標(biāo)，鞏一丁,尹抗抗*（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208）

目的探究長(zhǎng)期食用黃豆對(duì)小鼠腸道微生物的影響，為日常膳食營(yíng)養(yǎng)提供依據(jù)。方法先將小鼠按照年齡分為1月齡（幼年）、6月齡（中年）、9月齡（老年）組，每組再按照隨機(jī)數(shù)字表分為對(duì)照組、1∶1組、1∶2組和1∶4組，對(duì)照組給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，1∶1組、1∶2組和1∶4組分別將基礎(chǔ)飼料與黃豆按1∶1、1∶2和1∶4關(guān)系配比進(jìn)行飼養(yǎng)。喂養(yǎng)4個(gè)月后，采集小鼠盲腸段內(nèi)容物進(jìn)行微生物分析。結(jié)果1月齡小鼠食用不同比例的黃豆后，與對(duì)照組比較，腸道細(xì)菌總數(shù)、乳酸菌數(shù)、雙歧桿菌數(shù)和大腸桿菌數(shù)均下降明顯（P＜0.01）；6月齡小鼠1∶2組的腸道細(xì)菌總數(shù)、乳酸菌數(shù)、雙岐桿菌數(shù)和大腸桿菌數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其余各組（P＜0.01）；9月齡小鼠食用不同比例的黃豆后，腸道細(xì)菌總數(shù)下降，且食用較高比例的黃豆，腸道乳酸菌數(shù)、雙岐桿菌數(shù)和大腸桿菌數(shù)與對(duì)照組比較，下降明顯(P＜0.01或P＜0.05)。結(jié)論不同年齡段食用不同比例黃豆對(duì)腸道微生物的影響不同，6月齡食用1∶2黃豆最佳。

黃豆；腸道微生物；乳酸菌；雙歧桿菌；大腸桿菌；細(xì)菌總數(shù)

本文引用：劉余，肖新云，唐標(biāo)，鞏一丁,尹抗抗.長(zhǎng)期食用黃豆對(duì)小鼠腸道微生物的影響研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（1）：26-28.

近年來(lái)，隨著腸道微生物研究的深入，越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為腸道微生物是人體的“第二大腦”，其作為“重要的微生物器官”與人體生理功能、健康和疾病密切相關(guān)[1]。有研究報(bào)道，諸如腸易激綜合征（IBS）、肥胖、糖尿病等危害較大的常見(jiàn)疾病都與腸道菌群失調(diào)有關(guān)[2-4]。腸道微生物是膳食與人體健康的橋梁，與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝息息相關(guān)。飲食是影響腸道菌群組成和代謝的重要因素之一，更是最容易控制或改變的因素。飲食中大量營(yíng)養(yǎng)成分的類(lèi)型、數(shù)量及平衡狀態(tài)會(huì)影響腸道微生物的組成和數(shù)量，同樣，微生物會(huì)影響食物消化效率，并根據(jù)膳食底物產(chǎn)生特定的代謝產(chǎn)物，從而影響其他微生物及宿主健康[5]。

黃豆（Glycine max），享有“豆中之王”的美稱。黃豆富含多種營(yíng)養(yǎng)素，具有提高免疫力、美白護(hù)膚、降低血脂、降低血壓等多種保健功效，是日常膳食中常見(jiàn)的食物[6]。本實(shí)驗(yàn)研究長(zhǎng)期食用黃豆對(duì)腸道微生物的影響，以SPF級(jí)KM小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)設(shè)計(jì)不同年齡組的小鼠以及不同比例的黃豆，旨在為日常合理膳食提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物SPF級(jí)KM小鼠72只，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)于湖南斯萊克斯動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：SCXK（湘）2013-0004。

1.1.2 飼料及屏蔽環(huán)境實(shí)驗(yàn)設(shè)施由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（湘）2013-0005。

1.1.3 培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB）、BBL瓊脂培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基均由長(zhǎng)沙麗欣生物技術(shù)有限公司提供，培養(yǎng)基的配制參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。

1.1.4 主要儀器設(shè)備HH·BII·500-S電熱恒溫培養(yǎng)箱（購(gòu)于上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），SHZ-82氣浴恒溫振蕩器（購(gòu)于常州國(guó)華電器有限公司），手提式壓力蒸氣滅菌器XY-280（購(gòu)于合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與干預(yù)方法將小鼠年齡不同分為1月齡組（幼年組），6月齡組（中年組），9月齡組（老年組）三大組，每大組24只。每大組內(nèi)再隨機(jī)分為4個(gè)小組，分別是對(duì)照組：予以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)；1∶1組：予以基礎(chǔ)飼料與黃豆比例為1∶1飼料喂養(yǎng)；1∶2組：予以基礎(chǔ)飼料與黃豆比例為1∶2飼料喂養(yǎng)；1∶4組：予以基礎(chǔ)飼料與黃豆比例為1∶4飼料喂養(yǎng)。每小組6只，雌雄各半。喂養(yǎng)4月，常規(guī)自由飲水飲食。

1.2.2 小鼠腸道內(nèi)容物的提取各組小鼠喂養(yǎng)4個(gè)月后，頸椎脫臼處死后至于超凈工作臺(tái)，無(wú)菌采集各組小鼠盲腸段內(nèi)容物，將同一組別小鼠內(nèi)容物收集一起置于無(wú)菌離心管中。

1.2.3 腸道微生物數(shù)量的測(cè)定[8]無(wú)菌操作稱取一定量的腸道內(nèi)容物放入裝有玻璃珠的無(wú)菌三角瓶中，搖床120 r/min振搖30 min使微生物充分分散，選擇合適的稀釋度，采用涂抹平板計(jì)數(shù)法，好氧細(xì)菌、大腸桿菌在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)；乳酸菌、雙歧桿菌在37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。每一個(gè)稀釋度做3次重復(fù)，求出平均值并計(jì)算每克腸道內(nèi)容物所含的菌數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 大豆和基礎(chǔ)飼料配比對(duì)1月齡小鼠腸道微生物的影響

1月齡小鼠通過(guò)喂食不同比例的黃豆后與對(duì)照組比較，腸道乳酸菌數(shù)、細(xì)菌總數(shù)、雙岐桿菌數(shù)和大腸桿菌數(shù)均存在不同程度的降低（P＜0.01）。其中1:4組的乳酸菌數(shù)和雙岐桿菌數(shù)含量最低，提示食用黃豆比例越高，反而不利于腸道益生菌的生長(zhǎng)。見(jiàn)表1。

表1 1月齡小鼠腸道微生物測(cè)定（±s，n=6，×107CFU/g）

表1 1月齡小鼠腸道微生物測(cè)定（±s，n=6，×107CFU/g）

注:與對(duì)照組比較**P＜0.01;與1∶1組比較#P＜0.05;與1∶2組比較△△P＜0.01，△P＜0.05。

組別對(duì)照組1∶1組1∶2組1∶4組F值P值乳酸菌1.89±0.22 0.39±0.05** 0.61±0.02** 0.13±0.02** 71.341 0.000細(xì)菌總數(shù)1.65±0.49 0.27±0.04** 0.10±0.03**#△0.36±0.07**#△△14.947 0.001雙歧桿菌1.54±0.14 0.27±0.04** 0.24±0.032** 0.10±0.02**#△23.968 0.000大腸桿菌24.21±7.57 3.19±0.93** 5.42±0.48** 3.94±0.20** 6.422 0.016

2.2 大豆和基礎(chǔ)飼料配比對(duì)6月齡小鼠腸道微生物的影響

與對(duì)照組比較，給予1∶1和1∶4比例的黃豆飼養(yǎng)后，腸道乳酸菌數(shù)、細(xì)菌總數(shù)、雙歧桿菌數(shù)和大腸桿菌數(shù)均下降明顯（P＜0.01）。1∶2比例的黃豆飼養(yǎng)后，腸道乳酸菌數(shù)、細(xì)菌總數(shù)、雙岐桿菌數(shù)和大腸桿菌數(shù)均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其余各組，提示1∶2比例的基礎(chǔ)飼料與黃豆比例進(jìn)行小鼠飼養(yǎng)，有利于提高小鼠腸道微生物的豐度。見(jiàn)表2。

表2 6月齡小鼠腸道微生物測(cè)定（±s，n=6，×106CFU/g）

表2 6月齡小鼠腸道微生物測(cè)定（±s，n=6，×106CFU/g）

注:與對(duì)照組比較**P＜0.01;與1∶1組比較##P＜0.01;與1∶2組比較△△P＜0.01。

組別對(duì)照組1∶1組1∶2組1∶4組F值P值乳酸菌1.82±0.32 0.50±0.24** 53.12±0.67**##0.07±0.03**△△540.266 0.000細(xì)菌總數(shù)7.48±0.24 1.72±0.14** 8.92±0.67**##2.11±0.10**△△372.153 0.000雙歧桿菌2.31±0.63 0.31±0.30** 10.86±0.67**##0.45±0.18**△△4.095 0.049大腸桿菌8.46±0.32 1.47±0.14** 39.94±1.78**##1.51±0.52**△△11.413 0.003

2.3 大豆和基礎(chǔ)飼料配比對(duì)9月齡小鼠腸道微生物的影響

1∶1組小鼠細(xì)菌總數(shù)和大腸桿菌數(shù)與對(duì)照組比較顯著下降（P＜0.01或P＜0.05），而雙岐桿菌數(shù)顯著增加（P＜0.01），1∶2組小鼠腸道乳酸菌數(shù)、細(xì)菌總數(shù)和大腸桿菌數(shù)與對(duì)照組比較均顯著下降（P＜0.01或P＜0.05）。食用1∶4比例的黃豆后，小鼠腸道雙岐桿菌數(shù)和大腸桿菌數(shù)最低，提示腸道優(yōu)勢(shì)菌群數(shù)量顯著減少。見(jiàn)表3。

表3 9月齡小鼠腸道微生物測(cè)定（±s，n=6，×105CFU/g）

表3 9月齡小鼠腸道微生物測(cè)定（±s，n=6，×105CFU/g）

注:與對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01;與1∶1組比較#P＜0.05，##P＜0.01;與1∶2組比較△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別對(duì)照組1∶1組1∶2組1∶4組F值P值乳酸菌6.98±1.86 9.62±1.52 3.32±1.52*##5.50±0.86##25.548 0.00細(xì)菌總數(shù)27.91±2.51 8.62±1.52** 4.31±2.07** 5.73±1.13**##△△91.538 0.000雙歧桿菌5.37±0.93 16.58±2.50** 6.30±1.52##1.37±0.24*##△△51.464 0.000大腸桿菌17.17±2.46 11.61±3.04* 6.63±1.52**#1.79±0.24**##△9.860 0.005

3 討論

腸道是人體重要的消化吸收?qǐng)鏊?，也是重要的免疫器官，同時(shí)其較為適宜的酸堿條件和營(yíng)養(yǎng)底物為微生物的棲息提供了良好的環(huán)境。越來(lái)越多的研究表明，食物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值受宿主腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，但同時(shí)食物也會(huì)影響腸道微生物的種類(lèi)、數(shù)量及其代謝活動(dòng)的變化。目前，膳食糖類(lèi)、膳食脂肪、膳食蛋白質(zhì)這三大營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)于腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響研究較多。Zhang等[9]對(duì)大鼠飼喂不同脂肪含量的飼料發(fā)現(xiàn)大鼠腸道微生物結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著性變化，相對(duì)于正常組飼養(yǎng)，高脂飲食降低了雙歧桿菌和擬桿菌的數(shù)量，增加了厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)的數(shù)量。Lubbs等[10]研究發(fā)現(xiàn)高蛋白飲食會(huì)增加腸道中大腸桿菌和梭菌的數(shù)量。無(wú)論是低糖還是高糖飲食，均會(huì)影響腸道微生物結(jié)構(gòu)，高纖維飲食會(huì)增加腸道中的雙岐桿菌的數(shù)量，而低纖維飲食會(huì)增加普氏菌屬的數(shù)量[11]。

腸道微生物大體分為三類(lèi)：有益菌、有害菌和兼性菌。乳酸菌和雙歧桿菌是主體有益菌，其在人體免疫、營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)、發(fā)育、抗感染、防腫瘤及延緩衰老等過(guò)程中均發(fā)揮著重要作用。大腸桿菌屬兼性菌，在健康人體內(nèi)不產(chǎn)生副作用，但在疾病、營(yíng)養(yǎng)不良或因服用抗生素破壞了腸道菌群平衡的機(jī)體內(nèi)，將會(huì)對(duì)人體造成疾病[12]。黃豆含豐富的蛋白質(zhì)，具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和調(diào)節(jié)糖代謝等功能。

小鼠的壽命約1.5～2年，一般來(lái)說(shuō)，小鼠體成熟時(shí)間為2月齡，相當(dāng)于人的18歲左右，小鼠壽命約2年相當(dāng)于人70歲左右。本實(shí)驗(yàn)為探究長(zhǎng)期食用黃豆對(duì)腸道微生物的影響，以SPF級(jí)KM小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，選取了幼年（1月齡）、中年（6月齡）、老年（9月齡）3個(gè)年齡段和1∶1、1∶2、1∶4黃豆比例兩種處理因素，以倡導(dǎo)可培養(yǎng)微生物為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，旨在探究不同年齡段、不同比例黃豆對(duì)小鼠的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)1月齡小鼠食用不同比例的黃豆后，腸道乳酸菌數(shù)、細(xì)菌總數(shù)、大腸桿菌數(shù)和雙岐桿菌數(shù)均出現(xiàn)不同程度的下降（P＜0.01），其中1∶4組的乳酸菌數(shù)和雙岐桿菌數(shù)最低，提示食用高比例的黃豆后，幼齡小鼠腸道益生菌數(shù)目減少。6月齡小鼠正處于中年時(shí)期，食用不同比例的黃豆后發(fā)現(xiàn)1∶2組小鼠的腸道細(xì)菌總數(shù)、乳酸菌數(shù)、大腸桿菌數(shù)和雙岐桿菌數(shù)明顯增加，說(shuō)明食用1∶2黃豆有助于提高小鼠腸道微生物的豐度，完善腸道微生態(tài)環(huán)境。9月齡小鼠食用較高比例黃豆后，腸道細(xì)菌總數(shù)、雙岐桿菌數(shù)和大腸桿菌數(shù)下降明顯，說(shuō)明腸道優(yōu)勢(shì)菌在數(shù)量上降低。

中醫(yī)認(rèn)為，黃豆性甘、入脾、歸大腸經(jīng)，有助于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[13]。研究長(zhǎng)期食用黃豆對(duì)腸道微生物的影響，有助于從微生態(tài)機(jī)理研究探究中醫(yī)理論的療效機(jī)制。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，黃豆的健脾功效可能與通過(guò)調(diào)整腸道微生態(tài)環(huán)境，影響食物的分解轉(zhuǎn)化和吸收，補(bǔ)益脾之后天之本有關(guān)，但具體的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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（本文編輯 楊瑛）

Effect of Long-Term Consumption of Soybean on the Intestinal Microbiota of Mice

LIU Yu，XIAO Xinyun，TANG Biao，GONG Yiding，YIN Kangkang*
（Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China）

ObjectiveTo explore the impact of long-term consumption of soybean on the intestinal microbial,and to provide a basis for the daily diet.MethodsThe mice were divided into three groups of 1 month old(infancy),6 months old(middle aged)and 9 months old(old age)according to the age,and each group was randomly divided into control group,1:1 group, 1∶2 group and 1∶4 group.The control group was fed a standard diet,1∶1,1∶2 and 1∶4 group were fed by 1∶1,1∶2 and 1∶4 ratio of basic feed and soybean,respectively.After feeding for 4 months,the content of the microorganism in cecum was collected and analyzed.Results After feeding different proportion of soybean in 1 month old mice,the total number of bacteria,Lactobacillus,Bifidobacterium and E.coli decreased significantly(P＜0.01);In 6 months old mice,the number of intestinal bacteria,Lactobacillus,Bifidobacterium and E.coli of 1∶2 group was far higher than that of the other groups;After eating different proportions of soybeans of 9 months old mice,the total number of intestinal bacteria decreased,and with the higher proportion of soybean,the number of Lactobacillus,Bifidobacterium and E.coli decreased significantly(P＜0.01,P＜0.05).Conclusion The effects of different proportions of soybean on the intestinal microflora was different in different age groups,the proportion of 1∶2 soybean is the best in 6 months old mice.

soybean;intestinal microflora;Lactobacillus;Bifidobacterium;Escherichia coli;total number of bacteria

R285.5；R153

A

2016-06-02

湖南省教育廳項(xiàng)目基金（13C678）,2013年湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目基金。

劉余，女，助教，博士，研究方向：中醫(yī)治則與治法研究。

*尹抗抗，男，實(shí)驗(yàn)師，E-mail:yinkk_001@163.com。