桃紅四物湯對大鼠創(chuàng)傷性股骨頭缺血壞死模型外周血中EPCs表達(dá)影響

朱耀，孫紹裘*，李益亮，胡昌凱，黃菁菁

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南長沙410007）

桃紅四物湯對大鼠創(chuàng)傷性股骨頭缺血壞死模型外周血中EPCs表達(dá)影響

朱耀1，孫紹裘2*，李益亮2，胡昌凱2，黃菁菁2

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南長沙410007）

目的通過檢測桃紅四物湯對創(chuàng)傷性股骨頭缺血壞死模型外周血中血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)表達(dá)的影響，探討桃紅四物湯治療創(chuàng)傷性股骨頭缺血壞死的具體作用機制。方法將60只實驗大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為兩組，正常對照組15只，造模組45只，造模組按照圓韌帶離斷結(jié)合剝離切除術(shù)造模，造模4周后，兩組各隨機抽取5只，對比檢測造模是否成功，再將造模組隨機分成4組，即桃紅四物湯低、中、高劑量組及模型組，每組10只，桃紅四物湯低、中、高劑量分別灌服4、8、16 g/kg桃紅四物湯湯劑，余下二組灌服等容量的生理鹽水，藥物干預(yù)8周后對股骨頭大體形態(tài)觀察、組織形態(tài)學(xué)觀察、空骨陷窩率檢測，并用流式細(xì)胞儀檢測大鼠外周血中EPCs（CD34+、CD133+）水平。結(jié)果桃紅四物湯三組灌胃8周后空骨陷窩率明顯低于模型組，高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;桃紅四物湯三組灌胃8周后外周血中EPCs（CD34+、CD133+）表達(dá)量明顯高于模型組，低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論桃紅四物湯能明顯促進(jìn)創(chuàng)傷性股骨頭壞死大鼠模型外周血中EPCs（CD34+、CD133+）的表達(dá)，進(jìn)一步從微觀上及分子水平說明其對創(chuàng)傷性股骨頭壞死有防治作用。

創(chuàng)傷性股骨頭壞死；血管內(nèi)皮祖細(xì)胞；桃紅四物湯

本文引用：朱耀，孫紹裘，李益亮，胡昌凱，黃菁菁.桃紅四物湯對大鼠創(chuàng)傷性股骨頭缺血壞死模型外周血中EPCs表達(dá)影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，37（1）：22-25.

創(chuàng)傷性股骨頭壞死主要是由于股骨頸骨折、髖臼骨折、髖關(guān)節(jié)脫位等外傷性疾患所致，引起供應(yīng)股骨頭血運受阻，股骨頭隨著血運減少而出現(xiàn)骨壞死甚至塌陷的病理表現(xiàn)，是一種以髖關(guān)節(jié)疼痛功能障礙為主要癥狀的致殘性疾患。桃紅四物湯為中醫(yī)活血化瘀經(jīng)典方，經(jīng)臨床上應(yīng)用治療創(chuàng)傷性股骨頭壞死有確切療效，但對其具體機制尚未明確。有研究表明[1]，血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)有助于血管新生，并利于新骨生成。因此，本課題采用流式細(xì)胞儀、組織形態(tài)學(xué)等技術(shù)觀察桃紅四物湯對創(chuàng)傷性股骨頭壞死模型外周血中EPCs水平的影響，為其促進(jìn)血管新生提供理論基礎(chǔ)，進(jìn)一步闡明其活血化瘀之功效。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物健康SD大鼠60只，6個月齡，雌性各半，體質(zhì)量250～300 g/只，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗室供給。

1.1.2 藥物桃紅四物湯參考吳謙《醫(yī)宗金鑒》桃紅四物湯的配比：生地黃20 g，當(dāng)歸20 g，赤芍20 g，川芎10 g，桃仁20 g，紅花10 g。中藥材均按《藥典》所載地道藥材的指定主產(chǎn)地由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科一次購進(jìn)，由煎藥房待煎，水煎劑制成含生藥1 g/mL的湯劑，并封包處理。

1.1.3 主要試劑與儀器乙二胺四乙酸（EDTA）試劑來源天津市化學(xué)試劑一廠；CD133、CD34抗體購自Biolegend公司；流式細(xì)胞儀型號（BD FACSCalibur）；OLYMPUS CH-30型光學(xué)顯微鏡來源于日本OLYMPUS公司；15、50mL離心管、無菌膠頭滴管來源于美國NUNC公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模將60只實驗大鼠，適應(yīng)性喂

養(yǎng)1周后隨機分為兩組，正常對照組15只，造模組45只，按上述方法造模4周后，兩組各隨機抽取5只，對比檢測造模是否成功，再將造模組隨機分成4組，即桃紅四物湯低劑量組、桃紅四物湯中劑量組、桃紅四物湯高劑量組、模型組，每組10只。造模組參照Norman等方法[2]進(jìn)行造模，術(shù)后3天內(nèi)每天給予大鼠肌肉注射青霉素4萬單位預(yù)防感染。

1.2.2 干預(yù)方法造模4周后，二組各隨機抽取5只，進(jìn)行標(biāo)本大體形態(tài)及組織病理學(xué)觀察，檢測造模是否成功，正常對照組大鼠股骨頭均可見外觀無變形塌陷，股骨頭軟骨表面潤滑有光澤，造模組大鼠股骨頭可見關(guān)節(jié)軟骨表面色澤較正常對照組略暗，部分出現(xiàn)股骨頭塌陷變形，將造模組隨機分成4組，即分成桃紅四物湯低劑量組、桃紅四物湯中劑量組、桃紅四物湯高劑量組、模型組，每組10只，待大鼠情況較穩(wěn)定時開始藥物干預(yù)。根據(jù)人與動物體表面積換算公式（賀石林，王鍵，王凈凈.中醫(yī)科研設(shè)計與統(tǒng)計學(xué).湖南科學(xué)技術(shù)出版社,2008：48.）D鼠=D人×R鼠/R人（D為給藥劑量，R為動物與人體表面積比值系數(shù)）計算桃紅四物湯給藥劑量，桃紅四物湯低、中、高組大鼠分別灌服4、8、16 mL/kg桃紅四物湯湯劑（即如500 g SD大鼠分別灌服2、4、8 g桃紅四物湯低中高劑量湯劑），每天2次，余下二組灌服等量的生理鹽水，同樣每天2次。自然喂養(yǎng)。1.3觀察指標(biāo)及檢測方法

1.3.1 大體觀察組織形態(tài)學(xué)觀察及空骨陷窩率檢測同樣采用造模時入路，顯露右側(cè)股骨頭并脫位，并游離股骨粗隆周圍及股骨遠(yuǎn)端肌肉組織，最后予以股骨中段截斷，對股骨頭形態(tài)輪廓、色澤和關(guān)節(jié)表面軟骨情況進(jìn)行觀察。取一側(cè)的股骨頭入10%福爾馬林溶液中固定1周,再以5%硝酸脫鈣系列酒精脫水常規(guī)石蠟包埋切片HE染色于光鏡下觀察,且每張切片在高倍鏡下觀察，并從中任選5個區(qū)域，且每個區(qū)域內(nèi)計數(shù)為50個骨陷窩，計算出每個區(qū)域內(nèi)的空骨陷窩數(shù)，依照此公式（空骨陷窩率=空骨陷窩數(shù)/50×100%）分別計算出5個區(qū)域的空骨陷窩率，并求出平均值，即為此樣本的空骨陷窩率。

1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測外周血中EPCs的數(shù)量（1）取大鼠眼眶外周血血液；（2）密度梯度離心法分離血液，得到單個核細(xì)胞懸液；（3）流式細(xì)胞儀鑒定EPCs：按上述操作分離血液樣本，得到單個核細(xì)胞，每管100 μL PBS重懸細(xì)胞，各加入2 μL APCCD34和2 μL PE-CD133抗體，置于37℃的環(huán)境中，避光孵育15 min，予以含0.5%BSA-PBS 3mL液體洗滌單個核細(xì)胞，室溫、350 g離心5 min，棄上清。用0.3 mL 0.1%多聚甲醛重懸，避光、4℃保存，待流式細(xì)胞儀分析到200 000個細(xì)胞時停止，并計算出CD34+、CD133+細(xì)胞所占其中的比例，比例數(shù)值即為外周血中EPCs數(shù)量[3]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，四組間空骨陷窩率及EPCs數(shù)量屬于完全隨機設(shè)計資料，若數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性、方差齊性時，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法；若數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)性、方差齊性時，可采用近似檢驗，如，Dunnett’s T3檢驗，P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 大體形態(tài)觀察

灌胃8周后采取股骨頭標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)正常對照組大鼠股骨頭外形無變形塌陷，關(guān)節(jié)軟骨表面潤滑有光澤，模型組大鼠股骨頭嚴(yán)重變形塌陷，關(guān)節(jié)軟骨表面色暗，失去光澤，且面積較大，骨質(zhì)較脆，桃紅四物湯組大鼠股骨頭關(guān)節(jié)軟骨表面部分出現(xiàn)色暗無光澤，壞死面積較模型組小，外觀無明顯變形塌陷。

2.2 組織形態(tài)學(xué)觀察及空骨陷窩率與EPCs數(shù)量檢測

正常對照組股骨頭關(guān)節(jié)軟骨下骨小梁排列緊密規(guī)則，骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核較大，可見少數(shù)空骨陷窩。骨髓細(xì)胞豐富，且結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，脂肪細(xì)胞較少，可見密集在骨小梁下的成骨細(xì)胞；模型組：股骨頭關(guān)節(jié)軟骨層較薄，骨小梁變細(xì)、疏松，排列紊亂，部分有斷裂現(xiàn)象，且大部分出現(xiàn)骨細(xì)胞壞死，空骨陷窩明顯增多，骨髓腔被脂肪組織所填充，脂肪細(xì)胞較多；桃紅四物湯低、中、高三組骨小梁結(jié)構(gòu)較完整，排列疏松且較紊亂，脂肪細(xì)胞增多，空骨陷窩較多，周圍可見散在的成骨細(xì)胞，出現(xiàn)較多骨髓造血細(xì)胞，骨小梁表面可見少量新骨形成，見圖1。與模型組相比，桃紅四物湯組灌胃8周后的空骨陷窩率均明顯降低，EPCs增高（P＜0.05），桃紅四物湯三組灌胃8周后兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

圖1 灌胃后8周各組股骨頭組織形態(tài)學(xué)觀察（HE×200）

表1 各組大鼠灌胃8周后空骨陷窩率、外周血中EPCs（CD34+、CD133+）數(shù)量比較（±s，n=10,%）

表1 各組大鼠灌胃8周后空骨陷窩率、外周血中EPCs（CD34+、CD133+）數(shù)量比較（±s，n=10,%）

注：與正常對照組組內(nèi)比較，▲P＜0.05，與模型組組內(nèi)比較，●P＜0.05；與低劑量組組內(nèi)比較，▽P＜0.05；與中劑量組組內(nèi)比較，◇P＜0.05。

組別劑量(g/kg）空骨陷窩率EPCs數(shù)量正常對照組-10.67±2.68●▽◇93.87±8.16●▽◇模型組-47.34±3.52▲▽◇21.58±6.17▲▽◇低劑量組434.87±3.14▲●◇36.87±1.93▲●◇中劑量組826.88±7.45▲●▽47.17±8.49▲●▽高劑量組1619.63±5.48▲●▽◇59.63±5.48▲●▽◇F值17.45912.342

3 討論

EPCs,即血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，是一種來源于骨髓，具有分化成成熟內(nèi)皮細(xì)胞能力的干細(xì)胞，參與出生后血管發(fā)生，維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)定和血管損傷的修復(fù)[4-5]。“血管學(xué)說”在創(chuàng)傷性骰骨頭壞死的病理生理機制起著主導(dǎo)作用[6]，且在動物實驗?zāi)Ｐ椭?，有研究[7]顯示增加局部毛細(xì)血管密度能有效改善早起股骨頭缺血性壞死。馮勇等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷性骰骨頭壞死患者的循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)目相比健康者比較明顯下降，功能上也顯著降低，發(fā)現(xiàn)ANFH患者外周血內(nèi)的EPCs易于凋亡，說明了局部EPCs的功能失常有可能是股骨頭缺血壞死發(fā)病的重要因素以及治療的核心。

本實驗造模成功后，經(jīng)桃紅四物湯灌胃8周后，大體觀察發(fā)現(xiàn)正常對照組大鼠股骨頭外形無變形塌陷，關(guān)節(jié)軟骨表面潤滑有光澤，模型組大鼠股骨頭嚴(yán)重變形塌陷，關(guān)節(jié)軟骨表面色暗，失去光澤，且面積較大，骨質(zhì)較脆，桃紅四物湯組大鼠股骨頭關(guān)節(jié)軟骨表面部分出現(xiàn)色暗無光澤，壞死面積較模型組小，外觀無明顯變形塌陷。灌胃8周后桃紅四物湯低、中、高組與模型組比較，空骨陷窩率明顯降低，且隨著藥物濃度的增加，空骨陷窩率逐漸降低，灌胃8周后桃紅四物湯三組、模型組與正常對照組比較，空骨陷窩率明顯增高，這也進(jìn)一步說明了本實驗大鼠創(chuàng)傷性股骨頭壞死造模成功。灌胃8周后桃紅四物湯低、中、高三組與模型組比較，外周血中EPCs（CD34+、CD133+）數(shù)量明顯增加，且隨著藥物濃度的增加，EPCs的表達(dá)量逐漸增加，灌胃8周后桃紅四物湯三組、模型組與正常對照組比較，外周血中EPCs（CD34+、CD133+）數(shù)量明顯減少。這說明桃紅四物湯能增加大鼠外周血EPCs數(shù)量，有利于創(chuàng)傷性股骨頭壞死血管損傷的修復(fù)，為桃紅四物湯治療創(chuàng)傷性股骨頭缺血性壞死提供理論依據(jù)，同時說明桃紅四物湯對股骨頭壞死具有一定的防治效果，為中醫(yī)藥防治股骨頭壞死提供新的藥物靶點。

[1]Lee DY，CHo TJ，Kim JA.Mobilization of endothelial progenitor cells in fracture healing and distraction osteogenesis[J].Bone，2008,42(5):932-41.

[2]Norman D,Reis D,Zinman C,et al.Vascular deprivation induced necrosis of the fem-oral head of therat.An experimental model of avascular osteonecrosis in the skeletally immatur individual or Legg-Perthes disease[J].Int J Exp Pathol,1998, 79(3):173-181.

[3]Hristov M,Weber C.Endotheial progenitor cells in vascular repair and remodeling[J].Pharmacol Res,2008,58(2):148-51.

[4]Asahara T,Murohara T,Sullivan A,et al.Isolation of putative progenitorendothelialcellsforangiogene-sis[J].Science，1997,275:964-967.

[5]Miller-Kasprzak E,Jagodzinski PP.Endothelial progenitor cells as a new agent con-tributing to vascular repair[J].Arch Immunol Ther Exp(Warsz)，2007,55(4):247-259.

[6]Kerachian MA，Harvey EJ，Cournoyer D，et al.Avascular necrosis of the femoral head:vascular hypotheses，Endothelium，2006，13(4):237-44.

[7]Wu X,Yang S,Duan D,et al.A combination of granulocyte colony-stimulating factor and stem cell factor ameliorates steroid associated osteonecrosis in rabbits，J Rheumatol，2008，35(11): 2241-2248.

[8]馮勇,楊述華,肖寶鈞,等.股骨頭壞死與循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)目和功能關(guān)系的研究[C].武漢：全國骨關(guān)節(jié)與風(fēng)濕病暨第三屆武漢國際骨科高峰論壇論文匯編,2012:321-322.

（本文編輯 楊瑛）

Effects of Taohong Siwu Decoction on the Expression of EPCs in Peripheral Blood of Trauma-Induced Osteonecrosis of Femoral Head Rat Models

ZHU Yao1,SUN Shaoqiu2*,LI Yiliang2,HU Changkai2,HUANG Jingjing2
(1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;2.The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China)

ObjectiveThe endothelial progenitor cells(EPCs)expression in peripheral blood of trauma-induced osteonecrosis of femoral head rat models was determined,and to explore the specific mechanism of Taohong Siwu Decoction in the treatment of traumatic avascular necrosis of the femoral head.MethodsThe 60 rats,after 1 weeks of feeding,were randomly divided into two groups,normal control group(n=15),model group(n=45).The model group was built according with the round ligament broken with the dissection of the model,after 4 weeks of modeling,5 rats in each group were randomly selected,compared to test the success of modeling then,the rats were randomly divided into 4 groups,namely Taohongsiwu Decoction low dose group,middle dose group,high dose group,model group,10 rats in each group.Taohongsiwu Decoction low,medium and high dose groups were gavaged with 4,8,16 g/kg Taohongsiwu Decoction,the other two groups were given the same amount of normal saline.After 8 weeks of drug intervention,the femoral head morphology,morphology,bone lacuna rate were detected,and the peripheral blood EPCs(CD34+,CD133+)level was detected by flow cytometry.ResultsAfter 8weeksofTaohongSiwuDecoctiongroupgavage,theemptybonelacunaratewassignificantlylowerthanthatin the model group,higher than that in the normal control group,the difference is statistically significant(P＜0.05).The peripheral blood EPCs(CD34+and CD133+)expression amount was significantly higher than that of model group,which was lower than that of normal control group,the difference was statistically significant(P＜0.05).ConclusionTaohong Siwu Decoction can obviously promote the expression of CD34+and CD133+in peripheral blood endothelial progenitor cells of trauma-induced osteonecrosis of femoral head rat models,which further describe its prevention and treatment for traumatic avascular necrosis of the femoral head from the microscopic and molecular level.

traumatic femoral head necrosis;endothelial progenitor cells;Taohong Siwu Decoction

R285.5;R683

A

2016-06-02

國家自然科學(xué)基金（81373658）；湖南省教育廳課題（14C0867）。

朱耀，男，碩士，主要從事中醫(yī)骨傷實驗與臨床研究。

*孫紹裘，男，主任醫(yī)師，E-mail：54sunshaoqiu@163.com。