外周血AREG基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌的相關(guān)性及其臨床意義*

吳肖，王愛(ài)軍，王紅鈺，徐晉珩，鄭寶軍，程健，張超，施華，馮俊偉

（河北省唐山市工人醫(yī)院1.腫瘤外科，2.病理科，河北唐山063000）

臨床論著

外周血AREG基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌的相關(guān)性及其臨床意義*

吳肖1，王愛(ài)軍1，王紅鈺1，徐晉珩2，鄭寶軍1，程健1，張超1，施華1，馮俊偉1

（河北省唐山市工人醫(yī)院1.腫瘤外科，2.病理科，河北唐山063000）

目的探討外周血中雙向調(diào)節(jié)蛋白（AREG）基因rs2291715位點(diǎn)多態(tài)性與結(jié)直腸癌的相關(guān)性及其意義。方法選取2012年1月-2015年12月在該院治療的400例結(jié)直腸癌患者作為病例組，同期進(jìn)行健康體檢的健康者400例作為對(duì)照組。檢測(cè)病例組與對(duì)照組外周血中AREG、CEA、CA50、CA242水平。應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增聯(lián)合DNA直接測(cè)序法，檢測(cè)兩組外周血中AREG基因rs2291715位點(diǎn)的基因分布情況，按不同基因型將病例組和對(duì)照組進(jìn)行分組，并觀察按基因型分組后不同基因型外周血中AREG水平的變化。Logistic回歸分析AREG基因rs2291715位點(diǎn)多態(tài)性與結(jié)直腸癌的相關(guān)性。結(jié)果病例組中血清AREG、CEA、CA50、CA242水平高于對(duì)照組（P＜0.05）。AREG基因rs2291715位點(diǎn)存在C和G 2種等位基因，共發(fā)現(xiàn)3種基因型：GG（突變純合子）、CG（突變雜合子）、CC（野生型）。病例組中CG、GG基因型頻率及G等位基因均高于對(duì)照組（P＜0.05）。Logistic回歸分析顯示，GG基因型及G等位基因與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是結(jié)直腸癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[＾OR=8.936（95％CI：1.539，48.246）P=0.009]。結(jié)論AREG基因rs2291715位點(diǎn)多態(tài)性與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

結(jié)直腸癌；雙向調(diào)節(jié)蛋白；基因多態(tài)性；外周血

結(jié)直腸癌的發(fā)生原因主要與生活方式、飲食結(jié)構(gòu)、飲食習(xí)慣、遺傳因素等有關(guān)，生活水平高、食物精細(xì)、油炸類食品攝入過(guò)多、纖維素?cái)z入少、過(guò)量飲酒、運(yùn)動(dòng)量不足等是結(jié)直腸癌發(fā)病率高的原因[1-2]，其另一重要原因還是遺傳因素，陽(yáng)性家族史人群是結(jié)直腸癌的高危人群[3]。大多數(shù)結(jié)直腸癌患者早期無(wú)癥狀或癥狀不明顯，僅有腹部不適感、消化不良、大便少量帶血或里急后重等，常被誤認(rèn)為腸道功能紊亂，確診時(shí)多為中、晚期，許多患者就診時(shí)已出現(xiàn)肝臟或其他部位轉(zhuǎn)移，錯(cuò)過(guò)了最佳治療時(shí)間。因此，通過(guò)基因分析尋找可以預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的臨床指標(biāo)有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

雙向調(diào)節(jié)蛋白（amphiregulin，AREG）是腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞釋放的一種外泌蛋白，屬于表皮生長(zhǎng)因子家族中的一員，具有酪氨酸激酶活性，與惡性腫瘤的局部增殖擴(kuò)張、周圍侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等有關(guān)。有研究證實(shí)，AREG在多種惡性腫瘤中表達(dá)明顯增高[4-7]，但該基因突變與結(jié)直腸癌之間關(guān)系的報(bào)道較少。本研究通過(guò)檢測(cè)結(jié)直腸癌患者AREG在外周血中的濃度及其單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)在結(jié)直腸癌和健康人群中的分布差異，以及AREG濃度隨SNP位點(diǎn)的變化情況；同時(shí)檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）、糖類抗原50（carbohydrate antigen 50，CA50）、CA242的水平。探討AREG在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的意義，為正確評(píng)估結(jié)直腸癌患者的病情提供客觀依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年1月-2015年12月于河北省唐山市工人醫(yī)院就診的結(jié)直腸癌患者400例作為病例組，所有患者經(jīng)術(shù)前活檢及術(shù)后病理學(xué)檢查明確診斷為結(jié)直腸癌。選取同期來(lái)本院進(jìn)行體檢的健康人作為對(duì)照組（400例）。兩組人員性別、年齡匹配。病例組男性257例，女性143例；年齡（22～70歲），平均（56.4±12.1）歲；對(duì)照組男性250例，女性150例；年齡（23～70歲），平均（55.7±11.9）歲。本研究由醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集所有研究對(duì)象于空腹過(guò)夜晨起抽取靜脈血6 ml。2 ml置于乙二胺四乙酸二鉀（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-K2）抗凝管中，顛倒混勻，置入-80℃冷凍保存?zhèn)溆茫? ml置于生化促凝管中，室溫血液自然凝固10～20 min，3 000 r/min，離心15 min分離血清。收集上清液，提出的血清-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）血清AREG水平人AREG ELISA試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，進(jìn)口分裝（批號(hào)：E-EL-H0237c）。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，依次加入生物素化的抗人AREG抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素，形成免疫復(fù)合物，加入顯色底物，在辣根過(guò)氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍(lán)色，加終止液后變成黃色。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)光密度（optical density，OD）值，AREG濃度與OD450值呈正比，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中AREG的濃度。試劑盒檢測(cè)范圍31.25～2 000.00 pg/ml，18.75 pg/ml時(shí)敏感性最高，板內(nèi)、板間變異系數(shù)均＜10％。

1.2.3 腫瘤標(biāo)志物血清CEA、CA50、CA242水平的測(cè)定采用電化學(xué)發(fā)光法（美國(guó)雅培公司i2000化學(xué)發(fā)光儀）測(cè)定腫瘤標(biāo)志物CEA、CA50、CA242水平。

1.2.4 基因組DNA的提取EDTA-K2抗凝血復(fù)融后，充分混勻，取300μl進(jìn)行檢測(cè)。應(yīng)用血液基因組DNA提取試劑盒Wizard Genomic DNA Purification kit（批號(hào)：D1192-01，美國(guó)Promega公司），采用離心柱法提取各樣本基因組DNA。

1.2.5 擴(kuò)增目的基因AREG基因rs2291715 SNP位點(diǎn)引物序列，正向引物：5'-GAGAATAAGCTTAAAA CACACC-3'，反向引物：5'-AATTTGTAAGTTATGTCA TA-3'。建立總體積為25μl的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain realtion，PCR）反應(yīng)體系，包括正反向引物（25μmol/L）各1μl、4種脫氧核糖核苷三磷酸混合物（dNTP 2 mmol/L）5μl，10×擴(kuò)增緩沖液[500 mmol/L KCl，100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.4，20℃），150 mmol/L MgCl2，1 mg/ml明膠]2.5μl，模板DNA 1 μl，Taq DNA聚合酶（5 u/μl）1μl，加ddH2O至終體積為25μl。PCR循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性10 min，94℃變性30 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸5 min。經(jīng)2％瓊脂糖電泳鑒定PCR產(chǎn)物并與Marker（日本TaKaRa公司，150 bp）進(jìn)行比較，判斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的準(zhǔn)確性。

1.2.6 AREG基因rs2291715 SNP位點(diǎn)的核苷酸序列分析應(yīng)用DNA直接測(cè)序技術(shù)檢測(cè)病例組和對(duì)照組人群外周血AREG基因rs2291715 SNP位點(diǎn)的等位基因分布。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)一步純化，應(yīng)用Beckman Coulter GeXP遺傳分析系統(tǒng)（美國(guó)Beckman公司）進(jìn)行雙向測(cè)序，得出SNP位點(diǎn)周圍的堿基序列圖。應(yīng)用DNAMAN軟件將測(cè)定結(jié)果與Gen-Bank查詢確定的AREG基因序列進(jìn)行比對(duì)，比較測(cè)序結(jié)果與基因庫(kù)中公布的基因序列之間的基因序列的差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率表示，用χ2檢驗(yàn)。應(yīng)用Logistic回歸分析AREG基因rs2291715多態(tài)位點(diǎn)與結(jié)直腸癌間的相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清AREG、CEA、CA50、CA242水平比較

病例組與對(duì)照組的血清AREG、CEA、CA50、CA242水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），病例組血清AREG、CEA、CA50、CA242水平高于對(duì)照組。見(jiàn)表1。

2.2 AREG基因rs2291715 SNP位點(diǎn)直接測(cè)序結(jié)果

PCR產(chǎn)物純化后雙向測(cè)序結(jié)果顯示，AREG基因rs2291715 SNP位點(diǎn)存在2種等位基因C和G，共有3種基因型：GG（突變純合子）、CG（突變雜合子）、CC（野生型）。見(jiàn)附圖。

表1 兩組血清AREG水平比較（n=400，x±s）

附圖AREG基因rs2291715 SNP位點(diǎn)基因序列圖

表2 兩組AREG基因rs2291715 SNP位點(diǎn)多態(tài)性基因型和等位基因頻率分布比較[n=400，例（％）]

2.3 兩組AREG基因rs2291715 SNP位點(diǎn)多態(tài)性基因型和等位基因頻率分布比較

病例組與對(duì)照組GG、CG基因型頻率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），病例組GG、CG基因型頻率均高于對(duì)照組。病例組與對(duì)照組G等位基因頻率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），病例組G等位基因頻率高于對(duì)照組。見(jiàn)表2。

2.4 兩組AREG基因rs2291715 SNP位點(diǎn)不同基因型血清AREG水平的比較

病例組和對(duì)照組按GG、CG、CC基因型進(jìn)一步分組后，病例組中GG、CG基因型AREG水平與CC基因型比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.252、7.067，P=0.000），病例組GG、CG基因型AREG水平均高于CC基因型，而GG基因型AREG水平又高于CG基因型（t=14.381，P=0.000）。對(duì)照組中GG、CG基因型AREG水平與CC基因型比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.423、9.658，P=0.000），GG、CG基因型AREG水平均高于CC基因型，而GG基因型AREG水平亦高于CG基因型（t=11.955，P=0.000）。見(jiàn)表3。

2.5 Logistic回歸分析AREG基因rs2291715 SNP位點(diǎn)與結(jié)直腸癌間的相關(guān)性

以有無(wú)患結(jié)直腸癌（無(wú)=0，有=1）為因變量，以年齡、性別、CEA、CA242、CA50、AREG基因rs2291715 SNP位點(diǎn)基因型[CC（0，0），CG（0，1），GG（1，0）]為自變量，進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，GG基因型與結(jié)直腸癌關(guān)系密切，AREG基因rs2291715 SNP位點(diǎn)GG基因型是結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[＾OR=8.936（95％CI：1.539，48.246），P=0.009]。見(jiàn)表4。

表3 病例組與對(duì)照組AREG基因rs2291715 SNP位點(diǎn)不同基因型血清AREG水平的比較

表4 Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

結(jié)直腸癌是臨床常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，該病的發(fā)生率隨著生活水平的提高不斷上升，對(duì)人民健康造成嚴(yán)重危害[8]。結(jié)直腸癌早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療會(huì)很好地改善預(yù)后。因此，找到一種敏感性高、特異性強(qiáng)、便于監(jiān)測(cè)的指標(biāo)用于結(jié)直腸癌的診斷治療十分重要。AREG是一種促癌因子，研究顯示，AREG具有促癌作用，與腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4-7]。AREG具有兩方面的作用，一方面促進(jìn)機(jī)體多種細(xì)胞的生長(zhǎng)分化、代謝更新，另一方面可以抑制機(jī)體細(xì)胞尤其包括腫瘤細(xì)胞的增殖。AREG通過(guò)介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞之間，以及腫瘤細(xì)胞與周圍組織細(xì)胞的相互作用，激活多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，幫助腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)免疫逃避，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，加快腫瘤的生長(zhǎng)[9-10]。有研究證實(shí)，AREG在多種人類惡性腫瘤中高表達(dá)，尤其是在發(fā)生局部侵襲或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的腫瘤中表達(dá)明顯增強(qiáng)。在本研究中，筆者檢測(cè)結(jié)直腸癌患者外周血中AREG的水平，發(fā)現(xiàn)病例組血清AREG水平高于對(duì)照組，這與上述研究結(jié)果一致。

AREG是表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）家族的成員之一，位于4號(hào)染色體長(zhǎng)臂1區(qū)3帶3亞帶，其相對(duì)分子質(zhì)量為9 912 bp，共6個(gè)外顯子，8個(gè)內(nèi)含子，經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯、剪切形成252個(gè)氨基酸的mRNA，屬于跨膜糖蛋白的一種[11]。AREG在惡性腫瘤中的異常表達(dá)與其基因位點(diǎn)突變密切相關(guān)。本研究涉及的AREG基因rs2291715是第4外顯子上的SNPs位點(diǎn)，該位點(diǎn)存在C和G 2種等位基因，野生型為CC基因型。當(dāng)?shù)? 301位堿基由C突變?yōu)镚，導(dǎo)致第177位氨基酸由TTC（苯丙氨酸，F(xiàn)）突變?yōu)門TG（亮氨酸，L）。目前有關(guān)AREG基因的rs2291715位點(diǎn)多態(tài)性與結(jié)直腸癌關(guān)系的報(bào)道還很少見(jiàn)。

本研究采用DNA直接測(cè)序法檢測(cè)病例組和對(duì)照組的目的基因組DNA，結(jié)果顯示，病例組AREG基因GG、CG基因型頻率和G等位基因頻率均高于對(duì)照組，提示AREG基因rs2291715 SNPs位點(diǎn)突變與結(jié)直腸癌有關(guān)，是結(jié)直腸癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)將病例組和對(duì)照組患者根據(jù)rs2291715 SNPs位點(diǎn)不同的基因型進(jìn)行分組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是病例組還是對(duì)照組，GG基因型和CG基因型患者血清中AREG的水平高于CC基因型，GG基因型患者血清中AREG的水平高于CG基因型，由此可見(jiàn)，G等位基因與AREG的表達(dá)密切相關(guān)。推測(cè)G等位基因突變，促進(jìn)AREG蛋白水平的高表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

為進(jìn)一步觀察AREG基因rs2291715 SNPs位點(diǎn)突變的影響，本研究還檢測(cè)與結(jié)直腸癌關(guān)系密切的腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)病例組的腫瘤標(biāo)志物水平高于對(duì)照組。Logistic回歸分析結(jié)果顯示，GG基因型是結(jié)直腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要危險(xiǎn)因素，進(jìn)一步證實(shí)AREG基因rs2291715 SNPs位點(diǎn)多態(tài)性與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

綜上所述，AREG基因rs2291715 SNPs位點(diǎn)多態(tài)性與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，推測(cè)該基因位點(diǎn)突變通過(guò)促進(jìn)AREG在機(jī)體內(nèi)異常高表達(dá)，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。因此，加強(qiáng)對(duì)AREG基因rs2291715 SNPs位點(diǎn)多態(tài)性的檢測(cè)有助于幫助臨床醫(yī)師早期發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌，早期診斷，早期治療，更好地掌握患者腫瘤進(jìn)展的狀況，把握手術(shù)時(shí)機(jī)，提高患者的生存率，爭(zhēng)取改善患者的總體預(yù)后。

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（童穎丹 編輯）

Correlation of polymorphism of amphiregulin gene in peripheral blood with colorectal cancer and significance*

Xiao Wu1,Ai-jun Wang1,Hong-yu Wang1,Jin-heng Xu2,Bao-jun Zheng1, Jian Cheng1,Chao Zhang1,Hua Shi1,Jun-wei Feng1
(1.Department of Surgical Oncology,2.Department of Pathology, Tangshan Gongren Hospital,Tangshan,Hebei 063000,China)

ObjectiveTo investigate the relationship of rs2291715 locus polymorphism of amphiregulin (AREG)gene in peripheral blood with colorectal cancers and its significance.MethodsIn this study,400 colorectal cancer patients treated in our department from Jan.2012 to Dec.2015 were recruited as case group,and 400 healthy people who

health examination during the same period were enrolled as control group.Levels of AREG,CEA,CA50 and CA242 in peripheral blood of both groups were separately detected.Then PCR amplification combined with DNA direct sequencing was applied to test rs2291715 locus polymorphism of AREG gene in peripheral blood.Based on different genotypes,both groups were classified and observed for the change of AREG level in peripheral blood.Logistic regression analysis was used to evaluate the relationship between rs2291715 polymorphism of AREG gene and colorectal cancer.ResultsSerum levels of AREG,CEA,CA50 and CA242 in the case group were higher than those in the control group(P＜0.05).There were 2 kinds of allelic genes C and G in the rs2291715 locus of AREG gene,and 3 kinds ofgenotypes GG,CG and CC were discovered.The frequency of GG and CG genotypes and allelic gene G in the case group was higher than that in the control group(P＜0.05).Logistic regression analysis showed that GG genotype and allelic gene G were closely related to the development of colorectal cancer and were the independent risk factors for colorectal cancer[OR＾=8.936(95％CI:1.539,48.246),P=0.009].ConclusionsPolymorphism of AREG gene rs2291715 locus is closely related to carcinogenesis and progression of colorectal cancer.

colorectal cancer;amphiregulin gene;gene polymorphism;peripheral blood

R735.3

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.01.010

1005-8982（2017）01-0050-05

2016-04-22

河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目（No：16277702D）

王愛(ài)軍，E-mail：wajts@126.com；Tel：0315-3722178