Bax介導(dǎo)硼替佐米誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞株MKN45凋亡作用的研究*

趙羲和，李凱，鄒華偉

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院第一腫瘤科，遼寧沈陽110022）

論著

Bax介導(dǎo)硼替佐米誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞株MKN45凋亡作用的研究*

趙羲和，李凱，鄒華偉

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院第一腫瘤科，遼寧沈陽110022）

目的驗證BCl-2相關(guān)X（Bax）蛋白在硼替佐米（BTZ）誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞株MKN45的凋亡作用。方法以人Bax（NC_000019.10）為靶標(biāo)設(shè)計shRNA序列，將Bax shRNA轉(zhuǎn)染至MKN45細(xì)胞中，G418篩選耐藥克隆。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)和Western blot測定轉(zhuǎn)染前后Bax mRNA和蛋白含量。給予空載體對照MKN45及shBax轉(zhuǎn)染的MKN45細(xì)胞BTZ梯度加藥（5、25、50、100、250、500和1 000 nmol/L），檢測其細(xì)胞增殖、凋亡程度。結(jié)果通過轉(zhuǎn)染，建立Bax表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)的MKN45-shBax細(xì)胞系。給予BTZ梯度加藥后，陰性對照（Mock）組胃癌細(xì)胞MKN45 Bax含量增加，凋亡程度逐漸增加，增殖率逐漸降低。沉默Bax后BTZ誘導(dǎo)的MKN45細(xì)胞凋亡受到抑制，增殖能力增強。結(jié)論Bax能部分介導(dǎo)BTZ對胃癌細(xì)胞株MKN45的凋亡作用。

胃癌；硼替佐米；BCl-2相關(guān)X；凋亡

胃低分化腺癌的惡性程度相對較高，發(fā)現(xiàn)時通常已處于中、晚期，且發(fā)病迅速，預(yù)后較差，因此胃低分化腺癌的治療相對困難。早期胃低分化腺癌的治療以手術(shù)切除為主，中、晚期胃低分化腺癌大多已經(jīng)發(fā)生擴散轉(zhuǎn)移，且對化療不敏感[1]。因此，尋找其治療靶點，增加化療敏感性，延長患者生存期，改善生活質(zhì)量迫在眉睫。目前，手術(shù)聯(lián)合化療及淋巴結(jié)引流區(qū)照射是胃癌治療的主要標(biāo)準(zhǔn)。盡管如此，患者預(yù)后差，生存期仍然難以得到明顯改善。因此，尋找胃癌治療的新靶點成為當(dāng)務(wù)之急[2]。

目前，胃癌藥物治療主要集中于化療藥物、靶向分子及病毒載體。針對化療藥物增敏、尋求藥物治療效果的最大化研究也逐漸深入。硼替佐米（Bortezomib，BTZ），商品名萬珂（Valcade），是高選擇性的可逆性的蛋白酶體抑制劑，臨床上主要用于血液系統(tǒng)腫瘤的治療，近年來，對于一些實體瘤的實驗也進(jìn)入臨床前期實驗階段。目前，硼替佐米在細(xì)胞及動物實驗中可對胃癌起到化療增敏作用[3]。研究硼替佐米的抑制腫瘤機制，可以有助于更深入地研究，提高胃癌放化療效果，改善患者的生存時間及生存質(zhì)量。

1 材料方法

1.1 材料與試劑

人MKN45胃癌細(xì)胞購自上海研究院生命科學(xué)細(xì)胞資源中心，載體構(gòu)建與質(zhì)粒合成（shBax）由蘇州吉瑪公司完成，硼替佐米購自美國Millennium制藥公司，Annexin V-PE/7-AAD凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司，一抗兔單克隆BCl-2相關(guān)X（BCL2 associated X，Bax）購自英國Abcam公司。

1.2 儀器與設(shè)備

聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置（美國Bio-Rad Inc公司），轉(zhuǎn)印儀（北京市六一儀器廠），流式細(xì)胞儀（美國BD公司），酶標(biāo)儀（美國Thermofisher公司）。

1.3 攝影方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MKN45細(xì)胞用含10％新鮮胎牛血清的高糖培養(yǎng)液[達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM）]培養(yǎng)，培養(yǎng)孵箱調(diào)試至37℃、5％二氧化碳CO2、飽和濕度。培養(yǎng)2～3 d后細(xì)胞匯合度達(dá)70％～90％時胰酶消化傳代。構(gòu)建pGFP-V-RS載體（蘇州吉瑪公司），將Bax shRNA嵌入載體合成質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染MKN45細(xì)胞系。不含目的基因序列的空載體做為陰性對照（Mock）組使用。轉(zhuǎn)染過程：MKN45細(xì)胞在24孔板中呈單層貼壁生長。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期，匯合度達(dá)50％～70％時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染使用質(zhì)粒、Opti-MEMⅠ及Lipofectamine 3000試劑（美國Invitrogen公司），超凈工作臺操作。配制轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體混合物：Opti-MEMⅠ25μl+Lipofectamine 3 000 1μl超凈工作臺孵育5 min。與此同時Opti-MEMⅠ25μl+p3000 1μl（Lipofectamine 3000試劑中自帶）+質(zhì)粒1μg超凈臺孵育5 min。將上述兩者混勻后再次孵育5 min，加入24孔板細(xì)胞中，孵箱繼續(xù)培養(yǎng)。穩(wěn)定表達(dá)Bax（-）的細(xì)胞系通過加入0.4 mg/ml G418（美國Sigma-Aldrich公司）抗生素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，不斷增加G418的濃度，經(jīng)過3～4周后得到G418抗性克隆。轉(zhuǎn)染效率通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quanti tative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）來評價。

1.3.2 硼替佐米給藥方法為探討硼替佐米能否誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡，抑制增殖，本研究給與未轉(zhuǎn)染組梯度濃度的硼替佐米，加入無菌二甲亞砜（dimethyl Sulfoxide，DMSO）于超凈臺溶解至10～20 mol/L，置入-20℃冰箱冷凍保存，使用前無菌去離子水溶解至工作濃度。梯度給藥，濃度分別為25、50、100、250、50和1000nmol/L。摸索給藥后檢測時間點，給藥后48h為細(xì)胞增殖差異最明顯時間點。

1.3.3 細(xì)胞增殖實驗?zāi)[瘤細(xì)胞的增殖失控是其惡性程度的最重要表現(xiàn)。為明確Bax是否參與硼替佐米對MKN45細(xì)胞活力的影響，本研究給予未轉(zhuǎn)染組、Mock組及shBax組250nmol/L硼替佐米，檢測細(xì)胞活力。實驗使用四唑鹽比色法（methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide，MTT）進(jìn)行。用含10％新鮮胎牛血清的高糖培養(yǎng)基吹打細(xì)胞，以3000個/孔的密度接種于96孔板培養(yǎng)，空白對照為不含細(xì)胞的等體積10％DMEM培養(yǎng)基，每組設(shè)3個副孔。培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基，每孔加入MTT溶液（5 mg/ml，pH=7.4）20μl，孵箱培養(yǎng)4 h。棄掉上清培養(yǎng)液，每孔加150μl DMSO，脫色搖床震蕩10 min。于酶標(biāo)儀上檢測各個孔490 nm處的吸光度值。細(xì)胞生長的增殖率（％）=（實驗組均值-空白組均值）/（陰性對照組均值-空白組均值）×100％。抑制率=1-增殖率。

1.3.4 細(xì)胞凋亡檢測為明確Bax是否參與硼替佐米誘導(dǎo)的MKN45細(xì)胞凋亡，本研究給予未轉(zhuǎn)染組、Mock組及shBax組250 nmol/L硼替佐米后，檢測細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡檢測使用Annexin V-PE/7-AAD凋亡檢測試劑盒。細(xì)胞用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液清洗2次，不含乙二胺四乙酸（edetate，EDTA）的胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，避光染色15 min，流式細(xì)胞儀上機檢測。凋亡比例分析運用BD Accuri C6軟件進(jìn)行。

1.3.5 Western blot檢測細(xì)胞3 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，加入含苯甲基磺酰氟（phenyl-methanesulfonyl fluoride，PMSF）的裂解液搖床冰上裂解30 min，細(xì)胞超聲機械裂解細(xì)胞提蛋白樣?？偟鞍琢?0μg的蛋白樣于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）凝膠中電泳，4℃轉(zhuǎn)膜，一抗與含有蛋白條帶的聚偏二氟乙烯膜4℃孵育過夜。一抗兔單克隆Bax（1∶100）、鼠單克隆甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（1∶1 000）。二抗室溫孵育2 h，增強化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）發(fā)光系統(tǒng)發(fā)光。使用Fluor Chem 2.0軟件計算蛋白含量，以積分灰度值（integrated density value，IDV）表示。所有的實驗均重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用Graph Pad Prism version 5.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較用方差分析，若方差齊，則兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 硼替佐米對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用

為檢測硼替佐米對于MKN45細(xì)胞的抑制作用，結(jié)果顯示，硼替佐米能抑制細(xì)胞增殖，存在劑量依賴性。當(dāng)硼替佐米劑量達(dá)到250nmol/L時，MKN45抑制率上升趨于緩和，500 nmol/L時曲線趨于平穩(wěn)。

經(jīng)過G418壓力篩選后，Western blot檢測結(jié)果，顯示shBax組Bax蛋白表達(dá)為痕跡量，幾乎難以檢測出。3組Bax相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=119.225，P=0.000），shBax細(xì)胞株Bax相對表達(dá)量約為（0.24±0.03），與Mock組比較，約為其含量的24％，經(jīng)LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t= 4.931，P=0.029），提示shBax組Bax含量降低。實驗結(jié)果顯示，shBax穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株建立成功。shBax組細(xì)胞活力檢測OD值為（0.498±0.04），Mock組OD值為（0.213±0.03），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.752，P=0.008），shBax組細(xì)胞活力升高。見圖1。

2.2 硼替佐米與Bax表達(dá)含量的關(guān)系

為明確給予硼替佐米時Bax的含量變化，本研究采用Western blot檢測。給與梯度濃度硼替佐米后48 h，Western blot檢測Bax的蛋白含量隨之上升（見圖2）。硼替佐米500nmol/L時Bax相對表達(dá)量為（0.54±0.04）上升趨于緩和，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=39.135，P=0.001）。給予MKN45細(xì)胞50℃水浴1 min，室溫放置30 min后檢測Bax表達(dá)明顯上升，為陽性對照；單純給予MKN45細(xì)胞DMSO時檢測Bax含量，無明顯上升，為陰性對照。

2.3 Bax與硼替佐米凋亡誘導(dǎo)作用的關(guān)系

圖1 硼替佐米及Bax對胃癌MKN45細(xì)胞增殖的影響

圖2 硼替佐米對于未轉(zhuǎn)染MKN45細(xì)胞的Bax蛋白表達(dá)影響

硼替佐米能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。隨著硼替佐米濃度的增加，MKN45細(xì)胞凋亡率逐漸上升。當(dāng)硼替佐米劑量達(dá)250 nmol/L時，MKN45凋亡率上升趨于緩和，500 nmol/L時凋亡率趨于平穩(wěn)，與細(xì)胞活力受抑制的趨勢相符。見圖3A、B。

圖3 硼替佐米和Bax對胃癌MKN45細(xì)胞凋亡的影響

shBax組凋亡率為（22.6±3.1）％，與Mock組細(xì)胞凋亡率[（44.3±2.9）％]比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.977，P=0.000），shBax組細(xì)胞凋亡率降低。見圖3C、D。

3 討論

近年來，胃癌的生物學(xué)和遺傳學(xué)的認(rèn)識有很大進(jìn)展，但目前胃癌的治療仍是困擾人類的難題。惡性胃癌的標(biāo)準(zhǔn)治療模式為綜合治療，即術(shù)后盡早行鉑類和氟尿嘧啶為基礎(chǔ)的輔助化療，對于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性者可選擇性淋巴引流區(qū)照射[4-5]。盡管如此，惡性胃癌患者預(yù)后很差，Ⅳ期患者5年生存率約為4％[6]。因此，尋找有效的途徑，抑制細(xì)胞對藥物或射線的抵抗成為目前研究的熱點。泛素-蛋白酶體通路（ubiquitin-proteasome pathway，UPP）是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)選擇性降解的重要途徑，對基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞周期、氧化應(yīng)激等多種細(xì)胞活動進(jìn)行干預(yù)。同時其對DNA損傷藥物作用腫瘤細(xì)胞的增敏效應(yīng)也被發(fā)現(xiàn)與研究，包括對在不同腫瘤模型中電離輻射的增敏效應(yīng)。硼替佐米是高選擇性的，可逆性的蛋白酶體抑制劑，廣泛應(yīng)用于血液病中聯(lián)合化療使用[7-8]。硼替佐米對腫瘤細(xì)胞的蛋白酶體抑制能力明顯強于正常細(xì)胞，高出約100～1000倍，其與許多化療藥物合用呈現(xiàn)出增敏作用[9-10]。目前在實體腫瘤中的放化療增敏作用也被不斷地研究。

本實驗研究硼替佐米對于胃癌細(xì)胞系MKN45增殖、凋亡的影響。硼替佐米能抑制MKN45細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。光鏡下觀察給予硼替佐米的MKN45細(xì)胞，呈現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)改變，染色質(zhì)濃縮、核固縮、胞質(zhì)見大量空泡形成。進(jìn)一步研究硼替佐米的作用機制發(fā)現(xiàn)，凋亡促進(jìn)蛋白Bax隨著硼替佐米的劑量增加而表達(dá)量升高。Bax屬于Bcl-2家族成員，是最重要的促凋亡基因之一，廣泛表達(dá)于肝細(xì)胞、呼吸系統(tǒng)上皮細(xì)胞和支氣管平滑肌等細(xì)胞中。Bcl-2/Bax比例直接決定線粒體外膜電位[11]，形成細(xì)胞凋亡調(diào)控的樞紐，是啟動細(xì)胞凋亡的“分子開關(guān)”[12]。Bax和Bcl-2通過形成同源或異源二聚體來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。當(dāng)Bax形成同源二聚體時誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Bax與bcl-2形成異源二聚體時則抑制細(xì)胞凋亡。在外界因素刺激下，細(xì)胞凋亡最終取決于Bc-2和Bax兩種調(diào)控因子的平衡結(jié)果[13]。提高Bax基因表達(dá)、上調(diào)Bax活性等針對Bax的靶向治療已顯示出促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡、增強藥物抗癌效應(yīng)的作用[14-16]。在胃癌中有研究顯示，Bax能部分介導(dǎo)組蛋白去乙?；敢种苿┖偷鞍酌敢种苿╅g的協(xié)同細(xì)胞毒作用[17]。腺病毒轉(zhuǎn)染Bax基因能增加胃癌細(xì)胞的放射敏感性[18]。本研究中，當(dāng)沉默Bax時，細(xì)胞增殖率升高，凋亡比例下降，給予硼替佐米后shBax細(xì)胞凋亡未見明顯上升，提示硼替佐米的促凋亡作用部分由Bax介導(dǎo)。上述研究結(jié)果或許能為胃癌的放化療增敏治療提供新的思路。

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（童穎丹 編輯）

Bortezomib induced apoptosis of MNK45 cells through up-regulation of Bax*

Xi-he Zhao,Kai Li,Hua-wei Zou
(Department of Oncology,Shengjing Hospital Affiliated to China Medical University,Shenyang,Liaoning 110022,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Bax on Bortezomib-induced apoptosis of gastric cancer MNK45 cells.MethodsBax shRNA was constructed and transfected into MKN45 cells.Bortezomib of gradient concentrations was administrated into MKN45 cells(5 nmol/L,25 nmol/L,50 nmol/L,100 nmol/L,250 nmol/L, 500 nmol/L and 1,000 nmol/L).Cell viability and apoptosis rate were examined.ResultsBax-knockdown MKN45 cell line was constructed by transfection.Gradient Bortezomib suppressed the proliferation of mock MKN45 cells and induced cell apoptosis,meanwhile Bax protein level was increased.Bortezomib increased apoptosis rate at a concentration of 500 nmol/L.In the shBax group,apoptosis rate was down-regulated and proliferation ability was strengthened.ConclusionsBax-mediated apoptosis caused by Bortezomib and knockdown of Bax could partially attenuate cell death caused by Bortezomib.

gastric cancer;Bortezomib;Bax;apoptosis

R735.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.01.003

1005-8982（2017）01-0011-05

2016-02-22

國家自然科學(xué)基金（N0：81472806）

鄒華偉，E-mail：zouhw@sj-hospital.org；Tel：18940251190