養(yǎng)肝解毒丸微生物限度檢查法的驗證實驗

劉廣文+苑艷飛

[摘要]目的建立適合養(yǎng)肝解毒丸微生物限度檢查的方法，保證方法的科學(xué)性和檢查結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠。方法按照《中國藥典》2015年版四部規(guī)定的微生物限度檢查法對微生物限度和控制菌進行檢查，以5種試驗菌的回收率對檢驗方法的有效性進行驗證和確認。結(jié)果在3次獨立的平行試驗中，需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)驗證中各試驗菌每次試驗的比值在0.5～2的范圍內(nèi)；試驗組可以檢出控制菌大腸埃希菌和乙型副傷寒沙門菌。結(jié)論需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查采用薄膜過濾法，控制菌檢查可采用常規(guī)法。

[關(guān)鍵詞]養(yǎng)肝解毒丸；微生物限度檢查；方法學(xué)驗證

微生物試驗的結(jié)果易受試驗條件的影響，特別是制劑中含有較強的抑菌成分時，只采用常規(guī)方法進行微生物限度檢查，其結(jié)果不能真實反映其污染的微生物狀況Ⅲ?？诜苿┲形⑸镂廴緺顩r的控制是藥品質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。中藥口服制劑尤其易受到微生物的污染，因此中國藥典2015年版四部通則中規(guī)定微生物限度是中藥丸劑的必檢項目。

近年來，關(guān)于中成藥微生物限度檢查的方法學(xué)驗證試驗的報道表明，通過方法學(xué)驗證試驗可以消除藥物的抑菌作用，使檢驗結(jié)果更具有效性。養(yǎng)肝解毒丸是由山藥、龍膽草、敗醬草、夏枯草、靈芝、牡丹皮、山茱萸等十二味中藥組方組成的復(fù)方制劑。其主要功能是滋腎，解毒?，F(xiàn)根據(jù)《中國藥典》2015年版四部微生物限度檢查法規(guī)定，必須對其檢查方法進行驗證，筆者通過對養(yǎng)肝解毒丸進行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)及相關(guān)控制菌的測定建立了適合的微生物限度檢查方法并對方法進行驗證，確保了檢測方法的可行性。

1試驗材料

1.1儀器

GNP-9270BS-Ⅲ型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司；101A-1型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱，深圳市億博蘭電子有限公司；MLS-3780型高壓蒸汽滅菌器，日本三洋。

1.2試藥

養(yǎng)肝解毒丸（泰安市中醫(yī)醫(yī)院，批號：151201，151202，151203）。

1.3培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號：3104593）；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號：3104633）；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號：3104369）；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號：3103279）；腸道菌增菌液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基；（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號：3104601）；紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號：3104591）；麥康凱液體培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號：3104449）；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號：3104517）；RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號：3104566）；木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號：3104616）。

1.4稀釋劑、沖洗劑

氯化鈉一蛋白胨緩沖液（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：140424）、0.9%無菌氯化鈉溶液。

1.5菌種

實驗所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進行保存，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。

以下菌株均購自山東省食品藥品檢驗研究院（符合藥典標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定）。

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26 003第4代]；銅綠假單胞菌[CMCC（B）10 104第4代]枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63 501第4代]；大腸埃希菌[CMCC（B）44102第4代]；乙型副傷寒沙門菌[CMCC（B）50 094第4代]；白色念珠菌[CMCC（F）98 001第4代]；黑曲霉[CMCC（F）98 003第4代]。

2驗證方法與結(jié)果

2.1菌液的制備方法

取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌和沙門菌的新鮮培養(yǎng)物至10mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，將上述各培養(yǎng)基均置于隔水式恒溫培養(yǎng)箱（30～35℃）中培養(yǎng)18～24h。分別取各培養(yǎng)物1mL，加0.9%無菌氯化鈉溶液9mL，10倍遞增稀釋制成每毫升含菌數(shù)為小于100cfu的菌懸液。

取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10mL沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，置生化培養(yǎng)箱（20～25℃）培養(yǎng)2～3d，取培養(yǎng)物1mL，加0.9%無菌氯化鈉溶液9mL，10倍遞增稀釋制成每毫升含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液。

取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基中，置生化培養(yǎng)箱（20～25℃）培養(yǎng)5～7d，使大量的孢子形成。用5mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液將孢子洗脫。然后，過濾孢子懸液至無菌試管內(nèi)，取該孢子液1mL，加含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液9mL，10倍遞增稀釋制成每毫升含孢子數(shù)為小于100cfu的孢子液。

2.2供試液的制備方法

每批樣品從兩個最小包裝里取供試品10g，加pH 7.0無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液至100mL，混勻，作為1：10供試液。

2.3培養(yǎng)基適用性檢查

取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的菌液各不大于100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置30～35℃培養(yǎng)18～24h，計數(shù)；取白色念珠菌、黑曲霉的菌液各不大于100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，棍勻，凝固，置20～25℃培養(yǎng)5～7d，計數(shù)。同時，用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述試驗。見表1。

2.4驗證方法：薄膜過濾法

試驗組：取上述1：10的供試液10mL過濾，用pH 7.0的氯化鈉一蛋白胨緩沖液300mL分3次沖洗濾膜，在最后一次沖洗液中加入上述稀釋的5種菌的菌懸液1mL（小于100cfu），過濾，取出濾膜，貼于相應(yīng)的培養(yǎng)基中，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基置30～35℃培養(yǎng)3～5d，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基置20～25℃培養(yǎng)5～7d，測定試驗菌數(shù)。

供試品對照組：取上述1：10的供試液10mL過濾，用pH 7.0的氯化鈉一蛋白胨緩沖液300mL分3次沖洗濾膜，取出濾膜，貼于相應(yīng)的培養(yǎng)基中，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基置30～35℃培養(yǎng)3～5d，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基置20～25℃培養(yǎng)5～7d，測定試驗菌數(shù)。

菌液對照組：將pH 7.0氯化鈉一蛋白胨緩沖液100mL置于過濾器中，加入不大于100cfu的試驗菌液，過濾后取出濾膜貼于相應(yīng)的培養(yǎng)基中，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基置30～35℃培養(yǎng)3～5d，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基置20～25℃培養(yǎng)5～7d，測定試驗菌數(shù)。

驗證結(jié)果：依照下列公式，計算五種菌的回收率，結(jié)果見表2～4。

試驗組菌比值=（試驗組平均菌落數(shù)一供試品對照組的平均菌落數(shù)）/菌液對照組的平均菌落數(shù)。

由表2～4可見，采用薄膜過濾法對養(yǎng)肝解毒丸進行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)比值的測定，五種菌的比值均在0.5～2的范圍內(nèi)，符合《中國藥典》2015年版四部微生物限度檢查驗證要求，故薄膜過濾法可用于養(yǎng)肝解毒丸的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢查。

2.5控制菌（耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌和沙門菌）檢查方法的驗證

耐膽鹽革蘭陰性菌：取1：10的供試液100mL，混勻，在20～25℃培養(yǎng)2h。取供試液3份，每份10mL，加入100mL腸道菌增菌液體培養(yǎng)基，其中一份加入1mL大腸埃希菌作為陽性對照，一份加入1mL金黃色葡萄球菌液作為陰性菌對照，一份不加菌作為供試品檢查，均培養(yǎng)24～48h后，劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，依法培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)。

大腸埃希菌：取1：10的供試液3份，每份10mL，加入100mL麥康凱液體培養(yǎng)基，其中一份加入1mL大腸埃希菌作為陽性對照，一份加入1mL金黃色葡萄球菌液作為陰性菌對照，一份不加菌作為供試品檢查，均培養(yǎng)24～48h后，劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，依法培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)。

沙門菌：取10g供試品接種至100mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，30～35℃培養(yǎng)18～24h。取上述培養(yǎng)物3份，每份0.1mL，加入10mL RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基，其中一份加入1mL乙型副傷寒沙門菌作為陽性對照，一份加人1mL金黃色葡萄球菌液作為陰性菌對照，一份不加菌作為供試品檢查，均培養(yǎng)24～48h后，劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，依法培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)。

驗證結(jié)果：見表5。

由表5可見，采用常規(guī)法，控制菌能正常檢出，陰性對照未檢出，符合《中國藥典》2015年版四部微生物限度檢查控制菌檢查驗證要求，所以常規(guī)法可用于養(yǎng)肝解毒丸的控制菌檢查。

通過以上驗證實驗證明，養(yǎng)肝解毒丸的微生物限度檢查方法，需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查可采用薄膜過濾法，采用常規(guī)法控制菌也能正常檢出，由此確定驗證方法成立，本實驗室建立的該項目的檢查方法符合規(guī)定。

3討論

按照2015年版《中國藥典》四部的要求，在進行藥品微生物限度檢查時，只有在該檢驗條件下的樣品濃度不足以抑制污染微生物的生長時，才能使供試品中的微生物得到真實反映，從而保證檢驗結(jié)果的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。有很多文獻就具有抑菌成分的中成藥的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢驗方法進行了探索和研究。中藥制劑是含有多種成分的復(fù)合制劑，其中任何成分具有抑菌作用均可影響微生物限度檢查的準(zhǔn)確性，因此必須對藥品的微生物限度檢查方法進行嚴(yán)格的驗證，才能保證檢查方法的完整性和可靠性。

3.1實驗室的檢驗環(huán)境對試驗方法的影響

2015年版《中國藥典》對微生物限度檢查的環(huán)境提出了明確的要求：應(yīng)在不低于D級背景下的B級單向流空氣區(qū)域內(nèi)進行，B級區(qū)域的空氣供給應(yīng)通過終端高效空氣過濾器（HEPA）。應(yīng)嚴(yán)格按照相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)進行定期的環(huán)境監(jiān)測，并制定清潔、消毒和衛(wèi)生的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范，防止檢驗過程中環(huán)境造成檢品的假陽性。

3.2預(yù)處理

在進行薄膜過濾時須先將供試液采用適宜的方法進行預(yù)處理，然后再移至帶有沖洗液的濾罐中充分混勻后再進行減壓抽濾，否則由于供試液雜質(zhì)太多造成濾罐堵塞引起濾罐爆裂，可能造成人員傷害。在過濾完后必須進行二次沖洗，以保證抑菌成分的徹底清除?？蓪⑷〕龅臑V膜正面向上貼于培養(yǎng)基上，經(jīng)多次試驗證明，這樣培養(yǎng)出的菌落大并且清晰，特別是在菌落數(shù)較多時，菌落會向周圍的培養(yǎng)基擴散，不至于菌落都堆積在一起，不利于菌落計數(shù)。

3.3菌落計數(shù)誤差對驗證方法的影響

當(dāng)細菌生長小而密集時，極易發(fā)生計數(shù)誤差。故菌落計數(shù)時應(yīng)仔細觀察，必要時借助放大鏡或低倍顯微鏡，以排除藥渣和小氣泡干擾計數(shù)；如難區(qū)別，可適當(dāng)延長培養(yǎng)時間。

3.4藥品微生物檢驗用的試驗菌

試驗菌應(yīng)來自認可的國內(nèi)或國外菌種保藏機構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)菌株，或使用與標(biāo)準(zhǔn)菌株所有相關(guān)特性等效的可以溯源的商業(yè)派生菌株。工作菌株的傳代次數(shù)應(yīng)嚴(yán)格控制，不得超過5代（從菌種保藏機構(gòu)獲得的標(biāo)準(zhǔn)菌株為第0代），以防止過度的傳代增加菌種變異的風(fēng)險。制備后的菌液若在室溫下放置，應(yīng)在2h內(nèi)使用；若保存在2～8℃，可在24h內(nèi)使用。

養(yǎng)肝解毒丸在檢查需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)時，其組分中有抑菌成分，故需通過薄膜過濾法將抑菌成分清除，方能達到檢驗?zāi)康模虼藢嶒炞C明本研究建立的方法適用于養(yǎng)肝解毒丸的微生物限度檢查。另外當(dāng)藥物的生產(chǎn)方法變更、制劑組分改變、檢查法修訂或檢驗條件發(fā)生改變時檢查方法也應(yīng)該進行重新驗證。