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    HIF—1a、VEGF、MVD在大腸腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

    2017-02-06 17:26:28陳寶英王澤輝官成濃張英王玉洲
    中國(guó)醫(yī)藥科學(xué) 2016年15期
    關(guān)鍵詞:漿膜腸壁大腸

    陳寶英+王澤輝+官成濃+張英+王玉洲

    [摘要]目的探討HIF-1a、VEGF、MVD(用抗CD34抗體標(biāo)記)在大腸腺癌組織中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系。方法采用免疫組織化學(xué)S-P法檢測(cè)廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院經(jīng)病理檢查證實(shí)的手術(shù)切除標(biāo)本或活檢組織中HIF-1a、VEGF、MVD的表達(dá)情況,其中38例大腸腺癌組織、22例大腸腺瘤組織、29例正常大腸組織。結(jié)果HIF-1a、VEGF在大腸腺癌組的陽性表達(dá)率分別為73.7%、65.8%,明顯高于大腸腺瘤組、正常大腸組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。大腸腺癌、大腸腺瘤、正常大腸組織中MVD值分別是(52.36±9.66)、(30.23±5.22)、(21.37±4.755),MVD值在腺癌中明顯高于腺瘤及正常腸組織(P<0.05)。28例HIF-1a呈陽性表達(dá)的大腸腺癌組織MVD值為(53.22±10.15);呈陰性表達(dá)的10例中MVD值為(42.75±10.47),呈正相關(guān)關(guān)系(rs=0.392,P<0.05)。VEGF呈陽性表達(dá)的25例大腸腺癌組織MVD值為(54.54±9.60);呈陰性表達(dá)的10例中MVD值為(42.63±9.80),呈正相關(guān)關(guān)系(rs=0.491,P<0.05)。結(jié)論在大腸腺癌組織中HIF-1a和VEGF的表達(dá)明顯高于大腸腺瘤組織和正常大腸組織,提示HIF-1a和VEGF可能參與大腸腺癌的發(fā)展。MVD值在大腸腺癌中的表達(dá)明顯高于大腸腺瘤組織和正常大腸組織,提示大腸腺癌中血管生成較大腸腺瘤組織和正常大腸組織豐富;MVD值是衡量大腸腺癌發(fā)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)。HIF-1a、VEGF的表達(dá)與MVD值在大腸腺癌組織中均呈正相關(guān),提示HIF-1a、VEGF可能與大癌發(fā)展過程中血管生成密切相關(guān)。

    [關(guān)鍵詞]大腸腺癌;HIF-1a;VEGF;MVD

    大腸癌包括結(jié)腸癌和直腸癌,是最常見的消化道惡性腫瘤之一。雖然目前對(duì)大腸癌采用了以手術(shù)切除為主的綜合治療,但其治療效果仍不夠理想,而術(shù)后的局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移則是影響術(shù)后生存率的重要因素。因此,深入研究大腸癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制,從分子水平找到可用于提示大腸癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物,既可預(yù)警大腸癌的術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移,及早對(duì)可能復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的大腸癌患者進(jìn)行放化療或靶向治療,亦可研究這些因子可否成為腫瘤治療中的新靶點(diǎn),對(duì)提高患者生存率、評(píng)估患者的預(yù)后及臨床治療有現(xiàn)實(shí)的意義。本課題運(yùn)用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)HIF-1a、VEGF、MVD在大腸腺癌的表達(dá)情況,并分析其相關(guān)性,探討它們與大腸腺癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系及在大腸腺癌中與血管生成的關(guān)系,旨在對(duì)大腸腺癌惡性程度的判定、預(yù)后分析及生物學(xué)治療提供有效的理論依據(jù)。

    1資料與方法

    1.1一般資料

    收集廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院經(jīng)病理檢查證實(shí)的手術(shù)切除標(biāo)本或活檢組織,其中大腸腺癌38例;正常大腸組織29例(距腫瘤邊緣>5cm處的正常黏膜);大腸腺瘤組織22例。所有標(biāo)本均經(jīng)40g/L緩沖中性福爾馬林液固定,常規(guī)石蠟包埋,每個(gè)標(biāo)本蠟塊行4μm厚度連續(xù)切片。所有患者手術(shù)前未接受放療、化療,每例有詳細(xì)的臨床資料、手術(shù)記錄。38例大腸腺癌中男21例,女17例;年齡在29~84歲(其中≤60歲20例,>60歲18例,平均年齡59.42歲);直腸癌16例,結(jié)腸癌22例;病理學(xué)分級(jí):高分化5例,中分化25例,低分化8例;大腸腺癌TMN分期根據(jù)2002美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)的分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期:Ⅰ期6例,Ⅱ16期例,Ⅲ期15例,Ⅳ期1例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例,沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例。

    1.2實(shí)驗(yàn)方法

    采用鏈菌素抗生物素蛋白一過氧化物酶法(S-P法)檢測(cè)μm、VEGF、CD34蛋白的表達(dá),一抗為兔抗人HIF-1a多克隆抗體(1:50),兔抗人VEGF多克隆抗體(1:50),兔抗人CD34多克隆抗體(1:50),試劑均購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

    1.3結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

    HIF-1a、VEGF表達(dá)水平采用Fromowitz陽性細(xì)胞半定量分級(jí)法。首先根據(jù)陽性細(xì)胞占整個(gè)腫瘤細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)記分:≤5%記為0分;6%~25%為1分;26%~50%為2分;51%~75%為3分;>75%為4分。再根據(jù)陽性細(xì)胞染色深淺記分,陰性為0分;淡黃色為1分;棕黃色為2分,棕褐色為3分。最后將二者分?jǐn)?shù)相加,0~1分記為(一),2~3分記為(+);4~5分記為(++);6~7分記為(+++),其中(-)~(+)視為陰性,(++)~(+++)視為陽性。

    微血管計(jì)數(shù)參照Weidner的方法:任何與鄰近的微血管、腫瘤細(xì)胞及其它相連組織有明顯分界的被CD34染成棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇均視為一個(gè)血管計(jì)數(shù),首先在低倍鏡(40和100倍)下選取癌視野中微血管最密集的3個(gè)區(qū)域,然后在高倍鏡(400倍)進(jìn)行血管計(jì)數(shù),取其平均值作為該例腫瘤的MVD值,結(jié)果以(x±s)表示。

    1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    統(tǒng)計(jì)學(xué)處理在SPSS17.0軟件包上進(jìn)行。計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)、計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)、方差分析,分析HIF-1a、VEGF、MVD在大腸腺癌、正常大腸組織、大腸腺瘤中的表達(dá)水平,以及它們與大腸腺癌的臨床病理因素的相關(guān)性,用spearman等級(jí)相關(guān)分析HIF-1a、VEGF、MVD的相互關(guān)系,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2結(jié)果

    2.1HIF-1a、VEGF和MVD在各種腸組織中的表達(dá)情況

    2.1.1HIF-1a在各種腸組織中的表達(dá)情況HIF-1a陽性產(chǎn)物呈棕黃色或棕褐色顆粒,主要著色在細(xì)胞核和細(xì)胞漿,以細(xì)胞漿為主,在腫瘤壞死明顯的區(qū)域和腫瘤浸潤(rùn)邊緣的表達(dá)明顯增多。在大腸腺癌、大腸腺瘤和正常大腸組織中均有表達(dá),但表達(dá)程度不一。HIF-1a在大腸腺癌組織、大腸腺瘤組織、正常大腸組織中陽性表達(dá)率分別為:73.7%(28/38)、45.5%(10/22)、13.8%(4/29),在腺癌組織陽性表達(dá)率高于腺瘤組織和正常大腸組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),在腺瘤組織與正常大腸組織間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

    2.1.2 VEGF在各種腸組織中的表達(dá)情況VEGF主要表達(dá)在細(xì)胞漿和細(xì)胞膜,以胞漿為主,某些血管內(nèi)皮細(xì)胞也可見表達(dá),呈棕黃色顆粒,大腸腺癌組織、大腸腺瘤組織和正常大腸組織中都有表達(dá),但表達(dá)程度不一,高表達(dá)主要見于大腸腺癌組織。38例大腸腺癌組織中有25例VEGF表達(dá)陽性,占65.8%(25/38),VEGF在大腸腺瘤組織中陽性表達(dá)率為31.8%(7/22)及正常大腸組織中陽性率表達(dá)為10.3%(3/29)。VEGF在腺癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于腺瘤與正常大腸組織(P<0.05),在腺瘤組織與正常大腸組織間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

    2.1.3CD34在各種腸組織中的表達(dá)情況CD34定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上,呈棕黃色顆粒,主要分布于癌間質(zhì)區(qū),在腫瘤周邊區(qū)含量相對(duì)高。在大腸腺癌中CD34標(biāo)記的微血管形態(tài)多呈成熟狀態(tài),管腔大,管壁比較完整,在大腸正常組織中的微血管多為單細(xì)胞形成,管腔小,形狀多不完整。大腸腺癌、大腸腺瘤、正常大腸組織中MVD值分別是(52.36±9.66)、(30.23±5.22)、(21.37±4.755)。MVD值在腺癌中明顯高于腺瘤及正常腸組織(P<0.05),腺瘤組織與正常大腸組織間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

    2.2HIF-1a、VEGF和MVD的表達(dá)與大腸腺癌臨床病理特征的關(guān)系

    2.2.1HIF-1a的表達(dá)與大腸腺癌臨床病理特征的關(guān)系HIF-1a在大腸腺癌中的表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腸壁浸潤(rùn)深度相關(guān),Ⅲ期+Ⅳ期陽性表達(dá)率高于Ⅰ期+Ⅱ期(P<0.05),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組,腫瘤浸潤(rùn)達(dá)漿膜及漿膜外組陽性表達(dá)率高于腫瘤浸潤(rùn)未及漿膜組;HIF-1a表達(dá)與年齡、性別、腫瘤最大直徑、腫瘤部位、病理學(xué)分級(jí)無關(guān)(P>0.05)。見表4。

    2.2.2 VEGF的表達(dá)與大腸腺癌臨床病理特征的關(guān)系VEGF在大腸腺癌中的表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理學(xué)分級(jí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),分期晚VEGF陽性表達(dá)率高,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組,低分化VEGF陽性表達(dá)率高于中分化和高分化組;VEGF表達(dá)與年齡、性別、腫瘤最大直徑、腫瘤部位、腸壁浸潤(rùn)深度無關(guān)(P>0.05)。見表5。

    2.2.3MVD的表達(dá)與大腸腺癌臨床病理特征的關(guān)系MVD值與大腸腺腸癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腸壁浸潤(rùn)深度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),分期晚MVD值高,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組,腫瘤浸潤(rùn)達(dá)漿膜及漿膜外組高于腫瘤浸潤(rùn)未及漿膜組,低分化組高于中分化和高分化組;與年齡、性別、腫瘤最大直徑、腫瘤部位無關(guān)(P>0.05)。見表5。

    2.3大腸腺癌組織中HIF-1a、VEGF和MVD表達(dá)的相互關(guān)系

    28例HIF-1a呈陽性表達(dá)的大腸腺癌組織MVD值為(53.22±10.15);呈陰性表達(dá)的10例中MVD值為(42.75±10.47),呈正相關(guān)關(guān)系(rs=0.392,P<0.05)。VEGF呈陽性表達(dá)的25例大腸腺癌組織MVD值為(54.54±9.60);呈陰性表達(dá)的10例中MVD值為(42.63±9.80),呈正相關(guān)關(guān)系(rs=0.491,P<0.05)。見表6。

    3討論

    本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HIF-1a在大腸腺癌組織中表達(dá)水平為73.7%(28/38)明顯高于大腸腺瘤組織45.5%(10/22)、正常大腸組織13.8%(4/29),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),尤其是在腫瘤壞死明顯的區(qū)域和腫瘤浸潤(rùn)邊緣。這提示HIF-1a的高表達(dá)與大腸腺癌的發(fā)生有相關(guān)性,這與國(guó)內(nèi)外大多數(shù)相關(guān)報(bào)道基本一致。其表達(dá)水平增高可能是因?yàn)槟[瘤組織氧濃度降低,也可能是抑癌基因突變或癌基因激活,從而導(dǎo)致一系列基因的表達(dá)水平增高,使腫瘤細(xì)胞耐受缺氧,促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移。另外HIF-1a表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸腺癌HIF-1a的陽性表達(dá)率為93.8%(15/16)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組59.1%(13/22);在腫瘤腸壁浸潤(rùn)達(dá)漿膜或漿膜外組HIF-1a的陽性表達(dá)率為86.2%(25/27)高于腸壁浸潤(rùn)未達(dá)漿膜層組的45.5%(5/11);在大腸腺癌Ⅰ~Ⅱ和Ⅲ~Ⅳ病例中,HIF-1a的陽性表達(dá)率分別是59.1%(13/22)、93.8%(15/16),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示HIF-1a表達(dá)異常與腺癌的淋巴結(jié)形成、腸壁浸潤(rùn)深度及臨床分期有關(guān),而且腫瘤腸壁浸潤(rùn)越深、TNM分期越晚陽性表達(dá)率越高;HIF-1a的表達(dá)與患者性別、年齡、病理學(xué)分級(jí)、腫瘤部位、腫瘤大小無關(guān)(P>0.05)。Schindl等對(duì)206例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的乳腺癌標(biāo)本的HIF-1a表達(dá)進(jìn)行免疫組化分析,顯示HIF-1a陽性表達(dá)率為76.2%(157/206),也提示HIF-1a是高度侵襲性疾病的一個(gè)生物標(biāo)志。本研究提示腫瘤細(xì)胞通過增強(qiáng)HIF-1a表達(dá),促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。其可能的機(jī)制為HIF-1a調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá),VEGF進(jìn)而作用于存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的兩種受體VEGFR1和VEGFR2,從而激活了一系列的缺血轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,誘導(dǎo)新生血管的生成,增高毛細(xì)血管通透性,來促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。

    本研究發(fā)現(xiàn)在38例大腸腺癌組織中VEGF的陽性表達(dá)率為65.8%(25/38)明顯高于腺瘤組織31.8%(7/22)和正常大腸組織10.3%(3/29),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示VEGF高表達(dá)可能與大腸腺癌的發(fā)生有一定相關(guān)性。這與國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道基本一致。本實(shí)驗(yàn)還分析了VEGF表達(dá)與大腸腺癌臨床病理學(xué)及其相關(guān)因素的關(guān)系,在大腸腺癌組織中VEGF的表達(dá)與患者性別、年齡、腸壁浸潤(rùn)深度、腫瘤部位、腫瘤大小無關(guān)(P>0.05)。與大腸腺癌的淋巴結(jié)形成、病理學(xué)分級(jí)及臨床分期有關(guān),在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中,VEGF的陽性表達(dá)率分別是50.0%(11/22)、87.5%(14/16);在病理分級(jí)高分化、中分化及低分化組中VEGF的陽性表達(dá)率分別是20.0%(1/5)、68.0%(17/25)、87.5%(7/8);在Ⅰ~Ⅱ組和Ⅲ~Ⅳ組病例中,VEGF的陽性表達(dá)率分別是50.0%(11/22)、87.5%(14/16),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示大腸腺癌組織中VEGF的表達(dá)明顯增高且與腫瘤的侵襲能力密切相關(guān)。VEGF是一種內(nèi)皮細(xì)胞特異性有絲分裂原,能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)溶解、內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增生和管腔形成,能直接刺激新生血管形成;VEGF還能增加血管尤其是微血管的通透性,為血管形成過程中多種細(xì)胞遷移提供一個(gè)纖維網(wǎng)絡(luò),部分腫瘤細(xì)胞也可以穿過血管壁進(jìn)入血管向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,加速了腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移;VEGF亦可上調(diào)或誘導(dǎo)各種血管源因子和抗凋亡因子,促進(jìn)腫瘤血管生成并提高腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力。

    本實(shí)驗(yàn)中,在38例大腸腺癌中,MVD值為52.36±9.66,在22例大腸腺瘤中MVD值為30.23±5.22,而29例大腸正常組織中MVD值為21.37±4.75,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這與其他研究者對(duì)乳腺癌、肺癌、前列腺癌、子宮鱗癌等腫瘤組織MVD檢測(cè)的結(jié)果一致,這說明大腸腺癌組織的血管生成能力明顯增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)還分析了MVD值與大腸腺癌臨床病理學(xué)及其相關(guān)因素的關(guān)系,在大腸腺癌組織中MVD值與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小無關(guān)(P>0.05);而在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中,MVD值分別是(44.97±10.00)、(58.02±7.75);在腫瘤腸壁浸潤(rùn)達(dá)漿膜或漿膜外組MVD值為55.09±9.24高于腸壁浸潤(rùn)未達(dá)漿膜層組的(39.13±6.06);在病理分級(jí)高分化、中分化及低分化組中MVD值分別是(43.12±13.19)、(49.20±8.90)、(59.00±12.47);在Ⅰ~Ⅱ組和Ⅲ~Ⅳ組病例中,MVD值分別是(44.97±10.00)、(58.02±7.75),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MVD值與大腸腺癌的淋巴結(jié)形成、腸壁浸潤(rùn)深度、病理學(xué)分級(jí)及臨床分期有關(guān),可能因?yàn)槟[瘤的快速生長(zhǎng),使其處于相對(duì)缺氧的狀態(tài),促使了大腸腺癌血管新生,維持了腫瘤生長(zhǎng),同時(shí)新生的腫瘤血管又加速了腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。因此說明血管生成在大腸腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用。

    研究已證實(shí)VEGF是刺激腫瘤血管形成最關(guān)鍵的生長(zhǎng)因子,其表達(dá)受許多外部因子調(diào)控,HIF-1a為其中之一,有研究表明HIF-1a可上調(diào)多種血管生成因子的表達(dá)來介導(dǎo)缺氧狀態(tài)下的血管形成反應(yīng),可介導(dǎo)VEGF和其他缺氧反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄活性。大量的研究證明HIF-1與VEGF存在正相關(guān)關(guān)系,Bos等研究表明在乳腺癌的形成中,HIF-1a的表達(dá)與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF的表達(dá)、腫瘤細(xì)胞的高增殖狀態(tài)呈正相關(guān),認(rèn)為HIF-1a可作為乳腺癌患者新的預(yù)后指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)與國(guó)內(nèi)外的研究相一致。

    本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)HIF-1a、VEGF均與MVD值存在正相關(guān)關(guān)系。提示兩種因子均可通過各種的信號(hào)傳導(dǎo)通路促進(jìn)大腸腺癌血管的生成,并與大腸腺癌的發(fā)生、發(fā)展與侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此深入研究HIF-1a可能將為大腸腺癌的放化療及基因治療提供新的靶點(diǎn)。

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