水通道蛋白—7在小鼠腎集合管發(fā)育過程中的表達分析

王雅光+閻麗菁+田鶴

[摘要]目的探討水通道蛋白-7（aquaporin-7，AQP-7）在小鼠腎集合管發(fā)生發(fā)育過程中的表達和作用。方法采用免疫組化結(jié)合體視學測量和免疫印跡技術(shù)，測定胚齡（E）16、18d胎鼠及生后（P）1、3、5、7、14、21、42、70d仔鼠腎集合管中AQP-7的表達及含量變化。結(jié)果通過體視學測量和免疫印跡技術(shù)結(jié)果顯示：AQP-7在胚齡16d的小鼠腎集合管開始弱表達，到生后21d達到高峰，之后隨著日齡的增加，表達無明顯變化。結(jié)論AQP-7主要表達在發(fā)育中小鼠腎集合管中，可能和腎集合管的發(fā)育和成熟相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]水通道蛋白-7；腎；集合管；小鼠；發(fā)育

水通道蛋白-7（aquaporin-7，AQP-7，也叫AQPap），AQP-7是從脂肪組織中分離鑒定出的一種水孔蛋白基因，其蛋白質(zhì)是水通道蛋白家族中的一個成員。水通道蛋白普遍存在于微生物、植物、及動物界。AQP-7在腎臟中的表達水平較高，屬于甘油水通道蛋白，同時對腎臟中水份的重吸收和尿液的濃縮都起著重要作用。有大量的研究表明，甘油水通道蛋白在允許水分子通過的同時也可以允許一些其它的中性溶質(zhì)通過。甘油水通道蛋白在多種組織中都有重要的生理功能；例如在脂肪組織，上皮組織中，特別是在細胞受損的快速增殖期能為其提供能量，而器官的發(fā)生發(fā)育也是細胞快速增值的過程。關(guān)于水通道蛋白在腎臟中發(fā)生發(fā)育的文獻報道有很多，其中與AQP-7屬于同一亞家族的AQP-3在腎臟集合管表達的文獻也很常見?；谶@些，我們試想AQP-7也可能在腎臟集合管的發(fā)生發(fā)育中起到一定的作用。本研究采用免疫組織化學和免疫印跡的技術(shù)探討AQP-7在腎臟集合管的發(fā)育中的作用。

1資料與方法

1.1一般資料

2015年3月～10月期間由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供的健康2月齡昆明小鼠（雌雄比例1：1），體重25g，隨機合籠。觀察到陰道栓脫落的最早時間計為胚齡（embryonic days，E）0d。觀察到仔鼠出生的最早時間計為生后（postnatal，P）Od。孕鼠分為10組，每組3只，每只孕鼠取2只胎鼠或仔鼠。分別取胚齡16、18d胎鼠和生后1、3、5、7、14、21、42、70d仔鼠各6只，共60只。兔抗小鼠AQP-7多克隆抗體購自Santa公司；SABC免疫組化試劑盒購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司；膜蛋白提取試劑盒、Polyvinylidene Fluoride膜、SodiumDodecyl Sulfate等免疫印跡試劑均購自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1腎臟標本制備用100g/L水合氯醛將麻醉后，立即剖開孕鼠腹腔將胎鼠取出，E16、18d胎鼠取左腎全腎固定。仔鼠斷頭處死后，從腹后壁取左腎，沿橫軸將腎切成約3mm薄片，放人40g/L多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，香柏油透明，石蠟定向包埋，做連續(xù)切片，厚度5μm。右腎均入冰丙酮迅速冷凍，-80℃保存，供免疫印跡使用。

1.2.2體視學測量

以免疫組化染色切片進行體視學測量，每組選5張切片，每張切片按“s”形在油鏡下選取5個視野，應用方格測試系統(tǒng)，交點計數(shù)法測算集合管陽性反應表達的面密度值，其公式為：Sv=21x/Lc（Lc=∑Pc·a），式中Ix是陽性表達的胞膜與測試方格系統(tǒng)的交點數(shù)，Pc是測試系統(tǒng)落在參照系（集合管）的點數(shù)，a代表方格兩點間距離，實際長度相當于0.1mm。

1.2.3免疫印跡檢測取各組冷凍待用的右腎稱重，剪碎后，冰浴中加入膜蛋白抽提試劑，抽提膜蛋白，考馬斯亮藍法蛋白質(zhì)定量。每種樣品取20μg濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上。用100g/L脫脂奶粉封閉，加AQP-7抗體（濃度1：200）4℃孵育過夜后，堿性磷酸酶標記的二抗（濃度1：600）搖床室溫孵育1h，ECL顯色，用Fluorchem V2.0系統(tǒng)測定光密度值。

1.3統(tǒng)計學分析

采用SPSS16.0軟件對研究所得數(shù)據(jù)建立數(shù)據(jù)庫，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1體視學測量結(jié)果

通過對AQP-7免疫組織化學染色陽性切片（免疫組織化學染色圖片本篇論文未顯示）進行體視學分析得到如下結(jié)果：隨著胚日齡的增加，AQP-7在集合管表達的面密度值逐漸增加，P7天后增加明顯，P21天達到頂峰后趨于穩(wěn)定。見表1。

2.2免疫印跡檢測結(jié)果

AQP-7蛋白表達的電泳條帶用Gene Tools軟件分析，測定光密度值，以測得的光密度最大值記為1，計算各組小鼠腎組織中AQP-7的相對表達量（百分數(shù)）。結(jié)果顯示隨著小鼠腎的發(fā)育AQP-7表達量逐漸增加，P7d后增加明顯，P21d達到峰值后趨于穩(wěn)定。經(jīng)統(tǒng)計學分析，各組間數(shù)值的差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

3討論

水通道蛋白是允許水和甘油等小分子通透的膜蛋白通道，以四聚體形式位于質(zhì)膜上，每個單體含有一通道。水通道蛋白功能異常與很多疾病相關(guān)，例如先天性白內(nèi)障、腎源性尿崩癥。迄今為止，在人體已發(fā)現(xiàn)13種水通道蛋白fAQP0-12）。1997年首次從脂肪組織克隆了人類AQP7基因，它既能通透水也能易化甘油從細胞內(nèi)流出。AQP7在腎臟、睪丸、卵巢、心臟、胃腸道、骨骼肌等組織中均有不同程度的表達，調(diào)控腦的發(fā)育和精子的形成。腎組織中富含水通道蛋白，共有8種，即，AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP6、AQP7、AQP8和AQP11。對于AQP-7在腎臟中的作用，學者們進行了一些研究，AQP-7基因敲除的小鼠尿量增加。集合管的主要功能是濃縮尿液，進一步重吸收原尿中的水分。為了探討AQP-7與腎臟集合管發(fā)生發(fā)育的關(guān)系，本研究通過免疫組織化學技術(shù)結(jié)合體視學方法及免疫印跡法檢測AQP-7在小鼠腎集合管發(fā)生發(fā)育過程中的表達及其含量變化。

AQP-7表達于集合管上皮細胞的細胞膜，本實驗的體視學測量結(jié)果顯示AQP-7的面密度值隨著腎臟的發(fā)育逐漸增加，在生后21d達到最大值，之后維持不變。免疫印跡檢測結(jié)果顯示AQP-7在E16天開始有少量表達，蛋白含量隨腎臟發(fā)育逐漸增加，至P21d達最高峰，之后維持這一含量。小鼠發(fā)育過程中，集合管在胚胎16d開始出現(xiàn)，此時AQP-7開始出現(xiàn)弱表達，說明腎集合管的早期發(fā)育過程中有AQP-7的參與，此時的腎臟已具備通透水和（或）甘油等小分子物質(zhì)的功能。小鼠出生后，腎組織中AQP-7的含量逐漸增加，至P21d，AQP-7的表達達到最高值，此段時期，是腎髓質(zhì)體積迅猛增加的時期，是尿液濃縮能力變化較大的時期，集合管細胞水通道蛋白的表達量是影響尿液濃縮能力的關(guān)鍵因素，AQP-7蛋白含量在腎臟發(fā)育過程中的變化表明它是影響集合管重吸收水分的膜蛋白，對尿液濃縮發(fā)揮一定的作用，本實驗結(jié)果與前人相一致。

至今，關(guān)于AQP7在人體表達的研究還很少，簡單的以嚙齒類動物的研究數(shù)據(jù)來推測人體顯然是應該盡量避免的。為了更好的明確AQP7的表達和作用，蛋白和基因表達方面的研究還有待進一步開展。