移植人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)腦出血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)

周洪龍張鴻日閆中杰徐如祥

·基礎(chǔ)研究·

移植人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)腦出血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)

周洪龍1張鴻日1閆中杰2徐如祥1

目的研究移植人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（hAMSCs）是否能促進(jìn)腦出血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，探索其可能作用機(jī)制。方法138只雄性Wistar大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為人皮膚成纖維細(xì)胞（Fibroblasts）治療組（46只）、磷酸鹽緩沖液（PBS）治療組（46只）和hAMSCs治療組（46只）。腦出血模型采用顱內(nèi)注射Ⅶ型膠原酶制作，24 h后顱內(nèi)移植hAMSCs、Fibroblasts和PBS。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測hAMSCs表面抗原。免疫熒光檢測細(xì)胞分化、血管再生和神經(jīng)再生。酶聯(lián)免疫吸附劑測定試劑盒檢測腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），改良神經(jīng)功能評分（mNSS）檢測行為學(xué)。結(jié)果分離培養(yǎng)的hAMSCs呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞形態(tài)，表達(dá)CD29、CD44、CD90、CD105和CD166，不表達(dá)CD19、CD34和CD45。mNSS評分顯示，顱內(nèi)出血（ICH）7 d后，hAMSCs組評分明顯高于Fibroblasts治療組和PBS治療組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。ICH后14 d，hAMSCs組BrdU+細(xì)胞數(shù)目（55.33±6.59）高于Fibroblasts組（26.66±3.58）和PBS組（25.50±2.90），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。hAMSCs組Brdu+/DCX+細(xì)胞數(shù)目（30.66±3.65）高于Fibroblasts組（11.83±2.70）和PBS組（10.00±2.54），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。hAMSCs組血管性血友病因子+血管數(shù)目[（67.50±6.76）/mm2]高于Fibroblasts組[（31.66±6.33）/mm2]和PBS組[（28.83±5.58）/mm2]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。ICH后7 d和14 d，hAMSCs組BDNF表達(dá)水平 [（63.16±2.31）pg/mg，（38.57±3.69）pg/mg]高于Fibroblasts組[（46.18±2.45）pg/mg，（20.52±2.81）pg/mg]和PBS組[（43.18±2.30）pg/mg，（18.28±2.39）pg/mg]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。ICH后7、14、21 d，hAMSCs組VEGF表達(dá)水平 [（43.32±3.65）pg/mg，（30.90±2.62）pg/mg，（24.89±2.85）pg/mg]高于Fibroblasts組[（22.88±2.62）pg/mg，（15.41±2.40）pg/mg，（10.57±1.54）pg/mg]和PBS組 [（20.81±3.06）pg/mg，（14.44±2.32）pg/mg，（11.42±1.48）pg/mg]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。移植的hAMSCs在顱內(nèi)存活最少27 d，不表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物β-tubulinⅢ和星型膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白。結(jié)論移植hAMSCs能促進(jìn)腦出血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，其作用機(jī)制可能是通過增加神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)，促進(jìn)血管再生和神經(jīng)再生。因此hAMSCs是治療腦出血的理想干細(xì)胞。

間充質(zhì)干細(xì)胞；羊膜；腦出血；移植；神經(jīng)功能恢復(fù)

腦出血由顱內(nèi)血管破裂引發(fā)，其約占卒中的10%～15%，常導(dǎo)致成人高的致死率和致殘率，是一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]，目前尚少見有效的藥物治療，手術(shù)治療仍具有不確定性和爭議性[2]。因此，發(fā)展替代的治療方法，如細(xì)胞治療是非常重要和必要的。

間充質(zhì)干細(xì)胞 （mesenchymal stem cells，MSCs）是一種具有自我更新和多向分化能力的非造血干細(xì)胞[3]。來自骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是第一種被報道的和被廣泛研究的間充質(zhì)干細(xì)胞。最近，有研究報道移植BMSCs能促進(jìn)腦出血動物神經(jīng)功能恢復(fù)[4]。然而，BMSCs的來源有限，獲取骨髓過程具有侵襲性，另外隨著供者年齡的增長，BMSCs的數(shù)目、分化能力和頻率下降[5]。因此，有必要探索其他的MSCs來源。在最近幾年，來源于人胎盤羊膜組織的間充質(zhì)干細(xì)胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs）被認(rèn)為是一種可替代的MSCs來源。與BMSCs相似，在特定的條件下，這些細(xì)胞能向包括神經(jīng)系列細(xì)胞在內(nèi)的多種系列細(xì)胞分化[6,7]。另外與BMSCs相比，hAMSCs具有來源豐富、獲取無創(chuàng)和更強(qiáng)的分泌和免疫調(diào)節(jié)能力等諸多優(yōu)點(diǎn)。最近，報道hAMSCs具有長效的免疫調(diào)節(jié)和提高阿爾茨海默病小鼠認(rèn)知功能[8]。另外，移植hAMSCs能減輕卒中大鼠行為神經(jīng)功能障礙[9]。目前尚少有研究調(diào)查hAMSCs對腦出血的治療效應(yīng)。因此本研究致力于調(diào)查是否顱內(nèi)移植hAMSCs能促進(jìn)腦出血大鼠的功能恢復(fù)并探索其可能的作用機(jī)制。

材料與方法

一、分離hAMSCs和細(xì)胞培養(yǎng)

胎盤取自6位剖宮產(chǎn)健康孕婦，并與她們簽訂知情同意書。后續(xù)處理過程經(jīng)陸軍總醫(yī)院倫理委員會知情同意。參照改進(jìn)的文獻(xiàn)報道分離hAMSCs方法，簡述如下：把羊膜從絨毛膜上鈍性分離下來后，用含有1%青霉素/鏈霉素的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）反復(fù)沖洗去除血液和污物后，用0.25%胰蛋白酶消化30 min后，在顯微鏡下用細(xì)胞刮輕輕刮去羊膜上皮層，剩下的組織用眼科剪剪成碎片后用1%Ⅱ型膠原酶37℃消化60 min。獲取的細(xì)胞培養(yǎng)在添加10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。人皮膚成纖維細(xì)胞（Fibroblasts）購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院。

二、流式細(xì)胞分析

第5代hAMSCs與CD34、CD105、CD19、CD29、CD44、CD45、CD90和CD166抗體反應(yīng)。所有的抗體購自BD公司，細(xì)胞熒光通過流式細(xì)胞儀檢測。

三、動物和實驗分組

138只雄性Wistar大鼠[體質(zhì)量（240～260）g]購自北京維通利華公司。大鼠分為Fibroblasts治療組（46只），PBS治療組（46只）和hAMSCs治療組（46只）。

四、建立大鼠腦出血模型

所有的手術(shù)過程遵循相關(guān)動物管理條例，腦出血模型通過顱內(nèi)立體定向注射Ⅶ膠原酶制作。大鼠麻醉后固定在立體定向儀框架上，用顱鉆鉆孔，1 μl無菌PBS包含0.5 U膠原酶用微量泵緩慢注入顱內(nèi)（前囟后0.2 mm，硬膜下6.0 mm，中線旁開3.0 mm）。鉆孔用骨蠟封閉，縫合皮膚切口。

五、細(xì)胞移植

顱內(nèi)出血 （intracerebral hemorrhage，ICH）1 d后，包含5×105個hAMSCs或Fibroblasts的10 μl PBS分別移植到hAMSCs組或Fibroblasts組大鼠腦出血旁區(qū)域（前囟后0.2 mm，硬膜下3.5 mm，中線旁開3.0 mm），等量不含細(xì)胞的PBS注射在PBS組大鼠。為了標(biāo)記增殖的細(xì)胞，所有的大鼠從ICH 1 d后開始每天腹腔注射BrdU（50 mg/kg）并持續(xù)13 d。

六、神經(jīng)功能評估

用改良神經(jīng)功能評分 （modified neurological severity score，mNSS）評估大鼠神經(jīng)功能，由2名不了解實驗分組的研究員分別在1、7、14、21和28 d時進(jìn)行測試。

七、免疫熒光染色和組織病理學(xué)

在腦出血3 d或14 d，大鼠經(jīng)灌注固定后，取出腦組織，然后固定，脫水后切成片厚10 μm的冠狀腦片。對于免疫熒光染色，切片加一抗為：大鼠anti-BrdU，兔anti-DCX，兔血管假性血友病因子/血管性血友病因子抗體 （anti-von willebrand factor，antivWF），兔膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗體和兔抗βIII微管蛋白（Tuj1）。一抗4℃孵育過夜后，用PBS沖洗后，加相應(yīng)的熒光二抗室溫孵育2 h。對于BrdU和DCX雙標(biāo)染色，切片預(yù)先在37℃的2 N鹽酸溶液中孵育30 min。圖片用共聚焦熒光顯微鏡拍攝，用Image J軟件進(jìn)行分析。

八、ELISA分析

為了測量因子表達(dá)水平，在腦出血后7、14、21和28 d，提取損傷側(cè)大腦半球在PBS中勻漿，4℃離心1 000 r/min，上清液用酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（R&D Systems）檢測腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）含量。

九、統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)分析由SPSS13.0完成。實驗結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。行為學(xué)數(shù)據(jù)和因子水平定量分析用重復(fù)測量的ANOVA，其它數(shù)據(jù)用單向ANOVA進(jìn)行分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、hAMSCs的特性

P5代hAMSCs生長良好并呈成纖維樣細(xì)胞形態(tài) （圖1）。流式細(xì)胞儀分析顯示hAMSCs表達(dá)CD29、CD44、CD90、CD105和CD166，不表達(dá)CD1、CD34和CD45（圖2）。

圖1 P5代人胎盤羊膜組織間充質(zhì)干細(xì)胞呈現(xiàn)典型的成纖維樣細(xì)胞形態(tài)

二、hAMSCs治療增加內(nèi)源性神經(jīng)再生

在 ICH后 14 d，hAMSCs組 Brdu+細(xì)胞數(shù)目（55.33±6.59）高于Fibroblasts組（26.66±3.58）和PBS組（25.50±2.90），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。雙標(biāo)染色Brdu和DCX結(jié)果顯示，hAMSCs組Brdu+/ DCX+細(xì)胞數(shù)目 （30.66±3.65）高于 Fibroblasts組（11.83±2.70）和PBS組（10.00±2.54），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），BrdU+細(xì)胞和BrdU+/DCX+細(xì)胞數(shù)目在Fibroblasts組和PBS組差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）（圖3A、3B）。這些結(jié)果表明hAMSCs治療能增加腦室下區(qū)（subventricular zone，SVZ）神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化。

圖2 人胎盤羊膜組織間充質(zhì)干細(xì)胞的流式細(xì)胞儀鑒定

三、hAMSCs治療促進(jìn)血管再生

為了調(diào)查是否hAMSCs治療能促進(jìn)血管再生，腦切片用染色并定量分析腦出血灶旁血管密度 （圖3C），結(jié)果顯示在ICH后14 d，hAMSCs組vWF+血管數(shù)目（67.50±6.76）/mm2高于Fibroblasts組（31.66±6.33）/mm2和PBS組（28.83±5.58）/mm2，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），在 Fibroblasts組和 PBS組 vWF+血管數(shù)目比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖3D）。

四、hAMSCs體內(nèi)存活與分化

移植的hAMSCs在體內(nèi)最少存活27 d，大部分細(xì)胞分布在出血灶旁區(qū)域。相反在Fibroblasts組，移植的Fibroblasts并不能檢測到，提示移植的Fibroblasts在27 d內(nèi)被從宿主腦內(nèi)剔除。在ICH后28 d，雙標(biāo)染色結(jié)果顯示移植的hAMSCs并不能向神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞分化（圖4A）。

五、hAMSCs治療增加BDNF和VEGF表達(dá)水平

用ELISA試劑盒檢測ICH后7、14、21和28 d大鼠BDNF和VEGF表達(dá)水平，結(jié)果顯示在ICH后7 d和14 d，hAMSCs組BDNF表達(dá)水平 [（63.16±2.31)pg/mg，（38.57±3.69)pg/mg]高于Fibroblasts組[（46.18±2.45)pg/mg，（20.52±2.81)pg/mg]和PBS組[（43.18±2.30)pg/mg，（18.28±2.39)pg/mg]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05)（圖4B)。在ICH后7、14和21 d，hAMSCs組VEGF表達(dá)水平 [（43.32±3.65)pg/mg，（30.90±2.62)pg/mg，（24.89±2.85)pg/mg]高于Fibroblasts組[（22.88±2.62)pg/mg，（15.41±2.40)pg/mg，（10.57±1.54)pg/mg]和PBS組[（20.81±3.06)pg/mg，（14.44±2.32)pg/mg，（11.42±1.48)pg/mg]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05)（圖4C)。在任何時間點(diǎn)Fibroblasts和PBS組BDNF和VEGF水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05)。

六、hAMSCs治療促進(jìn)運(yùn)動功能恢復(fù)

為了評估hAMSCs治療是否能促進(jìn)腦出血大鼠運(yùn)動功能恢復(fù)，用mNSS評估大鼠在ICH后1、7、14、21和28 d運(yùn)動神經(jīng)功能。結(jié)果顯示在治療前，hAMSCs組、Fibroblasts組和PBS組mNSS評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05)，然而，從ICH后7 d開始持續(xù)到28 d，與Fibroblasts組和PBS組相比，hAMSCs組 mNSS評分更高。在任何時間點(diǎn)Fibroblasts組和PBS組mNSS評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05)（圖4D)。

圖3 人胎盤羊膜組織的間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)神經(jīng)再生和血管再生

討論

目前的研究結(jié)果顯示hAMSCs治療能夠增加損傷腦營養(yǎng)因子BDNF和VEGF的表達(dá)水平，增加SVZ神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化，促進(jìn)出血灶旁血管再生，最終促進(jìn)腦出血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。

圖4 人胎盤羊膜組織的間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)分化及提高運(yùn)動功能

體內(nèi)研究結(jié)果顯示移植的hAMSCs在損傷腦內(nèi)存活至少27 d，然而移植的Fibroblasts在這個時間點(diǎn)并不能檢測到，表明hAMSCs在體內(nèi)具有良好的免疫耐受性。盡管一些研究組報道MSCs在體內(nèi)能向神經(jīng)細(xì)胞分化，但是這些細(xì)胞是否能真正分化為神經(jīng)系列細(xì)胞，目前還存在廣泛爭議[10-11]。在體內(nèi)，筆者并沒有找到hAMSCs向神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞分化的證據(jù)，這些發(fā)現(xiàn)結(jié)合移植的hAMSCs促進(jìn)腦出血大鼠早期功能恢復(fù)，說明hAMSCs起作用并不是通過細(xì)胞替代而是通過其它的途徑。

神經(jīng)再生和血管再生可能是hAMSCs治療起作用的重要機(jī)制。各種損傷包括腦出血能誘導(dǎo)神經(jīng)再生，其能促進(jìn)損傷修復(fù)和促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[12]。因此，增強(qiáng)神經(jīng)再生是ICH治療的一個重要目標(biāo)，在目前的研究中發(fā)現(xiàn)與Fibroblasts組和PBS組相比，hAMSCs治療增加SVZ的BrdU+細(xì)胞和BrdU+/DCX+細(xì)胞數(shù)目，表明hAMSCs能促進(jìn)神經(jīng)再生。hAMSCs治療促進(jìn)神經(jīng)再生的原因可能是通過分泌營養(yǎng)因子，眾所周知MSCs在體內(nèi)體外能產(chǎn)生和分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子。BDNF和促血管再生因子VEGF是兩個重要的營養(yǎng)因子能促進(jìn)神經(jīng)再生[13-14]。在本研究中發(fā)現(xiàn)與Fibroblasts組和PBS組相比，hAMSCs治療增加受損腦BDNF和VEGF的表達(dá)水平。通過增加BDNF和VEGF表達(dá)，hAMSCs因此促進(jìn)神經(jīng)再生。另外本研究也發(fā)現(xiàn)與Fibroblasts組和PBS組相比，hAMSCs治療增加腦出血灶旁vWF+血管數(shù)目。該結(jié)果并不奇怪，有文獻(xiàn)報道hAMSCs具有強(qiáng)大的促血管再生能力，能分泌包括VEGF在內(nèi)的多種促血管生成因子。移植hAMSCs能促進(jìn)多種疾病血管再生，比如后肢缺血[15]。

總之，本研究結(jié)果表明hAMSCs治療能促進(jìn)腦出血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，其可能是通過增加營養(yǎng)因子的表達(dá)，增強(qiáng)內(nèi)源性神經(jīng)再生和血管再生起作用。該結(jié)果也為未來臨床應(yīng)用hAMSCs治療ICH提供了理論基礎(chǔ)。

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Transplantation of human amniotic mesenchymal stem cells promotes neurological recovery in an intracerebral hemorrhage rat model

Zhou Honglong1,Zhang Hongri1,Yan Zhongjie2,Xu Ruxiang1.1Affiliated Bayi Brain Hospital,The PLA Army General Hospital,Beijing 100700,China;2Department of Neurosurgery,The Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000,China

ObjectiveWe assessed whether transplantation of human amniotic mesenchymal stem cells (hAMSCs)promotes neurological recovery in an intracerebral hemorrhage rat model.In addition,the potential mechanisms underlying the possible benefits of this therapy were investigated.MethodsA total of 138 male Wistar rats were divided into fibroblasts group,phosphate-buffered saline (PBS)group and hAMSCs group(n=46).The intracerebral hemorrhage (ICH)models were induced by intrastriatal injection of VII collagenase and then intracerebrally administered hAMSCs,Fibroblasts,orPBS at 24 h after ICH.hAMSCs were characterized using flow cytometry.Immunohistochemistry were performed to assay differentiation,angiogenesis and neurogenesis.The expressions of brain-derived neurotrophic factor(BDNF)and vascular endothelial growth factor(VEGF)were analyzed by ELISA. Neurological function was assessed with the modified neurological severity score (mNSS).ResultshAMSCs displayed a fibroblast-like morphology,were positive for CD29,CD44,CD90,CD105,and CD166,and negative for CD19,CD34,and CD45.From 7 d after ICH,mNSS scores of the hAMSCs group were significantly higher than that of PBS group and Fibroblasts group(P＜0.05).Fourteen days after ICH,the number of Brdu+cells in the hAMSCs group (55.33±6.59)was significantly higher than that in PBS group(25.50±2.90)and Fibroblasts group(26.66±3.58)(P＜0.05).The number of Brdu+/DCX+cells(30.66±3.65)in the hAMSCs group was significantly higher than that in PBS group (10.00±2.54) and fibroblasts group(11.83±2.70)(P＜0.05).The number of von Willebrand factor(vWF+)blood vessels [(67.50±6.76)/mm2]in the hAMSCs group was significantly higher than that in PBS group [(28.83±5.58)/ mm2]and Fibroblasts group [(31.66±6.33)/mm2](P＜0.05).Seven and fourteen days after ICH,the levels of BDNF[(63.16±2.31)pg/mg,(38.57±3.69)pg/mg]of the hAMSCs group were significantly higher than that of PBS group[(43.18±2.30)pg/mg,(18.28±2.39)pg/mg]and Fibroblasts group[(46.18±2.45)pg/mg, (20.52±2.81)pg/mg](P＜0.05).Seven,fourteen and twenty-one days after ICH,the levels of VEGF [(43.32±3.65)pg/mg,(30.90±2.62)pg/mg,(24.89±2.85)pg/mg]of the hAMSCs group were significantly higher than that of PBS group [(20.81±3.06)pg/mg,(14.44±2.32)pg/mg,(11.42±1.48)pg/mg]and Fibroblasts group [(22.88±2.62)pg/mg,(15.41±2.40)pg/mg,(10.57±1.54)pg/mg].The transplanted hAMSCs survived for at least 27 d and were negative for fi-tubulinⅢand glial fibrillary acidic protein.ConclusionhAMSCs treatment significantly promotes neurological recovery in rats after ICH.The mechanism of action could be mediated by increasing neurotrophic factor expression,and promotion of neurogenesis and angiogenesis.Thus,hAMSCs are candidate stem cells for the treatment of ICH.

Mesenchymalstem cells; Human amniotic; Intracerebralhemorrhage; Transplantation;Neurological recovery

2016-11-14）

（本文編輯：張麗）

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2017.01.009

全軍醫(yī)藥科技“十二五”重點(diǎn)項目（BWS11J002；BWS12J010）；國家自然科學(xué)基金（81401032）

100700 北京，陸軍總醫(yī)院附屬八一腦科醫(yī)院1；050000 石家莊，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科2

徐如祥，Email：jzxuruxiang@163.com

周洪龍,張鴻日,閆中杰,等.移植人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)腦出血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)[J/CD].中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志, 2017,3(1):033-039.