花生栽培種與野生種(Arachis oteroi)人工雜交雙二倍體的創(chuàng)制和鑒定

李麗娜杜 培付留洋劉 華徐 靜秦 利嚴 玫韓鎖義黃冰艷董文召湯豐收張新友,*

1河南科技大學農(nóng)學院, 河南洛陽471023;2河南省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所 / 農(nóng)業(yè)部黃淮海油料作物重點實驗室 / 河南省油料作物遺傳改良重點實驗室, 河南鄭州450002;3鄭州大學生命科學學院, 河南鄭州450001

花生栽培種與野生種(Arachis oteroi)人工雜交雙二倍體的創(chuàng)制和鑒定

李麗娜1,2,**杜 培2,**付留洋2,3劉 華2徐 靜2秦 利2嚴 玫2韓鎖義2黃冰艷2董文召2湯豐收2張新友2,*

1河南科技大學農(nóng)學院, 河南洛陽471023;2河南省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所 / 農(nóng)業(yè)部黃淮海油料作物重點實驗室 / 河南省油料作物遺傳改良重點實驗室, 河南鄭州450002;3鄭州大學生命科學學院, 河南鄭州450001

花生野生種是改良花生栽培種的重要基因資源。為了利用野生花生的抗性基因, 本研究利用花生栽培品種豫花9331與二倍體野生種A. oteroi人工雜交, 借助胚拯救和染色體秋水仙素加倍, 創(chuàng)制一個雙二倍體雜種AmE-4, 并利用熒光原位雜交和分子標記技術(shù)準確鑒定了該雙二倍體。觀察結(jié)果表明, AmE-4的葉片與豫花9331存在顯著差異, 而主莖高、側(cè)枝長和總分枝數(shù)等性狀與豫花9331差異不顯著。AmE-4開花期較豫花9331推遲60 d, 結(jié)實性與莢果發(fā)育狀況較差, 不利于AmE-4的育種利用。同時, 開發(fā)了57個追蹤AmE-4中A. oteroi染色體的顯性或共顯性SSR標記, 為創(chuàng)制和鑒定花生栽培種A. oteroi易位系或漸滲系奠定分子基礎(chǔ)。

花生; 雙二倍體; 花生野生種; 分子標記; 熒光原位雜交

栽培種花生(Arachis hypogaea L., 2n = 4x = AABB)是世界主要的油料、經(jīng)濟作物, 也是人類所需的重要植物蛋白來源。然而長期的栽培和人工馴化導致花生栽培品種遺傳多樣性降低, 嚴重影響花生的育種效率。花生野生種具有栽培種不具備的優(yōu)良性狀。國際半干旱熱帶地區(qū)作物研究所(ICRISAT)、美國、中國等的研究表明, 野生花生中存在豐富的葉斑病、銹病、線蟲病、病毒病等抗源和高含油量等優(yōu)質(zhì)性狀, 而且對葉斑病和銹病的抗性機制與栽培種花生有所不同, 是改良花生栽培種的重要基因資源[1-4]。

花生栽培種和多數(shù)野生種雜交成功率很低, 較難用于育種。栽培種除與花生組(Section Arachis)內(nèi)野生種雜交表現(xiàn)出一定的親和性外, 由于激素代謝的失衡導致種間雜種胚胎的敗育, 與其他近緣野生種雜交大多表現(xiàn)不親和、弱親和或雜種胚敗育(夭亡)[5-6]。目前克服這些問題和利用野生花生種有: 野生同源四倍體途徑(二倍體野生種經(jīng)人工染色體加倍形成)[7]、野生異源四倍體途徑(二倍體野生種之間雜交并經(jīng)染色體加倍形成的雙二倍體)[8]和三倍體-六倍體途徑(栽培種與二倍體野生種雜交并經(jīng)染色體加倍形成異源六倍體)等[9]。其中三倍體-六倍體途徑是應(yīng)用最多的方法, 該方法通過栽培種與野生二倍體種雜交與必要的胚拯救等技術(shù), 獲得育性低甚至完全不育的種間雜種F1(2n = 3x)[10], 經(jīng)過自然加倍或秋水仙堿處理加倍, 獲得六倍體花生(2n = 6x, 即雙二倍體), 直接將野生種的整套染色質(zhì)導入到雙二倍體中。雙二倍體花生染色體遺傳相對穩(wěn)定, 更容易與栽培親本回交獲得后代, 并通過染色體交換將外源染色體易位或漸滲到栽培種中。目前,利用這種途徑創(chuàng)制的聚合了優(yōu)良農(nóng)藝性狀的栽、野種間雜交衍生系已被報道[11-12], 如利用栽培品種白沙 1016與二倍體野生種A. diogoi雜交育成的遠雜9102, 具有高抗青枯病、耐逆、高固氮效率、適應(yīng)性廣等突出特點, 是目前我國珍珠豆型花生的主栽品種[13]。此外, 栽培種與 A. glabrata的衍生系對花生芽壞死表現(xiàn)高抗性[14], 與 A. kretschmeri衍生系抗網(wǎng)斑病[15], 與A. cardenasii衍生系抗根結(jié)線蟲病和晚斑病等[16-17], 顯示了野生花生基因資源在栽培種改良中的巨大利用潛力。

A. oteroi是河南省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所從中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所引進的野生花生種質(zhì), 具有含油量高、中抗根結(jié)線蟲病等優(yōu)良特征, 是改良花生的重要基因資源[4,18]。本研究擬通過花生品種豫花 9331與野生種A. oteroi人工雜交獲得雙二倍體雜種, 對該雙二倍體表型分析和分子標記篩選, 旨在創(chuàng)制育種的中間材料,以開拓野生種在育種中應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以栽培種品種豫花 9331為母本(2n = 4x = 40, AABB)、二倍體野生種A. oteroi為父本(2n = 2x = 20)進行種間雜交。其中豫花9331為河南省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所選育保存, A. oteroi由中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所引進。SSR分子標記引物由華大基因(深圳, 中國)合成, 序列分別來自 He等[19]、Moretzsohn等[20]、Palmieri等[21]、Ferguson等[22]和山東省農(nóng)業(yè)科學院王興軍研究員。

1.2 種間雜交與雜種F1胚拯救

雜交技術(shù)同常規(guī)有性雜交, 于生育后期從母本植株上收獲雜交莢果, 在無菌條件下用 5%的次氯酸鈉對莢果表面消毒, 然后打開莢果果殼, 將幼胚接種到由MS+0.075 mg L-1IAA (3-吲哚乙酸)+0.01 mg L-1Kn (激動素)+5%蔗糖組成的固體培養(yǎng)基上, 于25℃、18 h/6 h光暗交替條件下培養(yǎng), 幼胚發(fā)育成苗后將幼苗轉(zhuǎn)移至由 MS、0.8 mg L-1NAA和3%蔗糖組成的固體生根培養(yǎng)基上培養(yǎng),直至形成根莖葉完整的種間雜種F1植株。

1.3 雜種F1植株染色體加倍與表型鑒定

在無菌條件下將 F1組培苗從頂端數(shù)第3片葉下切開,取頂芽部分, 將其置 MS+0.1 mg L-1NAA+0.4 mg L-16-BA+3%蔗糖+0.05%秋水仙素固體培養(yǎng)基上, 在25℃恒溫光照培養(yǎng)間中誘導芽分化。約14 d后, 把苗轉(zhuǎn)移到MS+0.8 mg L-1NAA+3%蔗糖固體生根培養(yǎng)基, 培養(yǎng)15～30 d, 直至形成完整植株S0, 然后移栽于生長池中。S0成株后部分枝條能夠產(chǎn)生果針, 觀察統(tǒng)計 S0有果針枝條(雙二倍體枝條)與無果針枝條(三倍體枝條)花粉育性。具體方法是 S0開花盛期取每種枝條兩朵花, 用1%醋酸洋紅染色, 在顯微鏡下觀察, 統(tǒng)計每朵花5個視野的可育與不育花粉粒數(shù), 花粉活力(%) = 可育花粉數(shù)/(可育花粉數(shù)+不育花粉數(shù)) × 100%[23]。待S0莢果成熟后, 取莢果, 用5%的次氯酸鈉消毒, 再將種子接到1/2 MS+5%蔗糖固體培養(yǎng)基上, 置于25℃恒溫光照培養(yǎng)間培養(yǎng), 直至發(fā)育成幼苗S1(AmE-4)。經(jīng)過組織培養(yǎng)擴繁后, 次年移栽于花盆或生長池中, 并同時種植豫花9331。生育期內(nèi)對豫花9331和 AmE-4各4株進行表型性狀調(diào)查, 始花期記錄第一朵花開花日期, 成熟期調(diào)查株型、總分枝數(shù)、葉柄長、主莖第四片葉上部小葉長和寬、主莖高和側(cè)枝長等性狀。

1.4 熒光原位雜交

參照杜培等[24]根尖細胞中期染色體制片的方法。基因組熒光原位雜交是采用CTAB法提取A. oteroi全基因組DNA, 以缺刻平移法將綠色熒光素(Fluorescein-12-dUTP)標記到A. oteroi全基因組DNA上, 以栽培品種豫花9331基因組DNA為封阻(封阻與探針濃度比例約為1∶50)。雜交液含去離子甲酰胺 7.5 μL, 20× SSC (0.015 mol L-1C6H5Na3O7·2H2O-0.15 mol L-1NaCl) 1.5 μL, 探針2.5 μL,封阻1 μL, 鮭魚精DNA 0.5 μL, 50%硫酸葡聚糖2 μL, 103℃變性 13 min, 立即將雜交液離心管置-20℃的 100%無水乙醇浴10 min; 染色體制片以70%甲酰胺78℃變性70 s后立即置-20℃的70%、95%和100%無水乙醇中梯度脫水各5 min, 氣干。滴加雜交液, 蓋上蓋玻片, 37℃雜交至少6 h。采用42℃水浴在2×SSC中洗片10 min, 50%甲酰胺洗5 min, 再2×SSC 10 min洗2次, 然后用DAPI染色, LeicaDM6000熒光顯微鏡觀察照相。5S rDNA和 45S rDNA原位雜交雜交程序同上, 不同的是5S rDNA和45S rDNA分別用Biotin-16-dUTP和Digoxigenin-11-dUTP標記, 再分別用 Anti-Biotin-FITC 和 Anti-Digoxigenin-Rhodamine檢測。

1.5 分子標記分析及篩選

采用已獲得的豫花9331和A. oteroi共顯性SSR標記E420 (F: 5′-TCCATCGTTAGTGGCACTGT-3′; R: GTCGA CTCCTGCCCAATCTA-3′)和 B051 (F: 5′-TACAGCATTG CCTTCTGGTG-3′; R: 5′-CCTGGGCTGGGGTATTATTT-3′)鑒定 AmE-4, 再利用 840對 SSR標記對豫花 9331、A. oteroi和AmE-4進行PCR擴增和標記篩選, 用于特異追蹤外源染色體。PCR體系為10 μL, 包括模板基因組DNA 0.9 μL (25 ng mL-1), 10 μmol L-1SSR上下游引物各0.2 μL, 10×緩沖液1 μL, dNTPs (2.5 mmol L-1) 0.9 μL, MgCl2(25 mmol L-1) 0.8 μL, Taqase 0.1 μL (0.5 U), ddH2O 5.9 μL。PCR擴增程序為94℃預變性3 min; 94℃變性30 s; 55℃退火45 s; 72℃延伸1.2 min; 33個循環(huán)后72℃延伸10 min;反應(yīng)結(jié)束以后聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 種間雜種F1及其雙二倍體的獲得

豫花9331與A. oteroi人工雜交后, 獲得17個莢果、20枚胚珠, 將胚珠解剖后進行胚拯救, 待F1成苗后觀察根尖細胞中期染色體, 最終獲得12株(E-1～E-12)染色體數(shù)為30條的種間雜種F1植株(2n = 3x = 30)。然后對E-1～E-5試管苗進行染色體加倍處理, 組培苗出現(xiàn)明顯的中毒癥狀(如葉子卷曲, 部分葉黃萎等), 約14 d后轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基,最終獲得植株S0。

對F1和S0花粉育性觀察結(jié)果顯示, 雜種F1和S0上無果針枝條的花粉活力分別為1.03%和1.48%, 均表現(xiàn)高度不育, 而 S0上有果針枝條花粉活力為 62.67%, 花粉活力大幅度提高(表1, 圖1-A、1-B)。生育后期收獲時, 發(fā)現(xiàn)5株S0中有1株(E-4)結(jié)實, 占20%。E-4莢果經(jīng)1/2MS+5%蔗糖固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后獲得幼苗S1(AmE-4)。

表1 豫花9331與A. oteroi雜種F1和S0的花粉活力Table 1 Pollen viability of S0and interspecific hybrid F1of Yuhua 9331 and A. oteroi

圖1 S0有果針枝(A)和無果針枝(B)花的花粉染色Fig. 1 Pollen staining from flowers in branches with (A) and without pegs (B)黃色箭頭所示為可育花粉粒, 藍色箭頭所示為不育花粉粒。Yellow arrows show fertile pollens and blue arrows show sterile pollens.

2.2 雙二倍體的分子細胞學鑒定

利用已獲得的豫花9331和A. oteroi共顯性SSR標記E420對豫花9331、A. oteroi和AmE-4進行分析, 發(fā)現(xiàn)在豫花9331上約450 bp和330 bp處有特異擴增條帶, 父本A. oteroi在約160 bp處有特異條帶, 而AmE-4在450、330和 160 bp處均有特異條帶(圖 2), 說明異源六倍體花生AmE-4同時包含了豫花9331和A. oteroi的遺傳物質(zhì), 用SSR標記B051也顯示了同樣的結(jié)果。

為了識別大隨體染色體, 準確鑒定豫花 9331和 A. oteroi染色體數(shù)目, 以5S rDNA和45S rDNA為探針對豫花9331和A. oteroi進行FISH分析和DAPI染色, 發(fā)現(xiàn)豫花9331與A. oteroi各有1對“大隨體染色體”(圖3-B、3-D), 染色體數(shù)分別是40和20 (圖3-A、3-C), 而AmE-4染色體數(shù)為60條, 是豫花9331與A. oteroi全部染色體組數(shù)目總和(圖3-E)。A. oteroi染色體組與栽培花生的A染色體組類似, 都存在明顯的著絲粒DAPI帶和1對小染色體(圖3-A、3-C), 顯示A染色體組特征[25]。進一步利用A. oteroi基因組熒光原位雜交分析, 發(fā)現(xiàn) AmE-4有20條染色體顯示出明亮的雜交信號, 12條顯示弱的雜交信號(圖3-F), 并且有雜交信號的染色體均有明亮的DAPI帶, 顯示A染色體組特征, 這說明 A. oteroi基因組探針除了與 AmE-4中A. oteroi的全部染色體雜交外, 也與豫花9331的部分A染色體組產(chǎn)生了交叉信號。

圖2 SSR標記E420在豫花9331、A. oteroi和AmE-4中的擴增結(jié)果Fig. 2 PCR amplification pattern of SSR E420 in Yuhua 9331, A. oteroi and AmE-4 (M: marker)

圖3 豫花9331、A. oteroi和AmE-4熒光原位雜交Fig. 3 Fluorescence in situ hybridization of Yuhua 9331, A. oteroi and AmE-4A～B: 豫花9331 DAPI染色及45S rDNA (紅)和5S rDNA (綠)探針熒光原位雜交; C～D: A. oteroi DAPI染色及45S rDNA (紅)和5S rDNA (綠)探針熒光原位雜交; E～F: AmE-4 DAPI染色和A.oteroi全基因組探針原位雜交。紅色箭頭所示為小染色體, 白色箭頭所示為“大隨體染色體”; F圖中的白色*表示強基因組雜交信號的染色體, F圖中的紅色+表示弱基因組雜交信號的染色體。A-B: DAPI staining and FISH of Yuhua9331 with 45S rDNA (red) and 5S rDNA (green) probes; C-D: DAPI staining and FISH of A. oteroi with 45S rDNA (red) and 5S rDNA (green) probes; E-F: DAPI staining and GISH of AmE-4 with A. oteroi total genomic DNA probes. Red arrows show the small chromosomes, white arrows show “the big SAT-chromosomes”; * show chromosomes with strong signals of A. oteroi total genomic DNA probes, and + show chromosomes with weak signals of A. oteroi total genomic DNA probes in Fig. F.

2.3 雙二倍體特異分子標記篩選

利用840對SSR引物對豫花9331、A. oteroi和雙二倍體AmE-4分析, 共獲得57個標記能特異追蹤雙二倍體中A. oteroi的染色體(片段), 占6.8%, 其中共顯性標記46個, 顯性標記11個(表2)。

2.4 雙二倍體的植物學性狀觀察

為了進一步了解豫花9331-A. oteroi雙二倍體AmE-4的遺傳特性, 本研究對盆栽豫花9331和雙二倍體AmE-4的始花期、株型、生育后期主莖葉葉柄長、葉長、葉寬、主莖高、側(cè)枝長和總分枝數(shù)進行調(diào)查分析, 結(jié)果表明, 豫花9331為直立型, A. oteroi為蔓生型, AmE-4為半直立型(圖4-A), AmE-4較豫花9331始花期約延遲60 d, 開花后AmE-4能正常下針, 但結(jié)實性差, 莢果發(fā)育不良, 飽滿度差。AmE-4葉片濃綠, 葉片明顯加厚且向背面稍翻, 葉柄長、主莖葉長和葉寬與豫花 9331差異顯著(圖 4-B), 而在主莖高、側(cè)枝長和總分枝數(shù)上與豫花9331差異不顯著(表3)。

3 討論

在自然條件下利用 0.2%的秋水仙素溶液浸潤種間雜種 F1的幼苗生長點是花生染色體加倍的常用方法[26], 利用該方法成功獲得了栽培種與 A. cardenasii[27]、A. chacoense[28]的雙二倍體雜種。然而利用上述方法處理豫花9331-A. oteroi種間雜種F1, 未能獲得雙二倍體。本研究探索了新的處理方法, 即利用MS+0.1 mg L-1NAA+0.4 mg L-16-BA+3%蔗糖+0.05%秋水仙素固體培養(yǎng)基培養(yǎng)雜種 F1組培苗的上部莖段, 根據(jù)組培材料受秋水仙素毒害情況確定處理時間, 最終獲得了雙二倍體AmE-4。本方法較秋水仙素浸潤生長點的傳統(tǒng)方法具有很多優(yōu)勢, 如處理不受自然條件限制, 處理完成后可以通過組織培養(yǎng)擴繁處理材料, 處理時間可以因幼苗長勢靈活調(diào)整等。有研究者認為, 在培養(yǎng)基中秋水仙素和 6-BA (促進組培苗細胞分裂與芽分化)的共同作用下, 可以明顯提高染色體加倍變異率[29]。而且, 利用此方法我們還獲得了栽培種與A. macedoi和A. duranensis等的雙二倍體(未發(fā)表)。

以往花生種間雜種染色體研究多采用常規(guī)染色的方法[14,30], 然而Seijo等[31]認為花生栽培種和野生種中包含一對或幾對“大隨體染色體”, 通常情況下這對染色體次縊痕位置容易被拉伸, 使隨體和染色體臂離得很遠。因此這種方法不能有效識別“大隨體染色體”, 也不能區(qū)分雜種后代中栽培種與野生種的染色體組。本研究首先利用5S rDNA和45S rDNA探針識別“大隨體染色體”, 確定栽培種和野生種染色體數(shù), 進而準確計數(shù)雜種后代染色體。又利用基因組原位雜交和DAPI染色識別AmE-4中包含的A. oteroi染色體組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)A. oteroi染色體組與栽培種A染色體組類似, 都具有明亮的染色體DAPI著絲粒帶和小染色體, 而不同于B染色體組的沒有或弱的DAPI帶[32]。當以A. oteroi全基因組DNA為探針與AmE-4染色體雜交時, 來自栽培種的A染色體組也顯示了弱的雜交信號, 表明A. oteroi染色體組與栽培種的A染色體組有較近的親緣關(guān)系, 至少明顯比B染色體組近。根據(jù)分類, A. oteroi為直立區(qū)組(Er)野生種[33], 其染色組不同于花生區(qū)組 A、B染色組, 本研究的結(jié)論顯然與以往的報道不一致, 這可能是所用A. oteroi的來源不同所致; 也可能由于以往的研究主要基于染色體形態(tài)的觀察, 并沒有反應(yīng)出2個染色體組在分子水平上相似程度, 因而不夠可靠。二倍體野生種 A. oteroi除了具有高含油量和抗根結(jié)線蟲病等性狀外[4,18], 我們發(fā)現(xiàn)它還具有較強的葉斑病和銹病抗性。然而由于A. oteroi在河南原陽生態(tài)條件下不結(jié)實, 缺少足夠的實生苗進行系統(tǒng)的抗病性研究, 雙二倍體AmE-4的合成為我們下一步系統(tǒng)研究A. oteroi抗病等有利基因在栽培花生遺傳背景下表現(xiàn)提供了材料基礎(chǔ)。性狀觀察結(jié)果表明, AmE-4葉部性狀與豫花9331有明顯差異,其主莖高、側(cè)枝長和總分枝數(shù)等農(nóng)藝性狀與豫花9331差異不明顯, 株型與母本豫花9331更為接近; 而AmE-4開花期嚴重推遲, 結(jié)實性差, 莢果發(fā)育不良, 可能是由于河南 9月后光照溫度不能滿足其生長, 也可能是由于 A. oteroi與A染色體組親緣關(guān)系較近, 染色體加倍后容易形成復雜的多價體聯(lián)會進而影響染色體的穩(wěn)定性, 這些均不利于AmE-4的利用。為了能夠有效利用AmE-4中有利基因, 需要打破不良連鎖, 發(fā)展生產(chǎn)上具有利用價值的外源染色體補償性易位或漸滲系[34]。目前我們正進一步利用AmE-4與豫花9331雜交創(chuàng)制易位系或漸滲系。而分子標記是追蹤易位或漸滲片段的重要手段, 本研究開發(fā)的57個追蹤AmE-4中A. oteroi染色體的顯性或共顯性標記,將在今后 A. oteroi易位系或漸滲系鑒定過程中發(fā)揮重要作用。

表2 雙二倍體AmE-4中A. oteroi特異擴增分子標記Table 2 Dominant or co-dominant molecular markers of A. oteroi in AmE-4

(續(xù)表2)

圖4 雙二倍體AmE-4、豫花9331和A. oteroi的株型(A)和葉片形態(tài)(B)Fig. 4 Morphologies of plant (A) and leaves (B) of AmE-4, Yuhua 9331, and A. oteroi.

表3 雙二倍體AmE-4與豫花9331的農(nóng)藝性狀比較Table 3 Comparison of amphidiploid AmE-4 withYuhua 9331 in certain agronomic traits

References

[1] Stalker H T, Moss J P. Speciation, cytogenetics, and utilization of Arachis species. Adv Agron, 1987, 41: 1-40

[2] Holbrook C C, Stalker H T. Peanut breeding and genetic resources. Plant Breed Rev, 2003, 22: 297-356

[3] Mallikarjuna N, Jadhav D R, Reddy K, Husain F, Das K. Screening new Arachis amphidiploids and autotetraploids for resistance to late leaf spot by detached leaf technique. Eur J Plant Pathol, 2012, 132: 17-21

[4] 姜慧芳, 任小平, 黃家權(quán), 雷永, 廖伯壽. 野生花生脂肪酸組成的遺傳變異及遠緣雜交創(chuàng)造高油酸低棕櫚酸花生新種質(zhì).作物學報, 2009, 35: 25-32

Jiang H F, Ren X P, Huang J Q, Lei Y, Liao B S. Genetic variation of fatty acid components in Arachis species and development of interspecific hybrids with high oleic and low palmitic acids. Acta Agron Sin, 2009, 35: 25-32 (in Chinese with English abstract)

[5] Singh A K. Hybridization barriers among the species of Arachis L., namely of the sections Arachis (including the groundnut) and Erectoides. Genet Resour Crop Evol, 1998, 45: 41-45

[6] 張新友, 徐靜, 湯豐收, 董文召, 臧秀旺, 張忠信. 花生種間雜種胚胎發(fā)育及內(nèi)源激素變化. 作物學報, 2013, 39: 1127-1133

Zhang X Y, Xu J, Tang F S, Dong W Z, Zang X W, Zhang Z X. Embryonic development and changes of endogenous hormones in interspecific hybrids between peanut (A. hypogaea L.) and wild Arachis species. Acta Agron Sin, 2013, 39: 1127-1133 (in Chinese with English abstract)

[7] Mallikarjuna N, Senthilvel S, Hoisington D. Development of synthetic groundnuts (Arachis hypogaea L.) to broaden the genetic base of cultivated groundnut. Genet Resour Crop Evol, 2011, 58: 889-907

[8] Church G T, Starr J L, Simpson C E. A recessive gene for resistance to meloidogyne arenaria in interspecific Arachis spp. hybrids. Russ J Nematol, 2005, 37: 178-184

[9] 賀梁瓊, 熊發(fā)前, 鐘瑞春, 韓柱強, 李忠, 唐秀梅, 蔣菁, 唐榮華, 何新華. 利用SCoT標記分析花生栽培種 × A. chacoensis組合異源多倍化的早期基因組變化. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2013, 46: 1555-1563

He L Q, Xiong F Q, Zhong R C, Han Z Q, Li Z, Tang X M, Jiang J, Tang R H, He X H. Study on genome variations by using SCoT markers during allopolyploidization of the cultivated peanut × A. chacoensis. Sci Agric Sin, 2013, 46: 1555-1563 (in Chinese with English abstract)

[10] Ozias-Akins P, Singsit C, Branch W D. Interspecific hybrid inviability in crosses of Arachis hypogaea × A. stenosperma can be overcome by in vitro embryo maturation or somatic embryogenesis. J Plant Physiol, 1992, 140: 207-212

[11] Simpson C E, Starr J L. Registration of ‘COAN’ peanut. Crop Sci, 2001, 41: 918

[12] Tallury S P, Isleib T G, Stalker H T. Developing peanut cultivars with genetic resistance to early leafspot. In: Proceedings of the American Peanut Research and Educational Society, 2005. p 37

[13] 王興軍, 張新友. 花生生物技術(shù)研究. 北京: 科學出版社, 2015. p 22

Wang X J, Zhang X Y. Studies on Peanut Biotechnology. Beijing: Beijing Science Press, 2015. p 22

[14] Mallikarjuna N, Sastri D C. Morphological, cytological and disease resistance studies of the intersectional hybrid between Arachis hypogaea L. and A. glabrata Benth. Euphytica, 2002, 126: 161-167

[15] Mallikarjuna N, Hoisington D. Peanut improvement: production of fertile hybrids and backcross progeny between Arachis hypogaea and A. kretschmeri. Food Secur, 2009, 1: 457-462

[16] Stalker H T, Beute M K, Shew B B, Barker K R. Registration of two root-knot nematode-resistant peanut germplasm lines. Crop Sci, 2002, 42: 312-313

[17] Pasupuleti J, Ramaiah V, Rathore A, Rupakula A, Reddy R K, Waliyar F, Nigam S N. Genetic analysis of resistance to late leaf spot in interspecific groundnuts. Euphytica, 2013, 193: 13-25

[18] Sharma S B, Ansari M A, Varaprasad K S, Singh A K, Reddy L J. Resistance to Meloidogyne javanica in wild Arachis species. Genet Resour Crop Evol, 1999, 46: 557-568

[19] He G H, Meng R H, Newman M, Gao G Q, Pittman R N, Prakash C S. Microsatellites as DNA markers in cultivated peanut (Arachis hypogaea L.). BMC Plant Biol, 2003, 3: 1-6

[20] Moretzsohn M C, Leoi L, Proite K, Guimaraes P M, Leal-Bertioli S, Gimenes M A, Martins W S, Valls J F, Grattapaglia D, Bertioli D J. A microsatellite-based, gene-rich linkage map for the AA genome of Arachis (Fabaceae). Theor Appl Genet, 2005, 111: 1060-1071

[21] Palmieri D A, Bechara M D, Curi R A, Gimenes M A, Lopes C R. Novel polymorphic microsatellite markers in section Caulorrhizae (Arachis, Fabaceae). Mol Ecol, 2005, 5: 77-79

[22] Ferguson M E, Burow M D, Schulze S R, Bramel P J, Paterson A H, Kresovich S, Mitchell S. Microsatellite identification and characterization in peanut (A. hypogaea L.). Theor Appl Genet, 2004, 108: 1064-1070

[23] 范寶磊, 張耀兮, 吳仲珍, 岳霞麗, 索有瑞. 不同品系油菜花粉生活力測定方法比較. 安徽農(nóng)業(yè)科學, 2012, 40: 2596-2597

Fan B L, Zhang Y X, Wu Z Z, Yue X L, Suo Y R. Comparison of different determination methods of the pollen vitality of different lines rape. J Anhui Agric Sci, 2012, 40: 2596-2597 (in Chinese with English abstract)

[24] 杜培, 張新友, 李麗娜, 黃冰艷, 易明林, 董文召, 湯豐收. 高質(zhì)量花生根尖細胞染色體制片方法研究. 河南農(nóng)業(yè)科學, 2013, 42(3): 31-35

Du P, Zhang X Y, Li L N, Huang B Y, Yi M L, Dong W Z, Tang F S. Study on slide preparation methods for high quality chromosomes for root tip cell of Arachis. J Henan Agric Sci, 2013, 42(3): 31-35 (in Chinese with English abstract)

[25] Robledo G, Lavia G I, Seijo G. Species relations among wildArachis species with the A genome as revealed by FISH mapping of rDNA loci and heterochromatin detection. Theor Appl Genet, 2009, 118: 1295-1307

[26] Stalker H T, Wynne J C. Cytology of interspecific hybrid in section Arachis of peanut. Peanut Sci, 1979, 6: 110-114

[27] Stalker H.T. Utilizing Arachis cardenasii as a source of Cercospora leafspot resistance for peanut improvement. Euphytica, 1984, 33: 529-538

[28] Company M, Stalker H T, Wynne J C. Cytology and leafspot resistance in Arachis hypogaea × wild species hybrids. Euphytica, 1982, 31: 885-893

[29] 楊小明. 組織培養(yǎng)中秋水仙素誘導葡萄多倍體研究, 甘肅農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文, 甘肅蘭州, 2003. p 6

Yang X M. Studies on Polyploidy Grapevine Induction by Colchicine Treatment Through Tissue Culture. MS Thesis of Gansu Agricultural University, Lanzhou, China, 2003. p 6 (in Chinese with English abstract)

[30] Lavia G I, Ortiz A M, Fernández A. Karyotypic studies in wild germplasm of Arachis (Leguminosae). Genet Resour Crop Evol, 2009, 56: 755-764

[31] Seijo J G, Lavia G I, Fernández A, Krapovickas A, Ducasse D, Moscone E A. Physical mapping of 5S and 18S-25S rRNA genes by FISH as evidences that A. duranensis and A. ipaensis are the wild diploid species involved in the origin of A. hypogaea (Leguminosae). Am J Bot, 2004, 91: 1294-1303

[32] 杜培, 劉華, 李麗娜, 秦利, 張忠信, 黃冰艷, 董文召, 湯豐收,亓增軍, 張新友. 基于順序 GISH-FISH花生栽培種的染色體分析. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2015, 48: 1854-1863

Du P, Liu H, Li L N, Qin L, Zhang Z X, Huang B Y, Dong W Z, Tang F S, Qi Z J, Zhang X Y. Chromosome analysis of peanut (Arachis hypogaea L.) based on sequential GISH-FISH. Sci Agric Sin, 2015, 48: 1854-1863 (in Chinese with English abstract)

[33] Krapovickas A, Gregory W C. Taxonomia del genero Arachis (Leguminosae). Bonplandia, 1994, 8: 1-186

[34] Jiang J M, Friebe B, Gill B S. Recent advances in alien gene transfer in wheat. Euphytica, 1994, 73: 199-212

Development and Characterization of Amphidiploid Derived from Interspecific Cross between Cultivated Peanut and Its Wild Relative Arachis oteroi

LI Li-Na1,2,**, DU Pei2,**, FU Liu-Yang2,3, LIU Hua2, XU Jing2, QIN Li2, YAN Mei2, HAN Suo-Yi2, HUANG Bing-Yan2, DONG Wen-Zhao2, TANG Feng-Shou2, and ZHANG Xin-You2,*

1College of Agricultural, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China;2Industrial Crops Research Institute, Henan Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Oil Crops in Huanghuaihai Plains, Ministry of Agriculture / Henan Provincial Key Laboratory for Oil Crops Improvement, Zhengzhou 450002, China;3School of Life Sciences, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China

Wild Arachis species are important genetic resources. To introgress resistant genes of Arachis species, we developed a new amphidiploid AmE-4 through man-made cross between cultivated peanut variety Yuhua 9331 and a diploid Arachis species A. oteroi, with the assistance of following embryo rescue and chromosome doubling by colchicine treatment. AmE-4 was identified and characterized by fluorescence in situ hybridization (FISH) and SSR molecular marker. Morphological observation revealed significant differences in leaves between amphidiploid AmE-4 and Yuhua 9331, while the agronomic traits such as main stem height, length of first lateral branch and number of branches showed less difference between them. The date of first flower appearance in AmE-4 delayed sixty days compared with that in Yuhua 9331, and its pods setting and development were also poor, which would hinder its further utilization. In addition, 57 dominant or co-dominant SSR molecular markers were developed and could be used to identify translocation or introgression lines with A. oteroi chromosome fragment in future studies.

Peanut (Arachis hypogaea L.); Amphidiploid; Wild Arachis species; Molecular marker; FISH

10.3724/SP.J.1006.2017.00133

本研究由河南省重大科技專項(141100110600), 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-14)和河南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(S2012-5)資助。

This study was supported by the Major Technology Research and Development Program of Henan Province (141100110600), the China Agriculture Research System (CARS-14), and the Henan Provincial Agriculture Research System (S2012-05).

*通訊作者(Corresponding author): 張新友, E-mail: haasz@126.com, Tel: 0371-65729560**同等貢獻(Contributed equally to this work)

聯(lián)系方式: E-mail: lilina198283@163.com, Tel: 0371-65718247

稿日期): 2016-02-29; Accepted(接受日期): 2016-09-18; Published online(

日期): 2016-09-27.

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160927.0842.004.html