甘蔗獨(dú)腳金內(nèi)酯生物合成關(guān)鍵基因ScD27的克隆與表達(dá)分析

吳轉(zhuǎn)娣劉新龍劉家勇 昝逢剛 李旭娟 劉洪博 林秀琴陳學(xué)寬 蘇火生 趙培方 吳才文

云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所 / 云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 云南開(kāi)遠(yuǎn)661699

甘蔗獨(dú)腳金內(nèi)酯生物合成關(guān)鍵基因ScD27的克隆與表達(dá)分析

吳轉(zhuǎn)娣**劉新龍**劉家勇 昝逢剛 李旭娟 劉洪博 林秀琴陳學(xué)寬 蘇火生 趙培方 吳才文*

云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所 / 云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 云南開(kāi)遠(yuǎn)661699

獨(dú)腳金內(nèi)酯(strigolactones, SLs)是一類(lèi)新型植物激素, D27基因是獨(dú)腳金內(nèi)酯生物合成途徑中最上游的調(diào)控基因, 且該基因調(diào)控SLs的合成是一個(gè)可逆的過(guò)程。本研究根據(jù)水稻、玉米、高粱、二穗短柄草4種禾本科作物的D27基因核苷酸序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物, 以甘蔗品種ROC22的cDNA為模板, 利用RT-PCR和RACE技術(shù), 從甘蔗中克隆出D27基因的cDNA全長(zhǎng)序列, 命名為ScD27, GenBank登錄號(hào)為KP987221.1。該基因序列全長(zhǎng)1379 bp, 包含一個(gè)867 bp的完整開(kāi)放閱讀框(ORF), 編碼288個(gè)氨基酸殘基。ScD27編碼的蛋白質(zhì)分子量為71.58 kD, 理論等電點(diǎn)為5.04, 是一種非分泌性蛋白, 主要分布于葉綠體上, 該蛋白的保守區(qū)可能具有2個(gè)鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域(ZnF_TAZ和ZnF_A20), 且不存在信號(hào)肽; 該基因編碼的氨基酸序列具有較高的保守性, 與高粱、谷子、大麥、短穗二柄草等禾本科植物的D27氨基酸序列相似性在70%以上; ScD27基因在甘蔗各組織部位均有表達(dá), 其中莖尖和腋芽中表達(dá)量較高,葉、莖和根中的表達(dá)較低。此外, ScD27基因在甘蔗莖尖中的表達(dá)受PEG、鹽脅迫、磷缺乏和營(yíng)養(yǎng)缺乏的誘導(dǎo), 推測(cè)ScD27基因是甘蔗獨(dú)腳金內(nèi)酯生物合成途徑中響應(yīng)非生物脅迫的關(guān)鍵基因。

甘蔗; ScD27; 同源克隆; 生物信息學(xué); q-PCR

農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育主要受植物激素的調(diào)控, 如作物的株型、水分和營(yíng)養(yǎng)的利用以及對(duì)生物和非生物脅迫的適應(yīng)性等, 因此植物激素對(duì)作物產(chǎn)量的形成與品質(zhì)的保持發(fā)揮至關(guān)重要的作用[1]。甘蔗(Saccharum spp.)是世界上最重要的糖料作物, 在其生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫適應(yīng)過(guò)程中受到多種激素信號(hào)的調(diào)控作用[2-3]。因此, 研究植物激素調(diào)控甘蔗重要農(nóng)藝性狀、抗逆性狀表現(xiàn)的生理分子機(jī)制對(duì)于甘蔗品種產(chǎn)量性狀的改良具有重要的理論和實(shí)踐意義。

獨(dú)腳金內(nèi)酯(strigolactones, SLs)屬于類(lèi)萜內(nèi)酯類(lèi)植物激素, 該激素能夠促進(jìn)寄生植物種子的萌發(fā)和植物與共生真菌之間的相互作用, 對(duì)于植物的分枝和逆境脅迫調(diào)控也具有重要作用[4-6], 前人研究表明, 獨(dú)腳金內(nèi)酯是作為第二信使在抑制植物分枝上發(fā)揮作用, 當(dāng)植物營(yíng)養(yǎng)受到限制時(shí), SLs會(huì)在植物的根部生成并促進(jìn)側(cè)根和根毛的生長(zhǎng), 同時(shí) SLs被運(yùn)輸至植物的出芽位置, 抑制側(cè)芽生長(zhǎng), 從而增加植物根部對(duì)無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的捕獲, 減少分蘗對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求[7]。

此外, SLs還具有促進(jìn)節(jié)伸長(zhǎng)、加快葉片衰老、促進(jìn)根毛伸長(zhǎng)和次生根生長(zhǎng)、增加莖粗度誘導(dǎo)二次生長(zhǎng)、響應(yīng)逆境脅迫等作用[8-10]。迄今, 通過(guò)對(duì)多種模式植物如擬南芥[11-12]、矮牽牛[13-15]、豌豆[16]、水稻[17-20]等的研究, 初步明確 SLs的合成及信號(hào)傳導(dǎo)途徑在調(diào)控植物分枝形成和響應(yīng)逆境脅迫的功能作用。一系列相關(guān)基因也被陸續(xù)克隆出來(lái), 如CCD7/D17/HTD1[21]、CCD8/D10[22-23]、D27[20,24-25]、MAX1[26]等基因主要參與獨(dú)腳金內(nèi)酯的合成[27]。D14[26,28]、D3[29-30]、D53[31]主要參與獨(dú)腳金內(nèi)酯的信號(hào)傳導(dǎo)途徑[32-35], 當(dāng)具有活性的獨(dú)腳金內(nèi)酯與 D14蛋白結(jié)合, 誘導(dǎo)D14的構(gòu)象變化, 使D3和D53結(jié)合,以促進(jìn) D53蛋白的泛素化, 最終使 D53蛋白降解,獨(dú)腳金內(nèi)酯得以正常應(yīng)答。

在獨(dú)腳金內(nèi)酯合成途徑中, D27 (DWARF27)是一個(gè)葉綠體定位的鐵結(jié)合蛋白, 為獨(dú)角金內(nèi)酯生物合成的一個(gè)重要成員, 當(dāng)D27基因突變后生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸增強(qiáng), 根部分泌液中檢測(cè)不到獨(dú)角金內(nèi)酯,導(dǎo)致分蘗芽向外生長(zhǎng)的抑制作用被解除而呈多分蘗表型[18,20]。對(duì)水稻 D27基因的研究表明, 它被定位于水稻的第11染色體, 主要在幼葉、腋芽、花序原基、側(cè)根和冠狀根中表達(dá), 尤其是在主莖地上部頂端和幼葉以及節(jié)和節(jié)間的維管束細(xì)胞中表達(dá)[20]。氨基酸序列的比對(duì)分析發(fā)現(xiàn), 從低等的藻類(lèi)到高等植物廣泛存在D27的同源蛋白。

SLs的生物合成受其自身和外部環(huán)境條件的共同調(diào)節(jié), 植物可能通過(guò)調(diào)節(jié) SLs合成基因的轉(zhuǎn)錄水平來(lái)調(diào)控SLs的合成和分泌[36-37], SLs還可能通過(guò)調(diào)控植物的分枝來(lái)響應(yīng)外部環(huán)境的脅迫, 如磷脅迫[38]等。研究發(fā)現(xiàn), 在磷缺乏條件下, 三葉草[39]和番茄[40]中SLs的生物合成量大幅提高, 進(jìn)而導(dǎo)致分枝減少。另有研究發(fā)現(xiàn), 磷缺乏還可能影響SLs的生物活性[6,37]。從擬南芥 max2突變體對(duì)干旱脅迫敏感性的研究發(fā)現(xiàn), SLs類(lèi)似物GR24能夠提高SLs缺失突變體對(duì)干旱的抵抗能力, 同時(shí)也能提高野生型植株的耐旱性[41-42]。SLs不僅可以調(diào)控芽的生長(zhǎng), 還能調(diào)控初生根、側(cè)根的發(fā)育以及根毛的延長(zhǎng), 在逆境條件下(如磷缺乏、干旱和鹽脅迫), 植物會(huì)通過(guò)抑制芽的生長(zhǎng), 增強(qiáng)根系生長(zhǎng), 從而提高植物應(yīng)對(duì)逆境的能力, 最終影響整個(gè)植物的形態(tài)建成[43-44]。

甘蔗D27基因是否也參與甘蔗品種分蘗形成、形態(tài)構(gòu)建和逆境脅迫響應(yīng), 依然是不清楚的。本研究利用基因克隆技術(shù), 從甘蔗中克隆出 D27基因的同系物, 并通過(guò)生物信息學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析其序列結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和表達(dá)模式, 以期為 SLs對(duì)甘蔗品種發(fā)育和重要性狀的分子調(diào)控功能的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

選用我國(guó)蔗區(qū)種植面積最大的主栽品種ROC22,剪取處于分蘗期的甘蔗莖尖, 提取其總RNA。甘蔗品種 ROC22由云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。大田中選取生長(zhǎng)健壯并長(zhǎng)勢(shì)一致的ROC22蔗莖,砍成單芽莖段, 洗凈并52℃溫水脫毒處理30 min。溫室中取 45 d的甘蔗幼苗, 參考李曉君的方法[45],設(shè)置6種處理: 即以10% (w/v) PEG-6000的MS培養(yǎng)基; 20% (w/v) PEG-6000的MS培養(yǎng)基; 200 mmol L-1NaCl的MS培養(yǎng)基; 300 mmol L-1NaCl的MS培養(yǎng)基; 1/8 mmol L-1的磷缺乏; 純水培養(yǎng)(營(yíng)養(yǎng)缺乏)。于不同處理的不同時(shí)間0 (對(duì)照)、6、12、24、48、72和96 h取莖尖, 立即投入液氮速凍, 并保存于-80℃, 用于提取總RNA。

1.2 甘蔗莖尖總RNA的提取和cDNA第1鏈的合成

提取總RNA參照全式金公司RNA Plant Kit說(shuō)明書(shū), 以RNAase-Free H2O溶解RNA, NanoDrop測(cè)定RNA濃度, 根據(jù)OD260/OD280和OD260/OD230評(píng)估RNA質(zhì)量, 通過(guò) 1%瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果判斷RNA的完整性, 存于-70℃?zhèn)溆?。? μg莖尖總RNA按照TaKaRa公司的RNA PCR Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)合成 cDNA。

1.3 甘蔗ScD27基因同源片段的克隆

以NCBI檢索的二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、玉米(Zea mays)、高粱(Sorghum bicolor)、水稻(Oryza sativa)的 D27基因序列為模板, 以 DNAman軟件分析D27保守區(qū)。用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)RT-PCR引物(表1)。以cDNA為模板, 使用全式金Trans Taq HiFi DNA Polymerase進(jìn)行RT-PCR, PCR運(yùn)行程序?yàn)?4℃, 3 min預(yù)變性, 94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 45 s, 30個(gè)循環(huán), 72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 以全式金公司的凝膠回收試劑盒回收、純化擴(kuò)增條帶, 并連接到pEASYTM-T5 Zero-Vector載體中, 轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌, 陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR鑒定后, 送上海生工測(cè)序,測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast和DNAman 6.0驗(yàn)證比對(duì)分析。

1.4 5′和3′端的RACE克隆

根據(jù)1.3中的甘蔗ScD27基因同源片段序列設(shè)計(jì)內(nèi)外巢基因特異性引物(表1)。按照Clontech Smart Race cDNA Amplification Kit說(shuō)明書(shū)擴(kuò)增目的基因的 3′和 5′末端。以拼接獲得的全長(zhǎng)序列為模板, 設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增 ScD27基因的編碼區(qū)序列, 擴(kuò)增條件為94℃, 3 min預(yù)變性, 94℃ 30 s, 57℃ 30 s, 72℃ 45 s, 30個(gè)循環(huán), 72℃延伸10 min。參見(jiàn)1.3的檢測(cè)、回收、測(cè)序、驗(yàn)證比對(duì)分析。

表1 RT-PCR、RACE、熒光定量PCR擴(kuò)增引物Table 1 Primers used for RT-PCR, RACE, and Q-PCR experiments

1.5 甘蔗ScD27基因的生物信息學(xué)分析

使用ORF Finer在線(xiàn)工具尋找編碼框; ProtParam (http://web.expasy.ory/ProtParam/)和Smart (http://smart. embl-heidelberg.de/)在線(xiàn)軟件分析蛋白的基本理論性質(zhì)和保守結(jié)構(gòu)域; ProtScale分析蛋白質(zhì)疏水性; SignalP4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、TMHMM Sever2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/)和PSORT (http://psort.hgc.jp/)分析蛋白的信號(hào)肽和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè); SOPMA軟件預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu); NCBI平臺(tái)進(jìn)行 Blast同源比對(duì)分析, ClustalW軟件進(jìn)行多序列對(duì)齊和排序, MEGA5.0構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.6 甘蔗 ScD27基因表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR分析

取甘蔗的分蘗芽、腋芽、莖尖、根尖、老根、嫩葉、老葉(第四葉中段)、節(jié)(第三節(jié))和葉鞘, 提取RNA (方法參考1.2)。根據(jù)ScD27基因序列設(shè)計(jì)熒光定量 PCR引物, 使用 GAPDH作為內(nèi)參基因[46](表1)。選用TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR Premix Ex Taq II試劑盒,按其說(shuō)明書(shū), 定量PCR體系20 μL, 用ABI Vii7Real time PCR System (Applied Biosystems, USA)檢測(cè)ScD27基因的表達(dá)。設(shè)置3個(gè)重復(fù)樣品, 利用2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[47]。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗ScD27基因全長(zhǎng)cDNA序列

圖1所示, RT-PCR擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為477 bp的甘蔗D27基因片段; RACE擴(kuò)增獲得479 bp的3′端序列和670 bp的5′端序列。通過(guò)將中間片段、3′端序列和5′端序列拼接, 得到全長(zhǎng)為1379 bp的甘蔗D27基因全長(zhǎng) cDNA序列, 使用編碼區(qū)引物擴(kuò)增獲得867 bp的編碼區(qū)序列。該基因包含127 bp的5′非編碼區(qū)、385 bp的3′非編碼區(qū)和867 bp的編碼區(qū), 可編碼288個(gè)氨基酸, 被命名為ScD27, 并將基因序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù), 登錄號(hào)為KP987221.1。

2.2 甘蔗ScD27的生物信息學(xué)分析

圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of PCR products

圖2 ScD27基因的編碼區(qū)序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列Fig. 2 Leotide and predicted amino acid sequences of ScD27 gene

2.2.1 ScD27蛋白基本理化性質(zhì)和保守結(jié)構(gòu)域分析通過(guò)ORF Finer在線(xiàn)工具找到ScD27的ORF框,并翻譯成氨基酸序列(圖2)。使用ProtParam在線(xiàn)軟件分析該蛋白序列的理化性質(zhì)表明, ScD27蛋白的分子式為C2539H4205N867O1033S255, 分子量為71.58 kD,等電點(diǎn)為5.04, Ala、Pro、Ser在氨基酸序列組成中出現(xiàn)頻率較高, 分別占10.1%、9.4%、7.3%和8.1%,而一些氨基酸如Pyl、Sec在氨基酸序列中則沒(méi)有出現(xiàn)。穩(wěn)定性系數(shù)為50.16, 表明為不穩(wěn)定蛋白(不穩(wěn)定系數(shù)＜40是穩(wěn)定蛋白, ＞40是不穩(wěn)定蛋白); 總平均親水性(GRAVY)為-0.308, 脂肪系數(shù)(AI)為 68.79, 說(shuō)明該蛋白質(zhì)親水區(qū)域多于疏水區(qū)域, 為親水蛋白。

通過(guò)Smart分析表明甘蔗ScD27蛋白在氨基酸序列第190～234之間可能含有一個(gè)ZnF_TAZ鋅指結(jié)構(gòu)域, 在氨基酸序列第 199～224之間有一個(gè)類(lèi)ZnF_A20鋅指結(jié)構(gòu)域, 由于具有相同結(jié)構(gòu)的蛋白往往行使相似的功能[48], 因此推測(cè)ScD27蛋白可能參與了其他生物學(xué)通路, 與植物調(diào)節(jié)分蘗來(lái)響應(yīng)非生物脅迫有關(guān)。

2.2.2 ScD27蛋白磷酸化和糖基化位點(diǎn) 蛋白質(zhì)的修飾方式包括蛋白質(zhì)的磷酸化和糖基化, 它可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活力和功能。分別運(yùn)用DictyOGlyc 1.1 Server 和NetPhos 2.0 Serve在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)ScD27基因翻譯后磷酸化、O-糖基化修飾情況。結(jié)果顯示, ScD27蛋白有可能發(fā)生磷酸化修飾的位點(diǎn)有16個(gè),其中色氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)可能發(fā)生磷酸化修飾的位點(diǎn)分別有8、5、3個(gè)(圖3); 有可能發(fā)生 O-糖基化修飾的位點(diǎn)有0個(gè)(圖4)。磷酸化位點(diǎn)均集中分布在中間親水區(qū)。

圖3 ScD27蛋白氨基酸序列翻譯后磷酸化修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig. 3 Prediction of phosphorylation site modification in amino acid sequence of ScD27 protein

圖4 ScD27蛋白氨基酸序列翻譯后O-糖基化修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig. 4 Prediction of O-glycosylation site modification in amino acid sequence of ScD27 protein

2.2.3 ScD27蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)、亞細(xì)胞定位和蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 根據(jù) SignalP4.1 server軟件預(yù)測(cè)可知, 該蛋白的信號(hào)肽平均值較小, 為 0.217 (遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于 0.500), 因此推測(cè) ScD27蛋白無(wú)信號(hào)肽及切割位點(diǎn), 屬于非分泌蛋白, 說(shuō)明該蛋白在細(xì)胞質(zhì)中合成后不能被轉(zhuǎn)運(yùn)。根據(jù)PSORT II在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)表明ScD27蛋白主要定位于葉綠體上。使用SOPMA軟件預(yù)測(cè) ScD27蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖 5), 該蛋白 α-螺旋(h)占33.6%、β-折疊(e)占14.24%、β-轉(zhuǎn)角(t)占4.86%和無(wú)規(guī)則卷曲(c) 47.22%?？梢?jiàn)α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲占據(jù)了該蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的大部分, 進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)α-螺旋在N端與中部所占分量較大, 延伸鏈主要集中在中部及 C端, β-轉(zhuǎn)角則主要在中部和前部, 無(wú)規(guī)則卷曲的分布則比較平均(圖 5)。Motif Scan軟件在線(xiàn)軟件分析該基因含有一個(gè)異戊烯化作用位點(diǎn)和一個(gè)CAAX BOX結(jié)構(gòu), 這可能是蛋白質(zhì)翻譯后修飾并正確定位的重要作用元件。

作為蛋白質(zhì)折疊的主要驅(qū)動(dòng)力, 蛋白質(zhì)的親水、疏水氨基酸的組成能夠影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和特性, 經(jīng)在線(xiàn)軟件 ProtScale采用 Hyhob/Kyte & Doolittle的方法分析顯示(圖6), 第130位具有最高分值, 為2.367, 疏水性最強(qiáng); 第36和第37位最低分值, 為-3.067, 親水性最強(qiáng)。整條多肽鏈表現(xiàn)為親水性, 沒(méi)有明顯的疏水區(qū), 故推測(cè)甘蔗 ScD27蛋白是一種親水蛋白。

圖5 ScD27蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig. 5 Secondary structure analysis of ScD27 protein

2.2.4 ScD27蛋白氨基酸序列的同源比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)分析 在NCBI上篩選出與甘蔗ScD27基因氨基酸序列相似性較高的5個(gè)不同物種的D27蛋白, 并將其與甘蔗ScD27基因預(yù)測(cè)的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)。結(jié)果顯示, ScD27蛋白氨基酸序列與其他D27氨基酸序列有較高的保守性(圖7)。

圖6 ScD27蛋白的親水性/疏水性預(yù)測(cè)Fig. 6 Hydrophobicity/hydrophilicity prediction of ScD27

圖7 ScD27與其他五種作物同源蛋白的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Fig. 7 Structure and sequence alignment analysis among ScD27 and D27 homologs of five cropsgi326492644: 大麥; gi357156309: 二穗短柄草; ＞gi242068981: 高粱; gi514809530: 谷子; gi226501302: 玉米。gi326492644: Hordeum vulgare subsp. vulgare; gi357156309: Brachypodium distachyon; gi242068981: Sorghum bicolor; gi514809530: Setaria italica; gi226501302: Zea mays.

氨基酸同源比對(duì)分析表明 ScD27蛋白與玉米D27蛋白氨基酸序列相似性達(dá)到82% (圖8), 與單子葉植物高粱(Sorghum bicolor)、谷子(Setaria italicaBeauv.)、大麥(Hordeum vulgare subsp. vulgare)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)和山羊草(Aegilops umbellulata)的相似性分別高達(dá)78%、76%、73%、71%和 64%, 與雙子葉植物海棗(Phoenix dactylifera)和甜橙(Citrus aurantium)的相似性分別為57%和58%。使用MEGA5.0構(gòu)建的NJ進(jìn)化樹(shù)(圖8)顯示單子葉植物和雙子葉植物D27蛋白同系物分別聚在2個(gè)不同的分支, 表明D27蛋白在單雙子葉植物間存在一定的分化, 在同類(lèi)型植物間表現(xiàn)出較高的保守型。在單子葉植物分支群中, ScD27蛋白與谷子、高粱聚為一個(gè)小分支, 表現(xiàn)出較高的同源性。

圖8 不同物種D27氨基酸序列的聚類(lèi)分析Fig. 8 Phylogenetic analysis of D27 gene homologs in different plant species

2.3 ScD27基因組織特異性表達(dá)分析

qRT-PCR分析表明(圖9), 甘蔗ScD27基因在各器官中差異表達(dá), 在分蘗芽、腋芽、莖尖中的表達(dá)量相對(duì)較高, 根尖、老根、嫩葉、老葉、節(jié)和葉鞘中的表達(dá)量相對(duì)較少。因此, ScD27基因在甘蔗中具有組織特異性, 主要是在甘蔗的幼嫩組織中強(qiáng)表達(dá)。

2.4 ScD27基因不同脅迫下的表達(dá)分析

q-PCR (quantitative PCR, q-PCR)分析結(jié)果表明,在不同脅迫條件下, ScD27基因均被誘導(dǎo)表達(dá), 而響應(yīng)的方式有一定的差異(圖10)。ScD27基因的表達(dá)受到PEG強(qiáng)烈誘導(dǎo), 10% (w/v) PEG-6000的MS培養(yǎng)基處理, 在6個(gè)時(shí)間點(diǎn)(6、12、24、48、72和96 h)中甘蔗 ScD27基因表達(dá)以24 h達(dá)最高; 20% (w/v) PEG-6000的MS培養(yǎng)基脅迫下12 h達(dá)最高的4倍的表達(dá)量, 并在整個(gè)處理周期, 96 h內(nèi)均維持較高的表達(dá)水平(3倍以上)。

圖9 ScD27基因在甘蔗不同組織中的表達(dá)Fig. 9 Expression of ScD27 gene in different sugarcane tissues analyzed with q-PCR technique

總體上看, ScD27基因在受到模擬干旱脅迫和中度鹽脅迫(以200 mmol L-1NaCl的MS培養(yǎng)基處理)的誘導(dǎo)表達(dá)增強(qiáng), 處理24 h后表達(dá)量均出現(xiàn)明顯增強(qiáng), 但在重度鹽脅迫(以300 mmol L-1NaCl的MS培養(yǎng)基處理)處理后, ScD27基因的表達(dá)量相對(duì)增加較少, 可能與蔗苗受極端脅迫有關(guān), 而后期蔗苗出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。在磷缺乏和營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí), ScD27基因同樣表現(xiàn)出表達(dá)增強(qiáng), 但與響應(yīng)模擬干旱和鹽脅迫相比, 其表達(dá)量增長(zhǎng)較少。

圖10 ScD27基因在不同脅迫條件下的表達(dá)量Fig. 10 Expression level of ScD27 gene under different stress conditions using q-PCR technique

3 討論

植物激素作為調(diào)節(jié)植物的分枝數(shù)量和模式的重要因素, 其受體鑒定、代謝調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控發(fā)育一直是重要的研究前沿課題。雖然SLs調(diào)控植物分蘗的特性研究已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展, 但更多的調(diào)控因子、未知來(lái)源的SLs, 和SLs類(lèi)似物的出現(xiàn)及其重要信號(hào)功能, 可能的新的 SLs合成途徑的存在, 以及相關(guān)基因的調(diào)控分子機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明[49]。

本研究從甘蔗主栽品種 ROC22中克隆獲得了與甘蔗分蘗相關(guān)的基因 ScD27基因, 該基因序列全長(zhǎng)1379 bp, 其開(kāi)放閱讀框?yàn)?67 bp, 編碼288個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。研究表明水稻D27基因是一個(gè)定位于葉綠體中的含鐵蛋白質(zhì), 在甘蔗中的 ScD27通過(guò)在線(xiàn)分析表明其同樣定位于葉綠體[17,54], 該推斷還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。通過(guò)同源性分析和進(jìn)化樹(shù)分析表明, 甘蔗 ScD27基因的氨基酸序列與谷子、高粱和水稻中 D27蛋白的氨基酸序列同源性較高, 達(dá)80%左右, 但與甜橙等雙子葉植物的同源性只有58%, 這也從另一方面證明本研究分離獲得的ScD27基因序列是正確的, 但氨基酸序列的保守性一般, 推測(cè)來(lái)源于不同作物的 D27基因在功能上可能存在差異。

植物鋅指蛋白是一類(lèi)龐大的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族,可以通過(guò)與核酸或蛋白質(zhì)結(jié)合來(lái)行使功能, 參與多個(gè)生理過(guò)程, 其中植物A20/AN1型鋅指蛋白與植物的非生物逆境應(yīng)答密切相關(guān)[50]。甘蔗ScD27基因保守區(qū)中含有一個(gè) ZnF_TAZ鋅指結(jié)構(gòu)域和一個(gè)類(lèi)ZnF_A20鋅指結(jié)構(gòu)域, 推測(cè)該結(jié)構(gòu)域的存在與甘蔗ScD27基因參與其他生物學(xué)通路相關(guān), 也可能與甘蔗調(diào)節(jié)分蘗來(lái)響應(yīng)非生物脅迫有關(guān)。D27基因是位于獨(dú)腳金內(nèi)酯生物合成最上游位置的一個(gè)調(diào)控基因,其調(diào)控作用是一個(gè)可逆的過(guò)程, 預(yù)計(jì)基因的研究對(duì)于了解獨(dú)腳金內(nèi)酯生物合成與植物響應(yīng)非生物逆境脅迫之間的關(guān)系十分重要[44,51], 同時(shí)該基因還可能對(duì)SLs合成的新途徑的研究有重要的作用。

ScD27基因是甘蔗合成獨(dú)腳金內(nèi)酯所必需的[25],通過(guò)對(duì) ScD27基因在甘蔗組織中的表達(dá), 發(fā)現(xiàn)在甘蔗的不同組織部分均能檢測(cè)到 ScD27基因的表達(dá),但其表達(dá)具有較強(qiáng)的組織特異性。在甘蔗莖尖中的表達(dá)量最高, 在腋芽、分蘗芽中的表達(dá)量次之, 根尖、老根、節(jié)和葉鞘中的表達(dá)量相對(duì)較少?？傊? 主要是在幼嫩分生組織處表達(dá)。與水稻D27基因的表達(dá)較相似[20]。在受到非生物脅迫(PEG、鹽、磷、營(yíng)養(yǎng))的情況下, 該基因均受到誘導(dǎo)而高表達(dá), 獨(dú)腳金內(nèi)酯的生物合成量增多, 地上分蘗減少, 這與前人的研究結(jié)果一致[52]。尤其是在受到PEG模擬的干旱脅迫作用下, 其表達(dá)量被誘導(dǎo)高達(dá) 4倍, 說(shuō)明該基因可能與干旱或滲透脅迫響應(yīng)有關(guān), 推測(cè) ScD27基因是甘蔗獨(dú)腳金內(nèi)酯響應(yīng)非生物脅迫的關(guān)鍵基因。

在水稻中D27的表達(dá)量可影響SLs對(duì)水稻分蘗的調(diào)控[18]。d27突變體中D27基因的第4外顯子發(fā)生4 bp缺失, 提前形成終止密碼子, d27突變體株高矮化, 分蘗數(shù)增多, 多達(dá)野生型的3倍, d27突變體的表型與生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸增強(qiáng)有關(guān)。D27突變之后生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸增強(qiáng), 根部分泌液中檢測(cè)不到獨(dú)角金內(nèi)酯 2’-epi-5-deoxystrigol, 導(dǎo)致分蘗芽向外生長(zhǎng)的抑制作用被解除, 因此表現(xiàn)出多分蘗表型。d27d10雙突變體的表型與水稻突變體d10的表型類(lèi)似, d27的表型可以被人工合成的獨(dú)腳金內(nèi)酯類(lèi)似物GR24所恢復(fù)[20]。ScD27基因在甘蔗中的功能鑒定、亞細(xì)胞定位將是本研究的后續(xù)的工作, 本課題組已經(jīng)構(gòu)建了相應(yīng)的過(guò)表達(dá)和RNAi干擾植物表達(dá)載體,并開(kāi)展了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化的相關(guān)工作。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因甘蔗的非生物脅迫處理可進(jìn)一步鑒定ScD27在甘蔗SLs生物合成途徑中的作用。

4 結(jié)論

克隆獲得一個(gè)全長(zhǎng)ORF為867 bp, 編碼288個(gè)氨基酸的 ScD27基因的全長(zhǎng)序列, 該基因編碼的蛋白屬于親水性蛋白, 且不存在信號(hào)肽。ScD27基因含有一個(gè)ZnF_TAZ鋅指結(jié)構(gòu)域和一個(gè)類(lèi)ZnF_A20鋅指結(jié)構(gòu)域。該基因在甘蔗不同部位的表達(dá)具有組織特異性, 在受到多種非生物脅迫的作用下均被誘導(dǎo)表達(dá), 表明它與甘蔗SLs響應(yīng)非生物脅迫密切相關(guān)。

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Cloning and Expression Analysis of Key Gene ScD27 in Strigolactones Biosynthesis Pathway

WU Zhuan-Di**, LIU Xin-Long**, LIU Jia-Yong, ZAN Feng-Gang, LI Xu-Juan, LIU Hong-Bo, LIN Xiu-Qin, CHEN Xue-Kuan, SU Huo-Sheng, ZHAO Pei-Fang, and WU Cai-Wen*
Sugarcane Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences / Yunnan Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Kaiyuan 661699, China

Strigolactones (SLs) is a novel class of plant hormones. D27 regulating reversible metabolic process is located in up-stream of strigolactones biosynthesis pathway. In this study, primers were designed based on the conserved domains from four species inluding Oryza sativa, Zea mays, Sorghum bicolor, and Brachypodium distachyon. Using cDNA from sugarcane cultivar ROC22 as the template, the full-length cDNA sequence of D27 gene from sugarcane was cloned by RT-PCR and RACE method. This gene is named as ScD27, with the GenBank accession number of KP987221.1. Its length is 1379 bp, and it contains an 867 bp open reading frame (ORF), encoding 288 amino acid residues. ScD27 is not a secretory protein and has a molecular weight of 71.58 kD, with a theoretical isoelectric point of 5.04. ScD27 is mainly located in chloroplast and the conserved domains of this protein involve two zinc finger protein structures (ZnF_TAZ and ZnF_A20). Amino acid sequences encoded by ScD27 shared more than 70% similarity with the reported amino acid sequences encoded by D27 of Sorghum bicolor, Setaria italica Beauv.,Hordeum vulgare subsp. vulgare and Brachypodium distachyon. ScD27 gene was differentially expressed in different parts of sugarcane plant, with higher level of transcript in stem tip and axillary bud but much lower level in leaf, stem and root. Furthermore, the expression of ScD27 could be induced by the stresses of PEG, salt and the deficiencies of phosphorus and nutrition. These results demonstrated that ScD27 might be a key gene participating in the response to abiotic stresses during sugarcane SLs biosynthesis pathway.

Sugarcane; ScD27; Homology cloning; Bioinformatics; q-PCR

10.3724/SP.J.1006.2017.00031

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360359), 國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)(CARS-20-1-1), 云南省中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人才(2014HB038), 云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2016FB071), 重大科技專(zhuān)項(xiàng)-生物(2015ZA001)和科技創(chuàng)新人才計(jì)劃(2014HC015)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31360359), the National Modern Agricultural Industry Technology System Construction Project (CARS-20-1-1), the Young and Middle-aged Academic Technology Leaders Reserve Talented Person in Yunnan Province (2014HB038), the Applied Basic Research Projects in Yunnan Province (2016FB071), the Major Science and Technology Projects - Biology (2015ZA001), and the Science and Technology Innovation Talents Project (2014HC015).

*通訊作者(Corresponding author): 吳才文, E-mail: gksky_wcw@163.com**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to the work)

聯(lián)系方式: 吳轉(zhuǎn)娣, E-mail: judith1123@126.com; 劉新龍, E-mail: lxlgood868@163.com

稿日期): 2016-01-11; Accepted(接受日期): 2016-09-18; Published online(

日期): 2016-09-28.

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160928.0948.006.html