胃癌患者血清miR-26a/b的表達(dá)水平及診斷價(jià)值*

司怡然 張海洋 王藝 鄧婷 白明 寧濤 張樂(lè) 巴一

據(jù)2015年研究統(tǒng)計(jì)，胃癌居世界腫瘤發(fā)病率第5位，死亡率居第2位［1］。每年約有42.6%的新發(fā)胃癌病例來(lái)自中國(guó)［2］，且進(jìn)展期胃癌的中位生存時(shí)間≤12個(gè)月［3］。胃癌惡性程度高、發(fā)生轉(zhuǎn)移早是其預(yù)后差的原因之一。研究發(fā)現(xiàn)70%的胃癌患者在診斷時(shí)已是晚期，失去了外科手術(shù)的機(jī)會(huì)［4］，因此胃癌的早診率低也是造成其預(yù)后差的主要因素。盡管目前一些分子標(biāo)志物如CEA、CA72-4及CA19-9等對(duì)于進(jìn)展期胃癌診斷有較高的靈敏度，但對(duì)于早期胃癌診斷缺乏明顯意義［5］。因此有必要探索一種新的特異性和敏感性高的腫瘤標(biāo)記物應(yīng)用于胃癌的早期診斷，幫助患者延長(zhǎng)生存。miRNA是一類保守的非編碼小分子RNA，通過(guò)和靶基因mRNA堿基配對(duì)引導(dǎo)沉默復(fù)合體降解mRNA或阻礙其翻譯。近年來(lái)關(guān)于miRNA的研究表明，外周血miRNAs的種類及表達(dá)水平在正常人及腫瘤患者或其他疾病狀態(tài)下存在顯著差異，且外周血miRNAs作為腫瘤的一種非有創(chuàng)性診斷的生物標(biāo)記物逐漸成為新的研究熱點(diǎn)［6］。本課題組在之前的研究中篩選了胃癌患者血清miRNAs的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-26a/b在胃癌患者與正常人中表達(dá)存在差異［7］。因此，本文旨在研究胃癌患者血清miR-26a/b的表達(dá)水平與其臨床病理特征的關(guān)系，并探討miR-26a/b作為胃癌早診生物學(xué)標(biāo)志物的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 病例資料

隨機(jī)選取2016年6月至10月于天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院就診的胃癌患者121例。經(jīng)病理證實(shí)均為胃癌，且均為初診，無(wú)任何治療。121例患者中，男性58例，女性63例，中位年齡（63.5±10.0）歲。另隨機(jī)選取2016年4月于天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院體檢中心體檢的116例健康志愿者作為對(duì)照，其中男性66例，女性50例，中位年齡（35.8±7.1）歲；排除腫瘤性疾病。本研究所有血清標(biāo)本及組織標(biāo)本的采集和使用均征得患者或其家屬知情同意，得到天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集 血清標(biāo)本：清晨，空腹條件下，采集5 mL靜脈全血，促凝管中保存，3 000 r/min離心15 min后收集上清液于無(wú)RNA酶的1.5 mL離心管中。組織標(biāo)本：收集以上患者手術(shù)切除的胃癌組織標(biāo)本及正常組織（距腫瘤邊緣＞5 cm）標(biāo)本共16對(duì)（16例患者，共32例標(biāo)本），其中男性9例，女性7例，中位年齡（64.2±10.0）歲，標(biāo)本大小為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，手術(shù)切除的新鮮標(biāo)本立即放入液氮凍存。以上所有血清及組織標(biāo)本均置于-80℃冰箱保存，使用時(shí)取出。

1.2.2 RNA提取及qRT-PCR定量 嚴(yán)格按照TRIzol（Invitrogen，美國(guó)）說(shuō)明書提取血清及組織標(biāo)本總RNA，采用紫外分光光度計(jì)（NanoDrop，美國(guó)）測(cè)定RNA的質(zhì)量和濃度。取約2 μL總RNA，依照Takara（美國(guó)）公司的逆轉(zhuǎn)錄酶及產(chǎn)品說(shuō)明書，按16℃15 min、42℃1 h、85℃5 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，制備cDNA完成后將EP管置于-20℃條件下保存。使用探針?lè)ㄟM(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，按照以下反應(yīng)條件進(jìn)行：95℃5 min、95℃ 15 s、60℃ 1 min（最后兩步共計(jì)40個(gè)循環(huán)）。每組實(shí)驗(yàn)均以管家基因U6 snRNA分子表達(dá)量作為內(nèi)參，Ct值定義為熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)PCR所經(jīng)過(guò)的循環(huán)數(shù)，所有樣品均設(shè)3個(gè)副孔，取平均Ct值，ΔCt值定義為各樣本中目的miRNA的平均Ct值與內(nèi)參基因平均Ct值之差，2-ΔCt為該樣本中目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用描述。兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＜0.05。采用GraphPad Prism 7.0a（GraphPad Software Inc，美國(guó)）繪圖。受試者工作曲線（ROC）下面積（area under the ROC curve，AUC）評(píng)價(jià)miR-26a和miR-26b作為一種診斷方法是否具有臨床應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果判定AUC≤0.5為無(wú)診斷價(jià)值，0.5＜AUC≤0.7為診斷準(zhǔn)確性較低，0.7＜AUC≤0.9為診斷準(zhǔn)確性較好，AUC＞0.9為診斷準(zhǔn)確性最高［8］。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-26a/b在胃癌患者與正常人血清標(biāo)本及胃癌組織與癌旁組織中表達(dá)的比較

胃癌組患者血清miR-26a的表達(dá)量為1.60±1.02，對(duì)照組為5.35±0.44，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。胃癌組患者血清miR-26b的表達(dá)量為1.44±0.71，對(duì)照組為5.35±0.71，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。兩組血清miR-26a/b的表達(dá)水平見(jiàn)圖1。該結(jié)果表明胃癌患者血清中miR-26a/b的含量明顯低于正常人。為了驗(yàn)證miR-26a/b在胃癌中的表達(dá)，本研究進(jìn)一步在組織水平對(duì)miR-26a/b的相對(duì)表達(dá)含量進(jìn)行檢測(cè)，選取16對(duì)胃癌及癌旁正常組織。結(jié)果顯示，胃癌組織中miR-26a/b的相對(duì)含量低于癌旁正常組織，與血清中的結(jié)果具有一致性（圖2）。

圖1 胃癌患者及正常人血清標(biāo)本中miR-26a/b的相對(duì)表達(dá)量Figure 1 Relative expression levels of serum miR-26a/b in GC and control

2.2 胃癌患者血清miR-26a/b表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

本組臨床病理資料包括性別、年齡、吸煙飲酒史、家族史、部位、組織學(xué)類型、分化程度、TNM分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度等。結(jié)果表明，Ⅰ期患者血清中miR-26a/b的相對(duì)表達(dá)量明顯高于Ⅱ期及Ⅲ期患者，而Ⅳ期患者血清中miR-26a/b的含量較少；T1+T2期患者血清中miR-26a的相對(duì)表達(dá)量高于T3+T4期；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者血清中miR-26a相對(duì)表達(dá)量高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，血清miR-26a/b的相對(duì)表達(dá)量與TNM分期有關(guān)，且miR-26a的相對(duì)表達(dá)量與浸潤(rùn)深度及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也具有相關(guān)性，以上結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而miR-26a/b的相對(duì)含量與性別、年齡、分化程度、吸煙飲酒史等無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05，表1）。對(duì)于不同TNM分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不同浸潤(rùn)深度，胃癌患者的TNM分期越晚、腫瘤的浸潤(rùn)程度越深、涉及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等情況，miR-26a/b的表達(dá)量越低（圖3～5）。由此可見(jiàn)，胃癌患者血清miR-26a/b的相對(duì)含量也可提示患者的分期及預(yù)后。

2.3 ROC曲線分析血清miR-26a和miR-26b對(duì)胃癌的診斷價(jià)值

從上述結(jié)果可以看出，血清miR-26a/b的相對(duì)含量與胃癌患者某些臨床病理特征具有一定相關(guān)性，本研究通過(guò)ROC曲線評(píng)估血清miR-26a/b作為胃癌生物學(xué)標(biāo)記物的診斷價(jià)值。血清miR-26a診斷胃癌的ROC曲線下面積（AUC）為 0.828（95%CI：0.776～0.881），靈敏度和特異度分別為73.3%、81.0%；血清miR-26b診斷胃癌的AUC為0.853（95%CI：0.801～0.906），靈敏度和特異度分別為68.1%、99.2%（表2），ROC曲線見(jiàn)圖6。

圖2 胃癌組織及癌旁組織中miR-26a/b的相對(duì)含量Figure 2 Relative expression levels of miR-26a/b in GC tissues and normal tissues

表1 血清miR-26a/b的相對(duì)含量與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Relationship between the expression of serum miR-26a/b and clinicopathological features of GC patients

表1 血清miR-26a/b的相對(duì)含量與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系（續(xù)表1）Table 1 Relationship between the expression of serum miR-26a/b and clinicopathological features of GC patients

圖3 不同TNM分期患者血清miR-26a/b的相對(duì)含量Firuge 3 Relative expression levels of serum miR-26a/b of patients with different TNM stages

圖4 有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)患者血清miR-26a/b的相對(duì)含量Firuge 4 Relative expression levels of serum miR-26a/b of patients with different lymph node metastasis

圖5 不同浸潤(rùn)深度患者血清miR-26a/b的相對(duì)含量Firuge 5 Relative expression levels of serum miR-26a/b of patients with different invasion depth

表2 患者血清miR-26a/b診斷胃癌的靈敏度、特異度Table 2 Sensitivity and specificity of serum miR-26a/b for diagnosis of GC

圖6 胃癌患者血清miR-26a/b的ROC曲線Firuge 6 ROC curve analysis of serum miR-26a/b in GC patients

3 討論

如何對(duì)惡性腫瘤做到早期診斷是值得人們關(guān)注的問(wèn)題，尤其是血清腫瘤標(biāo)志物的臨床應(yīng)用，使部分類型的腫瘤患者生存獲益，降低了患者的死亡率。然而對(duì)于胃癌，目前難以通過(guò)早期的癥狀及體征覺(jué)察，并且臨床常用的CEA、CA19-9、CA72-4等腫瘤標(biāo)志物缺乏特異性［9］，因此胃癌的早期診斷始終是臨床醫(yī)生面臨的一個(gè)巨大難題。miRNAs是動(dòng)植物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的起重要調(diào)控功能的非編碼RNA，其通過(guò)與靶基因mRNA堿基配對(duì)，引導(dǎo)沉默復(fù)合體降解mRNA或阻礙其翻譯來(lái)發(fā)揮調(diào)控作用［10］，并且已有研究發(fā)現(xiàn)miRNAs參與多種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移，起著原癌基因或抑癌基因的作用［11-13］。盡管miRNAs的生物功能并未被完全了解，但分析顯示大部分類型腫瘤的miRNAs表達(dá)譜與正常組織之間存在顯著差異，在外周血中也發(fā)生了特異性的改變［14］。已有研究證實(shí)，原發(fā)腫瘤組織與血清中miRNAs的表達(dá)水平保持一致性，即血清中miRNA水平可以在某種程度上反映出原發(fā)腫瘤組織中miRNA的水平［15-16］。但與腫瘤組織相比，血清易于取材，創(chuàng)傷較小，同時(shí)研究證實(shí)血清中miRNA不會(huì)隨著外界的放置時(shí)間、pH值及溫度的改變而發(fā)生顯著性的變化［17］，因此血清miRNA有望作為一種新型的腫瘤標(biāo)志物用于指導(dǎo)腫瘤的診斷和治療，并為有效地監(jiān)控和預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)提供了新途徑。

近年來(lái)，部分學(xué)者已開始著手研究外周血中miRNAs作為胃癌早期診斷標(biāo)記物的可行性。Tsujiu?ra等［18］首次報(bào)道了血漿miRNA能夠作為胃癌診斷的潛在分子標(biāo)志物，之后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多種miRNA與胃癌早診相關(guān)［19-20］。Zheng等［20］對(duì)胃癌患者及健康人外周血miR-21的表達(dá)水平檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，miR-21在胃癌患者外周血中的含量遠(yuǎn)高于健康人，并且與腫瘤的TNM 分期相關(guān)。Song等［21］研究證實(shí)miR-221、miR-744和miR-376聯(lián)合診斷胃癌的靈敏度和特異度分別為82.4%和58.8%，且miR-221和miR-376c與胃癌的分化程度呈負(fù)相關(guān)。另有研究證實(shí)miRNA可以作為胃癌是否發(fā)生轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物［22-23］。因此，miRNAs多樣化的功能與“角色”，使其在胃癌等多種惡性腫瘤的研究中成為焦點(diǎn)。

基于本課題組之前的研究成果，再次回顧胃癌血清miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-26家族在胃癌患者血清與正常人血清中的表達(dá)差異顯著［7］。miR-26a-1、miR-26a-2、miR-26b是miR-26家族中的3種亞型，分別位于3、12、2號(hào)染色體。miR-26a-1和miR-26a-2的成熟體miRNA具有相同的序列，與miR-26b成熟體miRNA有2個(gè)核苷酸不同［24］。與其他功能及作用已被證實(shí)的miRNA相比，miR-26a/b在惡性腫瘤中的“角色”目前仍然是有爭(zhēng)議的話題。如在肝細(xì)胞癌中，miR-26a/b通過(guò)阻滯HGF/c-Met信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)及血管生成［25］。在乳腺癌中，同樣被證實(shí)擔(dān)當(dāng)抑癌基因的“角色”［26］。但是在膠質(zhì)瘤、肺癌及膽管癌中，miR-26a/b可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，發(fā)揮原癌基因的作用［27-29］。目前miR-26a/b與胃癌的相關(guān)性研究不多見(jiàn)，僅個(gè)別研究提示miR-26b通過(guò)KPNA2/c-Jun通路，抑制胃癌細(xì)胞增長(zhǎng)［30］。因此，血清miR-26a/b與胃癌的相關(guān)性及其能否成為胃癌早診的指標(biāo)成為本研究的目的及重點(diǎn)。

本研究通過(guò)對(duì)121例胃癌患者及116例正常人的血清標(biāo)本檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，miR-26a/b在胃癌患者血清中表達(dá)顯著降低，且組織水平也得到了相同的結(jié)果。通過(guò)與患者臨床病理特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-26a/b的表達(dá)與TNM分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)，且進(jìn)一步探討發(fā)現(xiàn)分期越晚的患者，血清中miR-26a/b的表達(dá)含量越低，因此miR-26a/b也可能作為預(yù)測(cè)胃癌患者臨床分期及預(yù)后差異的潛在生物學(xué)指標(biāo)。通過(guò)ROC曲線證實(shí)miR-26a/b的AUC分別為0.828和0.853，具有較高的診斷價(jià)值。

綜上所述，血清miR-26a/b有望成為新的胃癌血清腫瘤標(biāo)志物，為胃癌的早期診斷提供更為便捷、有效的檢測(cè)手段，為減低胃癌的死亡率及改善預(yù)后提供新的可能的研究方向。但本研究也存在諸多不足，為了真正將miR-26a/b作為胃癌早診指標(biāo)應(yīng)用于臨床，需要大規(guī)模樣本進(jìn)行廣泛驗(yàn)證，此部分?jǐn)?shù)據(jù)亟待擴(kuò)充；另一方面，此指標(biāo)在靈敏度及特異度方面是否優(yōu)于現(xiàn)有的胃癌腫瘤標(biāo)志物CEA、CA19-9、CA72-4等，此方面的比較也值得進(jìn)一步探討。

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