子宮內(nèi)膜癌組織和血清中的CD26表達及其診斷價值*

楊曉清 朱怡 姚鋒 陳肖靜 張玉泉

子宮內(nèi)膜癌（endometrial carcinoma，EC）是女性最常見的惡性腫瘤之一，目前發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢。因EC發(fā)病的確切分子機制尚不明確，尋找新的診斷及治療靶基因?qū)C的預(yù)防、治療及預(yù)后具有重要的意義。

二肽基肽酶Ⅳ（dipeptidyl peptidaseⅣ，DPPⅣ）又稱CD26是1966年發(fā)現(xiàn)的跨膜糖蛋白［1］，為一種含766個氨基酸的單鏈結(jié)構(gòu)蛋白，其前6個氨基酸殘基位于胞漿中，7～28個氨基酸殘基由疏水性氨基酸組成并橫跨細(xì)胞膜，其余部分位于細(xì)胞外，可透過細(xì)胞膜分泌到膜外而成為可溶性CD26（soluble CD26，sCD26）［2］。同時，CD26具有非酶功能，可與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等相互作用而促進細(xì)胞的黏附、遷移和轉(zhuǎn)移［3］。鑒于這些功能，CD26在臨床許多疾病的發(fā)生、發(fā)展，尤其在腫瘤的研究中，其表達水平與腫瘤初始階段的惡性轉(zhuǎn)化、進展以及免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)［4］。因此，本研究旨在探討人正常子宮內(nèi)膜增生期、分泌期及Ⅰ型EC病理不同分級組織中的CD26及血液中的sCD26表達，為進一步闡明CD26在EC發(fā)生、發(fā)展中的作用及其在臨床診斷中的價值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2014年1月至2015年12月南通大學(xué)附屬醫(yī)院行診斷性刮宮及行手術(shù)治療的EC病理不同分級患者的組織標(biāo)本，其中正常子宮內(nèi)膜增生期和分泌期的組織標(biāo)本各30例、依據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）的EC診治指南（2015年版）收集術(shù)后病理證實為Ⅰ型EC的G1、G2及G3級組織標(biāo)本各40例。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測后，采集2016年1月至2017年9月經(jīng)門診體檢的健康育齡女性和住院治療的Ⅰ型EC患者的血液標(biāo)本，其中正常子宮內(nèi)膜增生期和分泌期的血液標(biāo)本各20例、Ⅰ型EC的G1、G2級各20例、G3級15例（EC血液標(biāo)本均選擇患者月經(jīng)周期為增生期的病例）。本研究獲得南通大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)及患者本人知情同意。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色 將組織切片置60℃烤箱烤片2 h脫蠟水化，微波修復(fù)，3%H2O2溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，羊血清封閉后，加入購自英國Abcam公司的兔抗人CD26一抗（體積稀釋比例為1：800），濕盒孵育4℃過夜。第二天加入二抗孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，透明封片。使用PBS代替一抗作為陰性對照。

顯微鏡下隨機選取5個高倍視野（×200）進行觀察以及結(jié)果判定。在每個視野中，計數(shù)8條子宮內(nèi)膜腺體及100個細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，若視野中不足8條腺體，則對視野中的所有細(xì)胞進行計數(shù)，判斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)陽性細(xì)胞的比率和細(xì)胞膜著色強度得分進行評價。評估結(jié)果采用不同的得分表示：陽性細(xì)胞與總細(xì)胞數(shù)相比的比率＜5%為0，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；染色強度中的陰性為0，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。每個標(biāo)本的最終得分為陽性細(xì)胞比率的得分×染色強度的得分，得分＜4分為低表達，得分≥4分為高表達。染色結(jié)果由兩位有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師雙盲下進行獨立判定。

1.2.2 ELISA法 經(jīng)驗證CD26表達水平后，分析標(biāo)本血清中的sCD26表達。對所采集的正常及EC患者的血液樣本行3 000 r/min，離心20 min后提取上層血清，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。CD26檢測ELISA試劑盒購自美國R&D公司，實驗步驟按產(chǎn)品說明書進行，在450 nm波長下測各孔的光密度值（OD值），依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中蛋白濃度，并取平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料間比較采用χ2檢驗。采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行組間差異分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常子宮內(nèi)膜組織及Ⅰ型EC組織中的CD26表達水平及與Ⅰ型EC的病理分級的關(guān)系

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，CD26蛋白陽性表達的棕黃色顆粒定位于腺體上皮細(xì)胞膜及部分細(xì)胞質(zhì)，正常子宮內(nèi)膜增生期和分泌期組織中CD26陽性率分別為3.33%（1/30）和56.67%（17/30），子宮內(nèi)膜分泌期的CD26陽性率（OR為17.00）與正常子宮內(nèi)膜增生期（OR為1.00）相比明顯增高，分泌期的CD26表達水平＞增生期，兩者的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Ⅰ型EC的G1、G2、G3級組織中的CD26陽性率分別為37.50%（15/40）、62.50%（25/40）、85.00%（34/40），G1、G2及G3級組織中的CD26陽性率（ORG1為11.25、ORG2為18.75及ORG3為25.50）與正常子宮內(nèi)膜增生期（OR為1.00）比較明顯增高，G3級的CD26表達水平＞G2級＞G1級，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1，表1）。CD26表達水平與Ⅰ型EC病理分級呈正相關(guān)。

2.2 門診體檢的健康育齡女性及Ⅰ型EC患者的血清中的sCD26表達

采用ELISA檢測受試者血清中的sCD26表達水平發(fā)現(xiàn)，經(jīng)門診體檢的健康育齡女性血清中的sCD26表達水平均較低，正常子宮內(nèi)膜增生期與分泌期的sCD26表達水平進行比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；在Ⅰ型EC患者中，G3級患者血清中的sCD26表達水平與正常子宮內(nèi)膜增生期的健康育齡女性相比明顯增高，兩者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；雖Ⅰ型EC的G1級患者血清中的sCD26表達水平較低，但隨著EC病理分級增高，sCD26表達水平也明顯增加，G3級患者血清中的sCD26表達水平與正常子宮內(nèi)膜增生期的健康育齡女性相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測正常子宮內(nèi)膜及Ⅰ型EC病理不同分級組織中的CD26表達（H&E×200）Figure 1 The expression of CD26 protein was detected in the normal endometrium and different pathological degree of I EC tissues by immunohistochemistry(H&E×200)

表1 60例正常子宮內(nèi)膜及120例I型EC病理不同分級組織中的CD26表達Table 1 CD26 expression in 60 normal and 120 different pathological grades of typeⅠEC groups

表2 40例門診體檢的健康育齡女性及55例I型EC病理不同分級患者血清中的sCD26表達Table 2 The level of soluble CD26 in the serum of 40 healthy women and 55 patients with different pathological grades of typeⅠEC groups

3 討論

近年來，研究表明CD26在腫瘤發(fā)生、發(fā)展特別是在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用［4］。但有關(guān)CD26表達水平在不同腫瘤中的研究報道卻有不同。在某些腫瘤中，CD26作為腫瘤抑制因子發(fā)揮抑制作用［5-6］，而在另一些腫瘤中，CD26卻又是與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的蛋白［7］。

目前國內(nèi)外關(guān)于CD26與EC發(fā)生、發(fā)展關(guān)系的研究報道較少，國外Khin等［8］通過免疫組織化學(xué)法及流式細(xì)胞術(shù)分別檢測了CD26在EC組織中及子宮內(nèi)膜癌各細(xì)胞系中的表達，認(rèn)為其表達水平與病理分級呈負(fù)相關(guān)。國內(nèi)邸石等［9］采用免疫組織化學(xué)法檢測了子宮內(nèi)膜樣腺癌中的CD26表達，與Khin等［8］得出的結(jié)論一致。隨著CD26在腫瘤中作用機制的研究深入，越來越多的研究得出與之前研究結(jié)果相悖的結(jié)論。在對卵巢癌的研究中，既往研究認(rèn)為［5］CD26高表達可抑制卵巢腫瘤惡性表型，對卵巢具有保護作用。但最近的研究卻發(fā)現(xiàn)CD26參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展，且CD26表達水平越高，患者生存期越短，預(yù)后越差，并認(rèn)為CD26為上皮性卵巢癌的潛在預(yù)測標(biāo)記物［7］。同樣，在其他腫瘤的研究中也出現(xiàn)與之前研究結(jié)果相悖的結(jié)論［6］。因此進一步深入探究CD26在EC中的作用及作用機制顯得尤為重要。

本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)在EC細(xì)胞中，當(dāng)CD26過表達后可促進體外癌細(xì)胞的增殖和遷移，而干擾CD26表達后則可以抑制癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，CD26在正常子宮內(nèi)膜的增生期、分泌期及Ⅰ型EC病理不同分級的組織中均有表達。在正常子宮內(nèi)膜分泌期組織中的CD26表達水平＞增生期，在Ⅰ型EC的G3級組織中的CD26表達水平＞G2級＞G1級，CD26表達與病理分級呈正相關(guān)。本研究與既往報道的EC組織中的CD26表達有所區(qū)別［9］，可能與病例選擇或檢測方法的不同有關(guān)，有待于今后增加臨床組織樣本，尤其是在Ⅱ型EC組織樣本中研究分析。

為進一步明確CD26在EC發(fā)生、發(fā)展中的作用及明確CD26是否可以作為血液的早期檢測、病情進展及晚期復(fù)發(fā)的評估指標(biāo)，本研究在對臨床組織樣本研究的基礎(chǔ)上，進一步采集了門診體檢的健康育齡女性及病理不同分級的Ⅰ型EC患者的血清標(biāo)本，檢測其血清中的sCD26表達水平。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處于月經(jīng)周期增生期及分泌期的正常育齡女性血清中的sCD26表達水平均較低。在Ⅰ型EC患者中隨著病理分級的增高，sCD26表達水平逐漸增加，G3級患者血清中的sCD26表達水平明顯高于健康育齡女性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。盡管本研究中的sCD26表達水平隨著Ⅰ型EC病理分級增高逐漸增加，但G1級患者血清中的sCD26的表達水平與正常子宮內(nèi)膜增生期的健康育齡女性相比無顯著性差異，這一結(jié)果還有待于今后進一步標(biāo)準(zhǔn)化樣本及增加樣本量來進行驗證并解釋。本研究對Ⅰ型EC患者血清中的sCD26表達水平進行檢測，并分析了與EC病理分級的關(guān)系，Ⅰ型EC患者血清中的sCD26表達水平增加或可成為臨床EC血液檢測標(biāo)記物的一個新方向，對EC的發(fā)生、發(fā)展具有一定的預(yù)測意義。

綜上所述，對于Ⅰ型EC患者，EC組織中的CD26表達與病理分級呈正相關(guān)，血清中的sCD26表達水平亦與EC疾病的進展密切相關(guān)，這將有助于揭示EC發(fā)生、發(fā)展的機制，為EC的診斷、治療提供新的參考依據(jù)。

[1]Aliyari Serej Z,Ebrahimi Kalan A,Mehdipour A,et al.Regulation and roles of CD26/DPPIV in hematopoiesis and diseases[J].Biomed Pharmacother,2017,91:88-94.

[2]Beckenkamp A,Willig JB,Santana DB,et al.Differential expression and enzymatic activity of DPPIV/CD26 effects migration ability of cervical carcinoma cells[J].PloS One,2015,10(7):e0134305.

[3]Yazbeck R,Jaenisch SE,Abbott CA.Potential disease biomarkers:dipeptidyl peptidase 4 and fibroblast activation protein[J].Protoplasma,2018,255(1):375-386.

[4]Beckenkamp A,Davies S,Willig JB,et al.DPPIV/CD26:a tumor suppressor or a marker of malignancy[J]?Tumour Biol,2016,37(6):7059-7073.

[5]Kajiyama H,Shibata K,Ino K,et al.The expression of dipeptidyl peptidase IV(DPPIV/CD26)is associated with enhanced chemosensitivity to paclitaxel in epithelial ovarian carcinoma cells[J].Cancer Sci,2010,101(2):347-354.

[6]Nazarian A,Lawlor K,Yi SS,et al.Inhibition of circulating dipeptidyl peptidase 4 activity in patients with metastatic prostate cancer[J].Mol Cell Proteomics,2014,13(11):3082-3096.

[7]Zhang M,Xu L,Wang X,et al.Expression levels of seprase/FAPαand DPPIV/CD26 in epithelial ovarian carcinoma[J].Oncol Lett,2015,10(1):34-42.

[8]Khin EE,Kikkawa F,Ino K,et al.Dipeptidyl peptidase IV expression in endometrial endometrioid adenocarcinoma and its inverse correlation with tumor grade[J].Am J Obstet Gynecol,2003,188(3):670-676.

[9]Di S,Zhou J,Chen HZ.Expression and significance of CD26/DDPIV in endometrial eendometrioid adenocarcinama[J].Medical J Wuhan University,2011,32(4):454-456.[邸石,周雋,陳惠禎.二肽基肽酶Ⅳ在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達及意義[J].武漢大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2011,32(4):454-456.]

[10]Yang X,Zhang X,Wu R,et al.DPPIV promotes endometrial carcinoma cell proliferation,invasion and tumorigenesis[J].Oncotarget,2017,8(5):8679-8692.