LAPTM4B-35和MMP-9在胃癌中表達(dá)及臨床意義

張靜怡 單麗珠 張潔 張侖

胃癌是常見的消化道腫瘤之一，流行病學(xué)研究推測至2020年全球每年新發(fā)胃癌將達(dá)80萬例［1］。胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素和多步驟的過程，其中涉及一系列分子生物學(xué)的變化，并與遺傳和環(huán)境因素密切相關(guān)。目前經(jīng)典的生物標(biāo)志物和分期系統(tǒng)存在一定局限性，因此探索敏感度和特異度較高的腫瘤標(biāo)記物，早期發(fā)現(xiàn)胃癌，能夠提高胃癌患者生存率［2］。溶酶體相關(guān)4次跨膜蛋白B（lysosome-associated transmembrane protein 4β，LAPTM4B）-35基因于2000年首次通過熒光差異顯示技術(shù)在原發(fā)性肝細(xì)胞癌克隆出來，LAPTM4B表達(dá)蛋白的N端和C端富含脯氨酸，目前研究認(rèn)為LAPTM4B-35通過影響細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)影響細(xì)胞生物學(xué)變化［3］。其中LAPTM4B-35基因與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展及生物學(xué)行為密切相關(guān)，最近研究顯示其與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［4］?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一組與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白重塑過程密切相關(guān)的蛋白酶，目前有26個(gè)MMPs被發(fā)現(xiàn)［5］。其中MMP-9在調(diào)節(jié)腫瘤生長、血管生成和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要作用［6］。然而目前對LAPTM4B-35和MMP-9在胃癌中作用及相互作用研究較少，尤其是臨床標(biāo)本中的應(yīng)用，因此本研究探討LAPTM4B-35和MMP-9在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2006年1月至2011年12月在天津市南開醫(yī)院和天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院實(shí)施胃癌根治術(shù)并具有完整臨床病理資料的胃癌患者隨訪記錄。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）病理診斷為胃腺癌；2）接受胃癌根治性R0切除；3）清掃淋巴結(jié)數(shù)目＞15枚；4）術(shù)前檢查無腹腔、肝、肺等遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移；5）具有完整隨訪資料的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）術(shù)前接受新輔助放化療；2）生存期不足1個(gè)月的患者。經(jīng)篩選共納入152例，患者術(shù)后進(jìn)行病理分型，分級分期參考美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）第7版（2010年）胃癌TNM分期。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞株mRNA檢測 正常胃黏膜細(xì)胞株GES-1及胃癌細(xì)胞株HGC-27、SGC7901、MGC803由天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院公共實(shí)驗(yàn)室提供；細(xì)胞系保持溫度為37℃、所需環(huán)境為5%CO2和95%空氣，RPMI 1640培養(yǎng)基及10%胎牛血清和青霉素、鏈霉素均購自北京索萊寶生物有限公司。本研究首先對總RNA進(jìn)行提取，瓊脂糖凝膠電泳檢測總體RNA，濃度與純度采用紫外分光光度計(jì)檢測。以O(shè)ligo-dT（購自北京通瑞生物有限公司）為引物，參照20 μL反應(yīng)體系合成cDNA第一鏈。引物序列為LAPTM4B-35：5'-GGAAGCAGG ACAGCCAACTT/TTATTCTCGATCTCACAACCAAC-3'；MMP-9：5'-AGGACGGCAATGCTGATG/GTGGTGGCGG TTGATGCT-3′；β-actin：5′-CCTGTGGCATCCACGAAA CT/GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3′。預(yù)變性95℃30s，退火30 s，擴(kuò)展53.5℃30 s，40個(gè)循環(huán)，最后延伸57.5℃10 min。每個(gè)基因進(jìn)行3次檢測。通過PCR儀自動(dòng)生成Ct（2-ΔΔCt）值。

1.2.2 免疫組織化學(xué)及陽性判定 常規(guī)對標(biāo)本進(jìn)行烤片、脫蠟、水化，加入檸檬酸鈉緩沖液抗原修復(fù)，將3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶及5%羊血清封閉石蠟標(biāo)本30 min，加用LAPTM4B-35兔抗人單克隆抗體（1∶50稀釋）或MMP-9兔抗人單克隆抗體（1∶50稀釋）室溫孵育2 h，將石蠟標(biāo)本用PBS洗滌，然后將辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG室溫滴加孵育30 min，使用DAB顯色，顯色后用流水沖洗，然后用蘇木素復(fù)染，最后用乙醇、二甲苯脫水，最后封片鏡檢。未加一抗者為陰性對照。

在光學(xué)顯微鏡200倍的視野下進(jìn)行觀察。陽性細(xì)胞率計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：視野下陽性細(xì)胞＜5%為0分，5%～24%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。著色強(qiáng)度：無染色0分，淡黃色染色為1分，黃色為2分，深棕黃色為3分；采取染色強(qiáng)度和腫瘤細(xì)胞陽性率綜合評價(jià)染色指數(shù)。陽性細(xì)胞率計(jì)分乘以著色強(qiáng)度所得評價(jià)染色指數(shù)：≤3分為陰性，＞3分為陽性［7］。

1.2.3 隨訪 對胃癌術(shù)后患者定期復(fù)查，復(fù)查內(nèi)容包括腫瘤標(biāo)記物，必要時(shí)行胃鏡檢查及CT相關(guān)檢查。所有患者術(shù)后進(jìn)行電話隨訪，隨訪截止日期為2017年7月1日。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。胃癌細(xì)胞株和正常胃黏膜細(xì)胞株中mRNA的表達(dá)差異比較采用t檢驗(yàn)，LAPTM4B-35和MMP-9蛋白表達(dá)與臨床病理因素之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，單因素分析采用Ka?plan-Merier法，組間差異分析采用Log-rank法，將單因素有意義的因素納入Cox回歸進(jìn)行多因素分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 本組胃癌患者臨床病理情況

本研究共納入152例胃癌患者，患者臨床基本病理特征：男性86例，女性66例；平均年齡59.4歲，≤60歲106例，＞60歲56例；腫瘤最大直徑≤5 cm 102例，＞5 cm 50例；遠(yuǎn)端1/3胃癌59例，中1/3胃癌60例，近端1/3胃癌33例；Lauren's分型腸型107例，彌漫性45例；高中分化癌12例，低分化癌140例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N分期：N0期48例、N1期28例、N2期30例、N3期46例；腫瘤浸潤T分期：T1期10例、T2期4例、T3期9例、T4期129例；患者5年生存率為43.4%。

2.2 胃癌細(xì)胞株及正常胃黏膜細(xì)胞中mRNA的表達(dá)水平

LAPTM4B-35 mRNA 在 HGC-27（0.34±0.07）、SGC7901（0.29±0.09）和 MGC803（0.37±0.06）胃癌細(xì)胞株相對表達(dá)量明顯高于GES-1（0.17±0.05）胃黏膜細(xì)胞株，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。

MMP-9 mRNA在HGC-27（0.39±0.06）、SGC7901（0.23±0.05）和MGC803（0.32±0.07）胃癌細(xì)胞株相對表達(dá)量明顯高于GES-1（0.09±0.03）胃黏膜細(xì)胞株，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 LAPTM4B-35 mRNA與MMP-9 mRNA在不同胃癌細(xì)胞株內(nèi)的表達(dá)Figure 1 LAPTM4B-35 mRNA and MMP-9 mRNA expression in different gastric cancer cell lines

2.3 LAPTM4B-35和MMP-9蛋白表達(dá)與臨床病理因素的相關(guān)性

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示LAPTM4B-35和MMP-9均在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)（圖2）。本組胃癌石蠟標(biāo)本中LAPTM4B-35陽性表達(dá)77例，陽性表達(dá)率為50.7%；MMP-9陽性表達(dá)56例，陽性表達(dá)率為36.8%。相關(guān)分析顯示LAPTM4B-35的表達(dá)與MMP-9的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.027，P=0.003）。

結(jié)合臨床病理因素相關(guān)分析顯示Lauren's分型（P=0.027）和腫瘤浸潤T分期（P=0.006）與LAPTM4B-35表達(dá)相關(guān)，發(fā)現(xiàn)浸潤深度越深，LAPTM4B-35陽性表達(dá)越高；腫瘤大小（P=0.001）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N分期（P＜0.001）與MMP-9表達(dá)密切相關(guān)，發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越多，MMP-9陽性表達(dá)越高（表1）。

2.4 患者預(yù)后生存分析

預(yù)后單因素分析結(jié)果顯示性別、年齡、Lauren's分型和腫瘤大小與胃癌患者預(yù)后無相關(guān)（P＞0.05），而腫瘤的部位（P=0.027）、分化程度（P=0.004）、腫瘤浸潤T分期（P＜0.001）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N分期（P＜0.001）、LAPTM4B-35表達(dá)（P＜0.001）和 MMP-9表達(dá)（P＜0.001）與胃癌患者預(yù)后相關(guān)。Cox多因素分析結(jié)果顯示分化程度（HR=4.075，P=0.021）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N分期（HR=1.413，P＜0.001）、LAPTM4B-35表達(dá)（HR=1.733，P=0.010）與MMP-9表達(dá)（HR=1.591，P=0.031）是胃癌患者獨(dú)立預(yù)后因素（表2）。根據(jù)LAPTM4B-35和MMP-9表達(dá)進(jìn)行預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)陰性表達(dá)患者預(yù)后明顯好于陽性表達(dá)患者（圖3）。

根據(jù)LAPTM4B-35和MMP-9表達(dá)，將患者分為LAPTM4B-35（+）MMP-9（+）30例、LAPTM4B-35（+）MMP-9（-）47例、LAPTM4B-35（-）MMP-9（+）26例、LAPTM4B-35（-）MMP-9（-）49例，預(yù)后生存分析發(fā)現(xiàn)共表達(dá)陽性患者預(yù)后最差，而單獨(dú)表達(dá)陽性患者之間生存無顯著性差異（圖4）。

圖2 免疫組織化學(xué)檢測LAPTM4B-35與MMP-9在胃癌組織表達(dá)（IHC×400）Figure 2 LAPTM4B-35 and MMP-9 expression in gastric cancer tissue sections(IHC×400)

表1 胃癌患者LAPTM4B-35和MMP-9表達(dá)與臨床病理因素之間相關(guān)性Table 1 Relationship of LAPTM4B-35 or MMP-9 expression with clinicopathological factors

表1 胃癌患者LAPTM4B-35和MMP-9表達(dá)與臨床病理因素之間相關(guān)性（續(xù)表1）Table 1 Relationship of LAPTM4B-35 or MMP-9 expression with clinicopathological factors

表2 胃癌患者預(yù)后單因素和多因素分析Table 2 Univariate and multivariate analysis of factors influencing OS

表2 胃癌患者預(yù)后單因素和多因素分析（續(xù)表2）Table 2 Univariate and multivariate analysis of factors influencing OS

圖3 LAPTM4B-35與MMP-9表達(dá)與患者5年OS的關(guān)系Figure 3 Relationship of LAPTM4B-35 and MMP-9 expression with 5-year OS

圖4 LAPTM4B-35和MMP-9共表達(dá)情況預(yù)后生存分析Figure 4 Prognostic survival analysis based on co-expression of LAPTM4B-35 and MMP-9

3 討論

LAPTM4B基因定位于8q22.1，長約50 kb，共含有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子，DNA全長為2 245個(gè)核苷酸。根據(jù)其表達(dá)產(chǎn)物存在4個(gè)穿膜區(qū)、有典型的溶酶體定位信號集，因此該基因被命名為溶酶體相關(guān)4次跨膜蛋白B，即LAPTM4B［8］。LAPTM4B有2種亞型，LAPTM4B-35和 LAPTM4B-24，研 究發(fā)現(xiàn)LAPTM4B-35過表達(dá)時(shí)抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)增殖、遷移及侵襲，并通過啟動(dòng)PI3K/AKT信號通路逆轉(zhuǎn)耐藥［9］。研究發(fā)現(xiàn)LAPTM4B-35基因多態(tài)性或過表達(dá)與肝癌、肺癌、胃癌等發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有顯著相關(guān)性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)LAPTM4B-35高表達(dá)于乳腺癌、肺癌、膽囊癌、結(jié)腸癌、惡性膠質(zhì)瘤等腫瘤中［10］。Dong等［11］發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤中Ⅱ級膠質(zhì)瘤LAPTM4B-35表達(dá)低于Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤，推測LAPTM4B-35可能與膠質(zhì)瘤發(fā)展密切相關(guān)。Kong等［12］發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)的LAPTM4B-35基因與腫瘤的復(fù)發(fā)密切相關(guān)。這些研究表明LAPTM4B-35與腫瘤發(fā)生和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)LAPTM4B-35 mRNA在胃癌細(xì)胞株中表達(dá)明顯高于正常黏膜組織，進(jìn)一步相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)胃癌組織中LAPTM4B-35蛋白表達(dá)與Lau?ren's分型和腫瘤浸潤T分期密切相關(guān)，推測高表達(dá)的LAPTM4B-35可能與胃癌發(fā)展密切相關(guān)。

MMP-9已在多種惡性腫瘤中被發(fā)現(xiàn)高表達(dá)。MMP-9主要通過降解細(xì)胞膠質(zhì)蛋白和Ⅳ、Ⅴ、Ⅺ、ⅩⅥ型膠原蛋白促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［13-14］。在非小細(xì)胞肺癌患者中，發(fā)現(xiàn)血清中MMP-9明顯較正?；颊呱?，Sampieri等［15］發(fā)現(xiàn)MMP-9在結(jié)直腸癌細(xì)胞中高表達(dá)，并且與結(jié)直腸癌的侵襲性轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Ruokolainen等［16］發(fā)現(xiàn)MMP-9在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌高表達(dá)，然而與臨床病理因素結(jié)合，未發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與臨床病理因素之間無相關(guān)性。有研究表明在胃癌中MMP-9表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)［6］，推測MMP-9在不同腫瘤中發(fā)揮不同作用。本研究同樣發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞株中MMP-9 mRNA表達(dá)較高，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)胃癌組織中陽性MMP-9的表達(dá)與較大的腫瘤和較多的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此推測MMP-9可能在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)揮作用，與部分研究相一致［17］。

在預(yù)后生存方面，Cox多因素分析發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LAPTM4B-35表達(dá)和MMP-9表達(dá)是本組胃癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)LAPTM4B-35陰性表達(dá)患者和MMP-9陰性表達(dá)患者預(yù)后差于LAPTM4B-35陽性表達(dá)患者和MMP-9陽性表達(dá)患者。本研究還發(fā)現(xiàn)本組胃癌患者LAPTM4B-35表達(dá)和MMP-9表達(dá)呈正相關(guān)，推測LAPTM4B-35和MMP-9相互作用，共同促進(jìn)胃癌的發(fā)展。根據(jù)LAPTM4B-35和MMP-9共表達(dá)進(jìn)行分析，共表達(dá)陽性患者預(yù)后最差，共表達(dá)陰性預(yù)后最好，而表達(dá)一種陽性患者之間的預(yù)后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，聯(lián)合LAPTM4B-35和MMP-9可預(yù)測胃癌患者預(yù)后，通過檢測LAPTM4B-35與MMP-9表達(dá)有助于鑒別高危胃癌患者，從而選擇合適的治療。

本研究尚有不足之處，如LAPTM4B-35是否為MMP-9上游基因尚未明確，以及LAPTM4B-35敲除對胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響等需要進(jìn)一步深入探討。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)LAPTM4B-35和MMP-9在胃癌細(xì)胞和胃癌組織中高表達(dá)，LAPTM4B-35和MMP-9表達(dá)可能與胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。

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