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    野生魚(yú)腥草甲醇提取物工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

    2017-02-05 15:38羅秋水周志娥湯凱潔李奔
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年10期
    關(guān)鍵詞:抗氧化活性提取工藝

    羅秋水++周志娥++湯凱潔++李奔++劉鵬飛

    doi:10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.098

    摘要:為研究并優(yōu)化野生魚(yú)腥草甲醇提取工藝及其體外抗氧化能力,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn),通過(guò)方差分析、多重比較確定最優(yōu)提取工藝。用羥基自由基(·OH)的清除作用、總抗氧化能力、1,1-二苯基-2-苯基自由基(DPPH·)清除作用及清除亞硝酸鹽(NO-2)能力的測(cè)定方法評(píng)價(jià)甲醇提取物體外抗氧化活性。結(jié)果表明:最佳提取工藝條件為料液比1 g ∶35 mL、提取時(shí)間1.0 h、提取溫度80 ℃、甲醇體積分?jǐn)?shù)70%;甲醇提取物在0~1 mg/mL濃度范圍具有明顯的抗氧化活性,并且隨著濃度的增大,活性增強(qiáng);當(dāng)甲醇提取物的濃度為1 mg/mL時(shí),其對(duì)羥基自由基的清除率達(dá)到50.23%,對(duì)DPPH·的清除率達(dá)78.86%,對(duì)亞硝酸鹽的清除率高達(dá)8724%;與對(duì)照品維生素C相比,提取物的總抗氧化能力與其接近。因此可知,野生魚(yú)腥草甲醇提取物具有明顯體外抗氧化活性。

    關(guān)鍵詞:野生魚(yú)腥草;甲醇提取物;提取工藝;抗氧化活性

    中圖分類(lèi)號(hào):R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A文章編號(hào):1002-1302(2016)10-0337-03

    收稿日期:2015-09-11

    基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào):31101294)。

    作者簡(jiǎn)介:羅秋水(1977—),男,江西樟樹(shù)人,碩士,實(shí)驗(yàn)師,從事食品質(zhì)量與安全研究。E-mail:lqsh2001@126.com。

    通信作者:湯凱潔,博士,副教授,從事食品質(zhì)量與安全研究。E-mail:tkjie999@sina.com。魚(yú)腥草(Houttuyniae)別稱(chēng)紫蕺、野花麥、折耳根等,主要分布于中國(guó)中部、東南及西南部各省(區(qū)),以長(zhǎng)江以南各省份為主,包括川、鄂、贛、湘、黔等省[1]。魚(yú)腥草在民間傳統(tǒng)中醫(yī)上具有一定的藥用價(jià)值[2],其中所含的功效成分包括黃酮類(lèi)化合物、揮發(fā)性物質(zhì)、多糖等,其中黃酮類(lèi)化合物包括榭皮素、榭皮苷、瑞諾苷、蕓香苷等[3]。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中,魚(yú)腥草廣泛應(yīng)用于治療肺膿瘍、痰熱咳嗽、尿路感染等。魚(yú)腥草的主要抗菌成分是魚(yú)腥草素,對(duì)各種致病菌、流感病毒等有抑制作用[4-6],特別是對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用非常明顯。近年來(lái)又發(fā)現(xiàn)魚(yú)腥草有新的用途,如治療喘息型肺炎,此外對(duì)病毒性心肌炎、小兒呼吸感染均有療效。目前,隨著醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)︳~(yú)腥草研究的深入,魚(yú)腥草化學(xué)成分的作用機(jī)理更加清晰,藥用價(jià)值及食用價(jià)值已被越來(lái)越多的人重視。魚(yú)腥草兼具食品保健功能特性,生物活性成分較高,與西藥相比具有特殊醫(yī)藥功效[7],因此魚(yú)腥草的藥用價(jià)值、食用價(jià)值的前景將十分可觀。本研究通過(guò)魚(yú)腥草甲醇提取物的體外抗氧化活性試驗(yàn),以期為野生魚(yú)腥草的進(jìn)一步充分利用提供參考和借鑒。

    1材料與方法

    1.1材料與試劑

    野生魚(yú)腥草采摘于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)。鄰菲羅啉,天津永大化學(xué)試劑有限公司;1,1-二苯基-2-苯基自由基(DPPH·),北京中生瑞泰科技有限公司;維生素C、無(wú)水乙醇、鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、雙氧水、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、氫氧化鈉、濃硫酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉、檸檬酸、草酸、磷酸鈉、氨基苯磺酸鈉,均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2儀器與設(shè)備

    723可見(jiàn)分光光度計(jì),尤尼柯(上海)儀器有限公司;BS224S 電子天平,賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;DZG-6020真空干燥箱,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;移液器,Thermos;SB-3200DTD超聲波清洗機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司;UV752紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),上海諾科儀器儀表有限公司;DHG-9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;XY-200高速多功能粉碎機(jī),浙江省永康市松青五金工具廠;TCL5M臺(tái)式低速大容量冷凍離心機(jī),長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司。

    1.3野生魚(yú)腥草甲醇提取工藝優(yōu)化

    1.3.1單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)稱(chēng)取1.0 g魚(yú)腥草粉末,以甲醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1 g ∶mL、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間1 h為單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)條件。當(dāng)研究某一因素時(shí),使其他條件保持不變。甲醇體積分?jǐn)?shù)分別設(shè)為50%、60%、70%、80%、90%,料液比分別設(shè)為1 g ∶20 mL、1 g ∶25 mL、1 g ∶30 mL、1 g ∶35 mL、1 g ∶40 mL,提取時(shí)間分別設(shè)為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h,提取溫度分別設(shè)為50、60、70、80、90 ℃。按上述設(shè)計(jì)分別做單因素不同水平的試驗(yàn),所得提取物在電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干,按照下面公式計(jì)算提取物得率:

    提取物得率=(m2-m1)/m0×100%。

    式中:m2為空瓶+提取物質(zhì)量,g;m1為空瓶質(zhì)量,g;m0為樣品質(zhì)量,g。

    1.3.2正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)為了綜合考慮各因素對(duì)野生魚(yú)腥草甲醇提取物得率的影響,根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取甲醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取溫度4個(gè)因素,采用 L9(34) 正交設(shè)計(jì)對(duì)野生魚(yú)腥草甲醇提取條件進(jìn)行優(yōu)化,正交試驗(yàn)因素水平詳見(jiàn)表1。

    1.4野生魚(yú)腥草甲醇提取物的測(cè)定

    1.4.1野生魚(yú)腥草甲醇提取物的制備及提取得率計(jì)算將野生魚(yú)腥草清除黃葉、洗凈、烘干、剪碎、粉碎后放入干燥器中

    1.4.2甲醇提取物濃度和對(duì)照品維生素C的配制準(zhǔn)確稱(chēng)取0.500 g甲醇提取物,配制成濃度為1 000 μg/mL的樣品溶液,并以此為基準(zhǔn),逐步稀釋配制200、400、600、800、1 000 μg/mL 的樣品溶液。按同樣方法配制同樣系列濃度梯度的維生素C標(biāo)準(zhǔn)液,將二者存儲(chǔ)于冰箱備用。

    1.4.3對(duì)羥基自由基(·OH)的清除作用參考鄰二氮菲-金屬離子-H2O2[8],同時(shí)采用Fenton反應(yīng)(H2O2+Fe2+→·OH+H2O+Fe3+)獲得羥基自由基,反應(yīng)過(guò)程中將鄰二氮菲-Fe2+氧化為鄰二氮菲-Fe3+,通過(guò)全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn),在 510 nm 處最大吸收峰消失,從而可以在510 nm處測(cè)其吸光度,通過(guò)測(cè)定樣品在該波長(zhǎng)處的吸光度可判斷羥基自由基存在的量,并以此計(jì)算羥基自由基清除率。具體方法:(1)取磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH值=7.4)2.0 mL于試管中并加入8.0 mL蒸餾水,搖勻作為空白管;(2)取2.0 mL磷酸鹽緩沖液、1.5 mL 5 mmol/L鄰二氮菲、1.0 mL 7.5 mmol/L硫酸亞鐵和5.5 mL蒸餾水于試管中,搖勻作為未損傷管A;(3)以A管為基準(zhǔn),在此基礎(chǔ)上加入0.1% H2O2 1.0 mL、蒸餾水 4.5 mL,搖勻作損傷管并標(biāo)記為B;(4)以B管為基準(zhǔn),在該基礎(chǔ)上分別加入1.0 mL各樣品溶液,搖勻后作為樣品管并標(biāo)記為C;(5)將上述所有試管混勻后置于37 ℃恒溫水鍋中保溫30 min,然后取出并定容到10 mL,在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)以下公式計(jì)算各個(gè)濃度對(duì)羥基自由基清除率:

    ·OH清除率=[(DC-DB)/(DA-DB)]×100%。(1)

    1.4.4清除亞硝酸鹽(NO-2)的能力[9-10]分別取3 mL各濃度的樣液加入到具塞試管中,用檸檬酸緩沖液(pH值=3.0)定容至5 mL。分別向每支管中加入0.1 mL亞硝酸鈉(200 μg/mL),混勻后立即置于37 ℃恒溫水浴鍋中保溫 1.5 h。同時(shí),空白管不加亞硝酸鈉;亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)管不加亞硝酸鈉及樣品,其余相同。通過(guò)鹽酸萘乙二胺比色法[11]測(cè)定各管的吸光度(D540 nm)。根據(jù)以下公式計(jì)算各個(gè)濃度對(duì)亞硝酸鹽(NO-2)的清除率:

    NaNO2清除率= [D標(biāo)-(D樣-D空)]/D標(biāo)×100%。(2)

    1.4.5清除DPPH·的清除作用[12]甲醇提取物清除DPPH·能力的測(cè)定:取10 mg DPPH標(biāo)準(zhǔn)品,用95%乙醇為溶劑配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的溶液;各取1 mL甲醇提取物樣液于試管中,然后迅速加入3 mL配制好的DPPH乙醇溶液,快速搖勻并且置于室溫陰暗處反應(yīng)30 min;然后將反應(yīng)后各管迅速取出并在波長(zhǎng)為517 nm處測(cè)定吸光度(Da);同時(shí)按上述比例分別測(cè)定溶劑與DPPH混合后的吸光度(Dc)、試劑與樣液混合后的吸光度(Db)。按下式計(jì)算DPPH·清除率:

    DPPH·清除率=[1-(Da-Db)/Dc]×100%。(3)

    1.4.6總抗氧化力各取0.4 mL不同濃度的魚(yú)腥草甲醇提取液加入試管中,然后依次加入28 mmol/L磷酸鈉、0.6 mol/L 硫酸、4 mmol/L鉬酸銨,各4 mL,混勻后并置于 95 ℃ 恒溫水浴鍋中90 min,然后冷卻至室溫并在波長(zhǎng) 695 nm 處測(cè)其吸光度;以蒸餾水組作為空白管,所有測(cè)定均做3次平行試驗(yàn)[13]。

    2結(jié)果與分析

    2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

    當(dāng)提取時(shí)間為0.5~1.5 h時(shí),甲醇提取物得率增加速度較快;當(dāng)提取時(shí)間1.5~2.5 h時(shí),甲醇提取物得率變化趨勢(shì)有增有減。從節(jié)省時(shí)間來(lái)考慮,選取提取時(shí)間為1.0、1.5、2.0 h 做正交試驗(yàn)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí),甲醇提取物得率最大,之后得率明顯下降。從提取效果、減少溶劑用量考慮,分別選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、70%、80%做正交試驗(yàn)。當(dāng)提取溫度為40~50 ℃時(shí),甲醇提取物濃度較快增加至最大值,之后甲醇提取物濃度先降低再升高。從經(jīng)濟(jì)角度考慮,選取溫度70、80、90 ℃做正交試驗(yàn)。甲醇提取物得率隨料液比增加一直增大,在料液比為1 g ∶30 mL后增大緩慢。從提取效果和減少溶劑用量角度考慮,分別選擇料液比為 1 g ∶25 mL、1 g ∶30 mL、1 g ∶35 mL做正交試驗(yàn)。

    2.2正交試驗(yàn)結(jié)果、方差分析及多重比較

    由表2正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)可知,通過(guò)極值R大小得出各因素對(duì)提取物提取得率影響大小依次為料液比>甲醇體積分?jǐn)?shù)>提取時(shí)間>提取溫度。由表3方差分析可知,料液比、甲醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度4個(gè)因素對(duì)提取物提取率的影響都極顯著。由表4多重比較得出,最佳提取工藝為A3B1C2D2、A3B3C2D2。通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn),得出A3B1C2D2提取率最大,比正交表中的任何值還大,所以選擇最佳提取工藝條件為A3B1C2D2,此時(shí)提取得率為19.13%。

    2.3對(duì)羥基自由基的清除作用

    由圖1可知,甲醇提取物對(duì)羥基自由基的清除作用隨著濃度增加逐漸增大;當(dāng)濃度在0~600 μg/mL范圍內(nèi), 清除率呈直線增加;當(dāng)濃度在600~800 μg/mL時(shí),其清除率明顯加快;之后的清除率略有增加但趨勢(shì)變緩,在1 000 μg/mL濃度下維生素C對(duì)羥基自由基清除率達(dá)到75.49%,而樣品清除率為50.23%。

    2.4總抗氧化能力

    自由基含有1個(gè)不成對(duì)的電子原子團(tuán),在形成分子時(shí),自由基就會(huì)奪取其他物質(zhì)的1個(gè)電子, 從而使自己變得更加穩(wěn)定,這種現(xiàn)象稱(chēng)為氧化[14]。由圖2可以看出,魚(yú)腥草甲醇提取物D695 nm在濃度0~1000μg/mL范圍內(nèi)隨濃度增大而提高,其總抗氧化能與維生素C基本平行增大且接近。

    2.5對(duì)DPPH·的清除作用

    DPPH·乙醇溶液呈紫色,最大吸收波長(zhǎng)為517 nm。當(dāng)加入自由基清除劑到DPPH溶液中時(shí),其孤電子成對(duì),吸收消失或減弱,從而使溶液顏色變淺,并在517 nm處的吸光度變化趨勢(shì)與自由基清除率呈線性相關(guān)。因此,該法可以用來(lái)檢測(cè)某種物質(zhì)對(duì)自由基的清除能力,清除率越大則證明其清除自由基能力越強(qiáng)。由圖3可以看出,甲醇提取物對(duì)DPPH·清除率在0~1 000 μg/mL范圍內(nèi)一直增大,當(dāng)濃度為 1 000 μg/mL 時(shí),清除率達(dá)78.86%;對(duì)照品維生素C對(duì) DPPH· 清除率與甲醇提取物趨勢(shì)基本相同,但相比之下后者的清除效果更好,在1 000 μg/mL時(shí)清除率高達(dá)92.78%。

    2.6清除亞硝酸鹽(NO-2)的能力亞硝胺類(lèi)物質(zhì)能引起諸多慢性或惡性腫瘤。雖然在正常情況下,人們直接攝入該類(lèi)致癌物的量幾乎可以忽略,但食物中可形成N-亞硝胺類(lèi)的前體物質(zhì)卻大量存在,其中亞硝酸鹽是能夠形成N-亞硝胺類(lèi)的前體物質(zhì)[15]。由圖4可以看出,在0~200 μg/mL范圍內(nèi),維生素C對(duì)亞硝酸的清除能力均隨著濃度的增加迅速增大,之后增加比較平緩;當(dāng)濃度升高到1 000 μg/mL時(shí),清除率達(dá)到96.75%;甲醇提取物的濃度在0~200 μg/mL時(shí)清除亞硝酸的能力先增大后基本保持不變;但是當(dāng)濃度達(dá)到600 μg/mL后,其清除能力又迅速增大,并且在1 000 μg/mL時(shí)清除率高達(dá)87.24%。

    3結(jié)論

    根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,采用L9(34)正交試驗(yàn)對(duì)提取物的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì),料液比、甲醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)提取物得率影響均差異極顯著。各因素對(duì)提取物得率影響排序?yàn)榱弦罕?gt;甲醇體積分?jǐn)?shù)>提取時(shí)間>提取溫

    度。通過(guò)方差分析和多重比較后進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),可知最佳工藝參數(shù):料液比為1 g ∶35 mL、提取時(shí)間為1.0 h、提取溫度為 80 ℃、甲醇濃度為70%,此時(shí)提取得率為19.13%。

    甲醇提取物在0~1 000 μg/mL濃度范圍內(nèi)有較明顯的抗氧化活性,各指標(biāo)活性隨著濃度的增加而增強(qiáng);當(dāng)甲醇提取物的濃度為1 000 μg/mL時(shí),甲醇提取物對(duì)羥基自由基清除率為50.23%,對(duì)1,1-二苯基-2-苯基自由基的清除率達(dá)到78.86%,對(duì)亞硝酸鹽(NO-2)的清除率高達(dá)87.24%;甲醇提取物的總抗氧化能力和濃度呈正相關(guān),與對(duì)照品維生素C相比,總抗氧化力變化趨勢(shì)基本接近。

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