• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    希金斯炭疽菌磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C生物信息學分析

    2017-02-05 19:05韓長志
    江蘇農業(yè)科學 2016年10期
    關鍵詞:希金斯信號肽菜心

    doi:10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.046

    摘要:希金斯炭疽菌侵染菜心、蘿卜等十字花科植物引起炭疽病,給各國農業(yè)生產造成了巨大的經濟損失?;卺劸平湍傅湫偷牧姿峒〈继禺愋粤字窩(PI-PLC)序列,利用Blastp以及關鍵詞對該菌蛋白質數據庫進行比對、搜索,以及通過SMART分析,明確該菌存在8個典型的PI-PLC序列;通過生物信息學分析,明確上述PI-PLC序列在蛋白質二級結構組成、信號肽等方面均具有一定差異。遺傳關系比較分析明確該菌中的PI-PLC序列與禾谷炭疽菌(Colletorichum graminicola)、松針炭疽菌(C. fioriniae)等炭疽菌屬中的病菌具有較近的親緣關系。

    關鍵詞:希金斯炭疽菌;磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C;亞細胞定位;二級結構;炭疽菌屬

    中圖分類號:S432.4文獻標志碼: A文章編號:1002-1302(2016)10-0177-04

    收稿日期:2015-08-28

    基金項目:國家自然科學基金(編號:31560211);云南省森林災害預警與控制重點實驗室開放基金(編號:ZK150004);云南省優(yōu)勢特點重點學科生物學一級學科建設項目(編號:50097505);云南省高校林下生物資源保護及科用科技創(chuàng)新團隊項目(編號:2014015);云南省教育廳科學研究基金(編號:2014Y330)。

    作者簡介:韓長志(1981—),男,河北石家莊人,博士,講師,主要從事經濟林木病害生物防治與真菌分子生物學研究。Tel:(0871)63862918;E-mail:hanchangzhi2010@163.com。植物與病原菌互作過程中,眾多細胞信號轉導途徑參與其中,現已明確G蛋白信號途徑及其下游的MAPK信號傳導途徑和cAMP信號傳導途徑具有重要的作用。因此,學術界關于真菌RGS的研究產生了較多成果[1],磷酸肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)的一種異構體PI-PLC β為磷脂肌醇信號途徑PKC系統(tǒng)中的重要效應物[2],可以將4,5-二磷酸磷脂酰肌醇水解為三磷酸肌醇和二酰甘油,而上述分子均作為細胞信號轉導的第二信使,發(fā)揮著重要作用。

    希金斯炭疽菌(Colletotrichum higginsanum Sacc.)可以侵染菜心、蘿卜等十字花科蔬菜引起炭疽病,該菌現主要分布于美國、日本、印度等國家[3-5],在我國,由該菌侵染菜心引起的炭疽病成為影響菜心產量和品質的重要危害之一[6]。國內外對該菌的研究主要集中在病菌的生物學特性[7]、生防菌篩選[8]、遺傳轉化[9-10]以及不同營養(yǎng)元素(硅、氮、鉀等)[11-14]、外源酚酸類物質pHBA[15]控制病害等方面,同時,隨著該基因組序列的釋放[16],林春花等對其開展了MAPK途徑相關基因的找尋及信號通路簡圖的繪制工作[17],韓長志對其進行了RGS[18]、14-3-3[19]、septin[20]、AC、PITP等蛋白生物信息學分析。此外,對于該菌致病基因的研究,建立根癌農桿菌介導的轉化技術及直接重復重組介導的基因打靶等技術[9-10]。華中農業(yè)大學黃俊斌教授實驗室建立了希金斯炭疽菌轉化子的突變體庫,為進一步對這些轉化子基因功能研究提供了技術支持[21-22]。然而,對于該菌中存在的PI-PLC數量、功能尚不清楚。本研究利用釀酒酵母S288c(Saccharomyces cerevisiae S288c)中已經報道的PI-PLC氨基酸序列,通過在炭疽菌屬蛋白質數據庫中進行Blastp比對分析[23],以及通過關鍵詞搜索,獲得與釀酒酵母PI-PLC同源的希金斯炭疽菌序列,并通過保守結構域分析、疏水性分析、二級結構預測位等生物信息學分析以及遺傳關系分析,以期為進一步開展希金斯炭疽病菌的研究提供重要的指導。

    1材料與方法

    1.1材料

    根據釀酒酵母S288c中含有的1個PI-PLC氨基酸序列,利用炭疽菌屬蛋白質數據庫在線Blastp比對,同時通過輸入“phosphatidylinositol-specific Phospholipase”“Phospholipase C”“PLC”關鍵詞在上述數據庫中進行檢索PLC(表1)。

    1.2方法

    1.2.1保守結構域預測利用SMART網站[24]在線分析 PI-PLC所具有的保守結構域特征。

    1.2.2蛋白質疏水性預測利用Protscale程序[25]對PI-PLC進行疏水性測定。

    1.2.3蛋白質轉運肽及信號肽預測對蛋白質轉運肽的預測利用TargetP 1.1 Server在線分析實現[26],信號肽的預測則是利用SignalP 3.0 Server[27]在線分析實現。

    1.2.4蛋白質二級結構及跨膜區(qū)結構預測對蛋白質二級結構預測采用PHD[28]在線分析實現,利用TMHMM Server v. 2.0[27]實現PI-PLC的跨膜區(qū)結構預測。

    1.2.5亞細胞定位分析利用ProtComp v 9.0實現PI-PLC的亞細胞定位分析[29]。

    1.2.6系統(tǒng)進化樹構建在NCBI中,以希金斯炭疽菌中所含PI-PLC氨基酸序列為基礎,在線進行Blastp同源搜索,獲得來自不同物種的同源蛋白質序列。對所獲得的同源序列,利用ClustalX[30]進行多重比對分析,隨后利用 MEGA 5.2.2 軟件[31]構建系統(tǒng)進化樹。

    2結果與分析

    2.1希金斯炭疽菌中8個PI-PLC均具有典型的PLCXc或者PLCYc保守結構域

    通過Blastp比對分析,共獲得10個同源序列,同時,利用3個關鍵詞搜索,分別獲得8、9、7個蛋白序列,對上述蛋白進行整理、去除重復,共獲得9個蛋白,其ID分別為CH063_08309.1、CH063_07411.1、CH063_07011.1、CH063_05432.1、CH063_04045.1、CH063_03075.1、CH063_02624.1、CH063_00149.1、CH063_00100.1(表1)。其中,發(fā)現一個蛋白序列(CH063_04045.1)僅可以通過Phospholipase-C搜索到,不能通過“phosphatidylinositol-specific Phospholipase”“PLC”搜索到,該蛋白通過Blastp也未能比對到,有待于進一步核實;隨后,利用SMART在線分析,結果顯示,僅有8條序列具有典型的PLCXc保守域結構,同時還具有諸如PLCYc、C2等保守結構域(圖1)。

    對CH063_04045.1進行深入分析,明確該蛋白為肌醇鞘磷脂磷脂酶C,并不是G蛋白下游的效應因子,同時,基于SMART分析,該蛋白并不含有磷脂酶所含有的保守PLCXc或者PLCYc結構域,因此將該蛋白排除。根據上述分析,共獲得8條蛋白序列,依據其氨基酸大小進行排序,分別將其命名為ChPLC1、ChPLC2、ChPLC3、ChPLC4、ChPLC5、ChPLC6、ChPLC7、ChPLC8(表1)。

    2.2ChPLC2具有典型的信號肽區(qū)域

    通過SignalP分析,除ChPLC2在N端含有1個典型信號肽序列外,其他PI-PLC均不含有信號肽;同時,通過TMHMM分析,除ChPLC2在N端含有1個跨膜結構域外,其他PI-PLC均不含有跨膜結構域(圖1),鑒于TMHMM不能將蛋白中所含的信號肽與跨膜結構域嚴格區(qū)分,因此,ChPLC2在N端含有的序列結構是信號肽,而不是由TMHMM、SMART程序所預測的跨膜結構域(圖1)。

    2.3希金斯炭疽菌PI-PLC均為親水性蛋白

    通過疏水性分析,明確ChPLC1和ChPLC2、ChPLC3和ChPLC6、ChPLC4和ChPLC5在疏水性最強氨基酸殘基上相同,分別為L、I、V;ChPLC1和ChPLC8、ChPLC4和ChPLC6在親水性最強氨基酸殘基上相同,分別為R、E(表2)。盡管如此,其他PI-PLC彼此之間在親(疏)水性最強氨基酸殘基及位置方面仍然存在較大的差異(表2、圖2),推測在細胞信號轉導過程中,PI-PLC所具有的功能存在一定的差異性。

    2.4二級結構分析

    明確8個PI-PLC均含有無規(guī)卷曲、α-螺旋以及β-轉角,所占比例不盡相同。就所含的無規(guī)卷曲比例而言,ChPLC2最低,為17%,ChPLC8最高,為45%,其他PI-PLC所含比例集中于20%~35%;就所含的α-螺旋而言,ChPLC1最低,為5%,ChPLC7最高,為41%,其他PI-PLC所含比例集中于20%~40%;就β-轉角而言,ChPLC3最低,為5%,ChPLC1最高,為44%,其他PI-PLC所含比例集中于5%~25%(圖3)。

    2.5轉運肽及亞細胞定位分析

    轉運肽分析結果顯示,除ChPLC2明確定位于分泌途徑,ChPLC1、ChPLC4、ChPLC7定位于線粒體,其他PI-PLC定位在任何位置(表3)。為了更好地明確PI-PLC的亞細胞定位,利用ProtComp進行分析,結果顯示,ChPLC1、ChPLC7定位于線粒體,這與通過TargetP預測結果相同,ChPLC2定位于細胞膜,ChPLC3、ChPLC6定位于細胞核,ChPLC4、ChPLC5、ChPLC7定位于細胞質中(數據未顯示)。上述定位預測結果說明希金斯炭疽菌中數量眾多的PI-PLC定位情況不盡相同,在細胞信號轉導過程中發(fā)揮著不同的功能。

    2.6遺傳關系分析

    通過在NCBI中對PI-PLC進行Blastp比對,獲得與希金斯炭疽菌PI-PLC的同源序列,選擇炭疽菌屬真菌其他序列進行遺傳關系分析。結果顯示,就物種之間關系而言,該菌中的PI-PLC與禾谷炭疽菌、松針炭疽菌親緣關系較近;就該菌中的PI-PLC之間的關系而言,8個PI-PLC可以大致聚為五大類,具體而言,ChPLC6、ChPLC5、ChPLC7關系較近,為一類;ChPLC3與ChPLC1關系較近,為一類;ChPLC8、ChPLC4、ChPLC6各為一類。

    3結論與討論

    隨著希金斯炭疽菌全基因組序列的釋放[16],為深入解析該菌致病因子研究提供了重要的數據支撐,一些涉及G蛋白信號轉導途徑上的重要效應物[18,32]以及MAPK途徑上的重要蛋白得到進一步明確[17]。本研究基于前人研究成果,明確了該菌中存在7個典型的PI-PLC,初步明確了上述蛋白具有典型的PLCXc、PLCYc、C2等保守結構域、均為親水性蛋白等特點。盡管如此,希金斯炭疽菌中8個PI-PLC彼此之間在亞細胞定位、信號肽、二級結構組成方面存在一定差異,推測上述蛋白在不同位置發(fā)揮不同作用,同時,對上述PI-PLC與其他物種進行遺傳關系分析,明確希金斯炭疽菌與松針炭疽菌親緣關系較近,為進一步深入研究其他炭疽菌屬真菌PI-PLC打下堅實的理論基礎。通過深入解析希金斯炭疽菌中G蛋白信號轉導過程中的致病因子,有助于為開發(fā)用于以G蛋白信號通路為作用靶標的化學藥劑提供重要的理論意義。

    參考文獻:

    [1]趙勇,王云川,蔣德偉,等. 真菌G蛋白信號調控蛋白的功能研究進展[J]. 微生物學通報,2014,41(4):712-718.

    [2]孫大業(yè),崔素娟,孫穎. 細胞信號轉導——基礎篇[M].4版. 北京:科學出版社,2010.

    [3]沈瑞清,張萍,郭成瑾,等. 寧夏炭疽菌屬真菌資源研究[J]. 河南農業(yè)科學,2012,41(5):100-102,149.

    [4]梁惠凌,唐輝. 廣西常見花卉真菌性病害的防治[J]. 廣西園藝,2002(2):18-19.

    [5]Hyde K,Cai L,Cannon P,et al. Colletotrichum—names in current use[J]. Fungal Diversity,2009,39(1):147-182.

    [6]盧博彬,楊暹. 菜心炭疽病研究進展[J]. 長江蔬菜,2009(24):1-5.

    [7]周而勛,楊媚,張華,等. 菜心炭疽病菌菌絲生長、產孢和孢子萌發(fā)的影響因素[J]. 南京農業(yè)大學學報,2002,25(2):47-51.

    [8]況福元,吳小麗,呂風青,等. 菜心炭疽病菌拮抗細菌的篩選及鑒定[J]. 微生物學通報,2009,36(9):1350-1355.

    [9]Huser A,Takahara H,Schmalenbach W,et al. Discovery of pathogenicity genes in the crucifer anthracnose fungus Colletotrichum higginsianum,using random insertional mutagenesis[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions,2009,22(2):143-156.

    [10]Ushimaru T,Terada H,Tsuboi K,et al. Development of an efficient gene targeting system in Colletotrichum higginsianum using a non-homologous end-joining mutant and Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer[J]. Molecular Genetics and Genomics,2010,284(5):357-371.

    [11]楊暹,馮紅賢,楊躍生. 硅對菜心炭疽病發(fā)生、菜薹形成及硅吸收沉積的影響[J]. 應用生態(tài)學報,2008,19(5):1006-1012.

    [12]楊暹,陳曉燕,馮紅賢. 氮營養(yǎng)對菜心炭疽病抗性生理的影響Ⅰ.氮營養(yǎng)對菜心炭疽病及細胞保護酶的影響[J]. 華南農業(yè)大學學報,2004,25(2):26-30.

    [13]陳曉燕,楊暹,張璐璐. 氮營養(yǎng)對菜心炭疽病抗性生理的影響Ⅱ.氮營養(yǎng)對菜心炭疽病及膜脂過氧化作用的影響[J]. 華南農業(yè)大學學報,2004,25(3):1-5.

    [14]郭巨先,劉玉濤,楊暹. 鉀營養(yǎng)對菜薹(菜心)炭疽病發(fā)生和植株防御酶活性的影響[J]. 中國蔬菜,2012(14):86-89.

    [15]康云艷,周小萌,楊暹,等. pHBA對菜心炭疽病的誘導抗性及植株生理特性的影響[J]. 植物病理學報,2014,44(4):393-404.

    [16]OConnell R J,Thon M R,Hacquard S,et al. Lifestyle transitions in plant pathogenic Colletotrichum fungi deciphered by genome and transcriptome analyses[J]. Nature Genetics,2012,44(9):1060-1065.

    [17]林春花,蔡志英,黃貴修. 全基因組法繪制禾谷炭疽菌和希金斯炭疽菌中MAPK級聯(lián)信號途徑簡圖[J]. 熱帶作物學報,2012,33(4):674-680.

    [18]韓長志. 希金斯炭疽菌RGS蛋白生物信息學分析[J]. 生物技術,2014,24(1):36-41.

    [19]韓長志. 希金斯炭疽菌14-3-3蛋白生物信息學分析[J]. 湖北農業(yè)科學,2014,3(15):3669-3672.

    [20]韓長志. 希金斯炭疽菌中五個典型septin生物信息學分析[J]. 河南農業(yè)科學,2014,43(8):91-96.

    [21]周鵬. 希金斯刺盤孢T-DNA插入體庫的構建、篩選及相關突變體基因的克隆[D]. 武漢:華中農業(yè)大學,2011.

    [22]趙典. 希金斯刺盤孢T-DNA插入體庫的篩選及相關突變體基因的克隆[D]. 武漢:華中農業(yè)大學,2012.

    [23]Altschul S F,Madden T L,Schaffer A A,et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs[J]. Nucleic Acids Research,1997,25(17):3389-3402.

    [24]Letunic I,Doerks T,Bork P. SMART 7:recent updates to the protein domain annotation resource[J]. Nucleic Acids Research,2012,40(D1):D302-D305.

    [25]Gasteiger E,Hoogland C,Gattiker A,et al. Protein identification and analysis tools on the ExPASy server[M]. The proteomics protocols handbook:Springer,2005:571-607.

    [26]Emanuelsson O,Brunak S,Heijne G,et al. Locating proteins in the cell using TargetP,SignalP and related tools[J]. Nature Protocols,2007,2(4):953-971.

    [27]Bendtsen J D,Nielsen H,Heijne G,et al. Improved prediction of signal peptides:SignalP 3.0[J]. Journal of Molecular Biology,2004,340(4):783-795.

    [28]Kelley L A,Sternberg M J. Protein structure prediction on the Web:a case study using the Phyre server[J]. Nat Protoc,2009,4(3):363-371.

    [29]Emanuelsson O,Nielsen H,Brunak S,et al. Predicting subcellular localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence[J]. Journal of Molecular Biology,2000,300(4):1005-1016.

    [30]Thompson J D,Gibson T J,Higgins D G. Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX[M]//Current Protocols in Bioinformatics,2002.

    [31]Tamura K,Peterson D,Peterson N,et al. MEGA5:molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood,evolutionary distance,and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology Evolution,2011,28(10):2731-2739.

    [32]韓長志. 禾谷炭疽菌RGS蛋白生物信息學分析[J]. 微生物學通報,2014,41(8):1582-1594.于居龍,繆康,趙來成,等. 氰氟蟲腙與醚菊酯復配對稻飛虱的控制效果及其安全性評價[J]. 江蘇農業(yè)科學,2016,44(10):181-185.

    猜你喜歡
    希金斯信號肽菜心
    兼具理論與實踐品格的社區(qū)音樂著作——評李·希金斯《社區(qū)音樂的理論與實踐》
    淺析蕭伯納的作品
    運用計算機軟件預測木質部寄生屬信號肽
    煙草野火病菌Pseudomonas syringae pv. tabaci yuexi-1信號肽預測及分析
    內源信號肽DSE4介導頭孢菌素C酰化酶在畢赤酵母中的分泌表達
    完美替身
    禽類MHCⅡ類分子β鏈信號肽保守性分析
    華南地區(qū)中晚熟菜心冬季品種比較試驗
    碰到黑球以后
    日韩大片免费观看网站| 丝袜美腿诱惑在线| 国产一区二区激情短视频 | 五月天丁香电影| 国产精品久久久久久久久免| 男女床上黄色一级片免费看| 街头女战士在线观看网站| 最近最新中文字幕免费大全7| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 精品视频人人做人人爽| 精品免费久久久久久久清纯 | av国产精品久久久久影院| 秋霞在线观看毛片| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 操出白浆在线播放| av卡一久久| 老司机靠b影院| 18禁国产床啪视频网站| 国产一区二区三区av在线| 国产亚洲最大av| 亚洲一区中文字幕在线| 日本欧美视频一区| 国产成人精品久久久久久| 日日撸夜夜添| 99久国产av精品国产电影| 极品少妇高潮喷水抽搐| 精品免费久久久久久久清纯 | 9191精品国产免费久久| 国产亚洲精品第一综合不卡| 成年动漫av网址| 欧美日本中文国产一区发布| 在线看a的网站| 视频在线观看一区二区三区| 久久久久久久久免费视频了| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 黄色一级大片看看| 99热国产这里只有精品6| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲熟女毛片儿| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲精品aⅴ在线观看| 777米奇影视久久| 一本大道久久a久久精品| 亚洲图色成人| 免费观看av网站的网址| 国产男女内射视频| 亚洲精品第二区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产精品偷伦视频观看了| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲三区欧美一区| 国产探花极品一区二区| 久久久久精品久久久久真实原创| 一级毛片我不卡| 国产精品一二三区在线看| 免费黄色在线免费观看| 国产成人精品久久久久久| 天天操日日干夜夜撸| 丝袜美腿诱惑在线| 香蕉国产在线看| 91精品三级在线观看| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲精品中文字幕在线视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 久久97久久精品| 亚洲成色77777| 国产一区二区激情短视频 | 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲av在线观看美女高潮| 新久久久久国产一级毛片| 天天操日日干夜夜撸| 18禁观看日本| 丝袜脚勾引网站| 中文字幕精品免费在线观看视频| 国产免费视频播放在线视频| 欧美另类一区| 1024视频免费在线观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲av国产av综合av卡| 欧美精品一区二区免费开放| 成人毛片60女人毛片免费| 午夜日本视频在线| 国产极品粉嫩免费观看在线| 777米奇影视久久| 91精品国产国语对白视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产成人精品在线电影| 高清av免费在线| 亚洲一区中文字幕在线| 久久久欧美国产精品| 午夜日本视频在线| 久久青草综合色| 午夜精品国产一区二区电影| 久久久久久久久久久免费av| 777米奇影视久久| 国产 精品1| 另类亚洲欧美激情| 观看av在线不卡| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产色婷婷99| 街头女战士在线观看网站| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲图色成人| 美女大奶头黄色视频| 中国国产av一级| 日韩 亚洲 欧美在线| 久久人人爽人人片av| 视频区图区小说| √禁漫天堂资源中文www| 99九九在线精品视频| 热99国产精品久久久久久7| 婷婷色av中文字幕| 久热这里只有精品99| 高清黄色对白视频在线免费看| 色吧在线观看| 日韩免费高清中文字幕av| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| 国产成人精品福利久久| 中文欧美无线码| 欧美国产精品一级二级三级| 国产精品久久久久久精品电影小说| 免费少妇av软件| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲成国产人片在线观看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 丝袜在线中文字幕| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲精品日韩在线中文字幕| av福利片在线| av在线播放精品| 黄网站色视频无遮挡免费观看| av视频免费观看在线观看| 欧美激情高清一区二区三区 | 国产精品一区二区精品视频观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 人成视频在线观看免费观看| 国产精品人妻久久久影院| 精品卡一卡二卡四卡免费| 纯流量卡能插随身wifi吗| 啦啦啦 在线观看视频| 青草久久国产| 777米奇影视久久| 精品卡一卡二卡四卡免费| 久久久久久久国产电影| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 黑人欧美特级aaaaaa片| 99热全是精品| av视频免费观看在线观看| 精品免费久久久久久久清纯 | 久久女婷五月综合色啪小说| 国产黄色免费在线视频| 99久久精品国产亚洲精品| 日韩免费高清中文字幕av| 欧美在线黄色| 51午夜福利影视在线观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 我要看黄色一级片免费的| 悠悠久久av| 岛国毛片在线播放| 久久久久精品久久久久真实原创| 午夜福利视频精品| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 天天添夜夜摸| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 香蕉丝袜av| 亚洲免费av在线视频| 一本大道久久a久久精品| 老熟女久久久| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产97色在线日韩免费| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲精品在线美女| 高清视频免费观看一区二区| 两性夫妻黄色片| 国产高清国产精品国产三级| 9191精品国产免费久久| 丰满少妇做爰视频| 国产亚洲一区二区精品| av视频免费观看在线观看| 久久鲁丝午夜福利片| 黄片无遮挡物在线观看| 综合色丁香网| 韩国精品一区二区三区| 国产伦人伦偷精品视频| 久久这里只有精品19| 高清不卡的av网站| 韩国av在线不卡| av视频免费观看在线观看| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 操美女的视频在线观看| 色播在线永久视频| 久久精品久久久久久久性| av在线老鸭窝| 欧美激情高清一区二区三区 | 国产精品一二三区在线看| 亚洲精品一二三| 超色免费av| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产高清国产精品国产三级| 女性被躁到高潮视频| 另类亚洲欧美激情| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲精品国产一区二区精华液| 中文字幕精品免费在线观看视频| 午夜免费观看性视频| 午夜福利在线免费观看网站| 精品国产一区二区久久| 亚洲色图综合在线观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 男女床上黄色一级片免费看| av在线观看视频网站免费| 久久热在线av| 免费看av在线观看网站| 免费在线观看完整版高清| 久久性视频一级片| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲精品在线美女| 在线精品无人区一区二区三| 国产精品国产三级专区第一集| 国产一区二区 视频在线| 久久久精品区二区三区| 欧美人与善性xxx| 亚洲美女黄色视频免费看| 久久97久久精品| av线在线观看网站| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 婷婷色综合www| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产伦人伦偷精品视频| svipshipincom国产片| 精品国产国语对白av| av国产精品久久久久影院| 午夜免费鲁丝| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲熟女毛片儿| 国产毛片在线视频| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 精品第一国产精品| 三上悠亚av全集在线观看| 五月开心婷婷网| 午夜老司机福利片| 国产成人av激情在线播放| 99久久人妻综合| 国产成人精品久久二区二区91 | 最近中文字幕高清免费大全6| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 亚洲精品视频女| 国产激情久久老熟女| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 波野结衣二区三区在线| 99精品久久久久人妻精品| 人人澡人人妻人| 欧美成人午夜精品| 午夜福利一区二区在线看| 男女下面插进去视频免费观看| 午夜激情久久久久久久| 中国国产av一级| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 高清在线视频一区二区三区| 在线看a的网站| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲人成77777在线视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 啦啦啦 在线观看视频| 精品一区二区免费观看| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲国产看品久久| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产免费现黄频在线看| 国产精品免费大片| 99热全是精品| 五月开心婷婷网| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 99热全是精品| 久久女婷五月综合色啪小说| 亚洲国产中文字幕在线视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产福利在线免费观看视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲专区中文字幕在线 | 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 秋霞在线观看毛片| 国产一区二区激情短视频 | 亚洲中文av在线| 黄片无遮挡物在线观看| 国产在视频线精品| 国产乱人偷精品视频| 免费黄频网站在线观看国产| 叶爱在线成人免费视频播放| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 午夜福利在线免费观看网站| 人人妻人人澡人人看| 9191精品国产免费久久| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 午夜福利免费观看在线| 午夜久久久在线观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产av码专区亚洲av| 少妇的丰满在线观看| 午夜激情av网站| 久久久精品免费免费高清| 亚洲国产精品一区二区三区在线| xxx大片免费视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 久久亚洲国产成人精品v| 国产 一区精品| 又黄又粗又硬又大视频| 在线天堂中文资源库| 国产精品免费大片| 欧美日韩亚洲高清精品| 五月开心婷婷网| av又黄又爽大尺度在线免费看| 曰老女人黄片| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产精品久久久av美女十八| www.自偷自拍.com| 永久免费av网站大全| 亚洲精品国产色婷婷电影| 黄色 视频免费看| 国产成人精品福利久久| 国产高清国产精品国产三级| 丝袜喷水一区| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产片特级美女逼逼视频| av有码第一页| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲精品美女久久av网站| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲国产欧美一区二区综合| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 一边摸一边做爽爽视频免费| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲国产av影院在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 99热国产这里只有精品6| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产成人欧美| 免费观看av网站的网址| 精品一区在线观看国产| 丝袜脚勾引网站| 免费观看人在逋| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 宅男免费午夜| 久久久久视频综合| 婷婷成人精品国产| 久久99一区二区三区| 色播在线永久视频| 久久久久精品人妻al黑| 大片电影免费在线观看免费| 晚上一个人看的免费电影| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲免费av在线视频| 亚洲精品在线美女| 日韩一本色道免费dvd| 午夜福利视频精品| 日韩一区二区视频免费看| 91国产中文字幕| 我要看黄色一级片免费的| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲精品美女久久av网站| 久久免费观看电影| 黄片播放在线免费| 无遮挡黄片免费观看| 国产福利在线免费观看视频| 亚洲国产欧美网| 大香蕉久久网| 我的亚洲天堂| 国产色婷婷99| 操美女的视频在线观看| 久久久久久久大尺度免费视频| 天天操日日干夜夜撸| 大片免费播放器 马上看| 日韩电影二区| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产亚洲一区二区精品| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 久久97久久精品| 亚洲视频免费观看视频| 狂野欧美激情性xxxx| 飞空精品影院首页| 久久免费观看电影| 中文字幕高清在线视频| 国产精品国产av在线观看| videos熟女内射| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 中文欧美无线码| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产精品无大码| 国产黄色视频一区二区在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 9191精品国产免费久久| 亚洲中文av在线| 91老司机精品| a级片在线免费高清观看视频| 十分钟在线观看高清视频www| 久久精品久久久久久久性| 高清黄色对白视频在线免费看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 欧美激情极品国产一区二区三区| 精品第一国产精品| avwww免费| 精品国产一区二区久久| 在线观看www视频免费| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 色94色欧美一区二区| 国产精品女同一区二区软件| 成年动漫av网址| 制服诱惑二区| 亚洲精品第二区| 精品国产乱码久久久久久男人| 天堂8中文在线网| 国产一区有黄有色的免费视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲欧美激情在线| 久久99一区二区三区| 99九九在线精品视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 又大又黄又爽视频免费| 国产精品久久久久久精品古装| 欧美日韩福利视频一区二区| 久久久国产欧美日韩av| 一级片'在线观看视频| 久久天堂一区二区三区四区| 日本爱情动作片www.在线观看| 色94色欧美一区二区| av不卡在线播放| 一级片免费观看大全| 久久人人爽人人片av| av免费观看日本| 日日啪夜夜爽| 国产亚洲欧美精品永久| 深夜精品福利| 久久精品国产综合久久久| 在线看a的网站| 99热全是精品| 亚洲欧美成人综合另类久久久| tube8黄色片| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 黄片小视频在线播放| 一区二区三区四区激情视频| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲精品一二三| 精品一区在线观看国产| 欧美黑人精品巨大| av网站在线播放免费| 欧美av亚洲av综合av国产av | 老汉色av国产亚洲站长工具| 欧美日韩成人在线一区二区| 青春草国产在线视频| 亚洲人成电影观看| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产高清不卡午夜福利| 国产精品人妻久久久影院| 涩涩av久久男人的天堂| 一区二区av电影网| 91aial.com中文字幕在线观看| 婷婷色综合www| 色94色欧美一区二区| 久久午夜综合久久蜜桃| 蜜桃在线观看..| 欧美少妇被猛烈插入视频| 欧美av亚洲av综合av国产av | 亚洲精品av麻豆狂野| 五月开心婷婷网| 午夜福利视频精品| 国产成人精品在线电影| 久久精品国产综合久久久| 国产精品一区二区在线观看99| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产成人免费观看mmmm| 老熟女久久久| 成人国产麻豆网| 欧美 日韩 精品 国产| 成年动漫av网址| 久久鲁丝午夜福利片| 欧美精品av麻豆av| 日本欧美视频一区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 日本一区二区免费在线视频| 最近2019中文字幕mv第一页| 欧美日韩综合久久久久久| 丁香六月欧美| 女人久久www免费人成看片| 在线观看国产h片| 考比视频在线观看| 一级片'在线观看视频| 成人午夜精彩视频在线观看| av一本久久久久| 一区二区日韩欧美中文字幕| 免费av中文字幕在线| 久久久欧美国产精品| 久久久久人妻精品一区果冻| 另类亚洲欧美激情| 亚洲国产精品一区三区| 亚洲成人国产一区在线观看 | 亚洲av福利一区| 亚洲精品第二区| 丝袜人妻中文字幕| 国产亚洲av高清不卡| 国产精品国产三级专区第一集| 狂野欧美激情性bbbbbb| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 女性被躁到高潮视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲男人天堂网一区| 色婷婷av一区二区三区视频| 久久久久久人人人人人| 国产 一区精品| 丝袜在线中文字幕| 哪个播放器可以免费观看大片| 婷婷成人精品国产| av福利片在线| 在线观看www视频免费| a级毛片在线看网站| 久热爱精品视频在线9| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 91精品国产国语对白视频| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲,一卡二卡三卡| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产在线免费精品| 国产免费视频播放在线视频| 黄色一级大片看看| 91精品国产国语对白视频| 在线 av 中文字幕| 欧美精品一区二区大全| 国产精品国产三级国产专区5o| 免费人妻精品一区二区三区视频| 欧美日韩亚洲高清精品| e午夜精品久久久久久久| 久久久国产欧美日韩av| 啦啦啦在线观看免费高清www| 午夜免费观看性视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 久久狼人影院| 欧美日韩一级在线毛片| 国产乱人偷精品视频| 最新在线观看一区二区三区 | 亚洲免费av在线视频| 免费少妇av软件| 在线观看国产h片| 国产成人午夜福利电影在线观看| 午夜免费鲁丝| 国产高清不卡午夜福利| 曰老女人黄片| 青草久久国产| www.自偷自拍.com| 精品久久蜜臀av无| 亚洲欧美成人精品一区二区| 成人漫画全彩无遮挡| 成人亚洲精品一区在线观看| 精品国产国语对白av| 成人毛片60女人毛片免费| 国产亚洲一区二区精品| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲图色成人| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产野战对白在线观看| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 97人妻天天添夜夜摸| 1024视频免费在线观看| 国产精品一二三区在线看| 国产 一区精品| 国产爽快片一区二区三区| 少妇人妻久久综合中文| 欧美在线黄色| 亚洲精品国产色婷婷电影| 老汉色av国产亚洲站长工具| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲欧美精品自产自拍| 欧美成人午夜精品| 69精品国产乱码久久久| 欧美日韩亚洲高清精品| 色婷婷av一区二区三区视频| 精品一品国产午夜福利视频| 99香蕉大伊视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 欧美在线一区亚洲| 老司机靠b影院| 中国三级夫妇交换| 黄片小视频在线播放| 亚洲国产最新在线播放| 久久久亚洲精品成人影院| 老汉色∧v一级毛片| 色吧在线观看| 蜜桃在线观看..| netflix在线观看网站|