不同磷水平下印度梨形孢對生菜生長及磷素吸收利用的影響

韋 巧，武美燕，張文英

（長江大學(xué)作物抗逆技術(shù)研究中心濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北荊州434025）

不同磷水平下印度梨形孢對生菜生長及磷素吸收利用的影響

韋 巧，武美燕，張文英*

（長江大學(xué)作物抗逆技術(shù)研究中心濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北荊州434025）

通過盆栽砂培法研究了印度梨形孢（Piriformospora indica）真菌在生菜（Lactuca sativa var.crispa）根系的定殖情況及在4種磷水平（常規(guī)磷、50%常規(guī)磷、25%常規(guī)磷、不施磷）下接種印度梨形孢對生菜生長及磷素吸收的影響。結(jié)果表明：印度梨形孢能在生菜根系有效定殖，定殖率為72%。常規(guī)磷、50%常規(guī)磷、25%常規(guī)磷水平下，接種印度梨形孢的生菜葉綠素含量（SPAD值）比不接種處理分別顯著增加了23.6%、13.5%、11.3%。同時，接種處理顯著增加了生菜地上部和地下部的生物量，其中50%常規(guī)磷+接種處理與常規(guī)磷+不接菌處理的地上部鮮質(zhì)量相當(dāng)。生菜全磷含量檢測結(jié)果表明，4種不同供磷水平下，接種印度梨形孢的生菜植株全磷含量分別是不接菌處理的1.25、1. 18、1.48、1.71倍。綜上，印度梨形孢真菌能提高生菜對磷素的吸收，促進生菜生長。

印度梨形孢；生菜；磷

磷是植物生長所必需的大量營養(yǎng)元素。但是磷肥施入土壤后很容易被土壤中鐵、鋁、鈣等固定，導(dǎo)致磷肥利用率普遍偏低，只有10%～20%。傳統(tǒng)上多通過大量增施磷肥來獲得高產(chǎn)，不僅造成磷肥資源浪費，而且還帶來水體富營養(yǎng)化以及重金屬污染等環(huán)境問題［1-2］。生菜作為一種全球食用蔬菜，營養(yǎng)價值高，特別是富含人體所需的維生素C，深受消費者歡迎［3］。在生菜生產(chǎn)中，施磷量為需磷量的2.3～3.5倍［4］，施磷量和生菜磷素利用率差別很大［5］。因此，如何采取有效措施在不減少生菜產(chǎn)量的同時，提高磷肥利用率，降低菜田環(huán)境污染，從而改善農(nóng)田生態(tài)環(huán)境，顯得尤為重要。

印度梨形孢屬擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、層菌綱（Hymenomycetes）、梨形孢屬（Piriformospora），是Verma等［6］1998年在印度西北部塔爾沙漠中發(fā)現(xiàn)的一種菌根真菌。它可以定殖于多種植物的根部［7-8］，其作用與叢枝菌根真菌極為相似，具有促進植物對礦物質(zhì)的吸收和生長［9-12］，提高植物對干旱和鹽脅迫的忍耐性［13-15］，增強作物的抗病性［16］等生物功能。特別是印度梨形孢體內(nèi)包含一種磷轉(zhuǎn)運蛋白，可促進植物根部對磷元素的吸收［17］。該真菌與叢枝菌根的顯著區(qū)別在于它能夠被離體培養(yǎng)，可將其研制成微生物菌肥或生物基質(zhì)，用于改良貧瘠土壤，減少化肥的使用，具有極高的研究價值和應(yīng)用前景［18］。目前，關(guān)于印度梨形孢與蔬菜共生互作提高磷吸收利用率方面的研究鮮為報道。鑒于此，以生菜為材料，研究不同磷水平下，特別是低磷脅迫下，印度梨形孢對生菜生長及磷吸收利用的影響，為研制含有印度梨形孢的微生物調(diào)節(jié)劑或微生物肥料提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試土壤為過2 mm篩的河砂，用全自動滅菌鍋（Zealway GR85DF）121℃（0.11 MPa）滅菌2 h，烘干備用。印度梨形孢（Piriformospora indica）由德國耶拿大學(xué)Oelmüller博士提供。供試的生菜（Lactuca sativa var.crispa）品種為香港玻璃生菜，從市場購買。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計 試驗于2014年9月實施，采用盆栽砂培方法。設(shè)置接菌和施磷2個因素。接菌設(shè)置接菌和不接菌2個水平；施磷設(shè)置常規(guī)磷（P2O5用量為80 mg/kg）、50%常規(guī)磷（P2O5用量為40 mg/ kg）、25%常規(guī)磷（P2O5用量為20 mg/kg）、不施磷4個水平，共8個處理組合，分別為常規(guī)磷+接菌、常規(guī)磷+不接菌、50%常規(guī)磷+接菌、50%常規(guī)磷+不接菌、25%常規(guī)磷+接菌、25%常規(guī)磷+不接菌、不施磷+接菌、不施磷+不接菌，每個處理重復(fù)10次。

1.2.2 菌株制備 在活化的印度梨形孢菌落邊緣打孔，打孔器直徑為5 mm，挑取菌絲塊置于PDA培養(yǎng)基平板中央，于26℃、黑暗培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d備用。將PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)的印度梨形孢用5 mm的打孔器打孔，菌塊置于Aspergillus液體培養(yǎng)基［19］中，每瓶加3塊菌塊，于150 r/min、26℃、黑暗條件下培養(yǎng)7 d，將培養(yǎng)好的菌絲體用無菌水沖洗，過濾壓干，攪拌機（JYL-A100）攪碎，制成20 g/L菌懸液備用。

1.2.3 生菜苗培養(yǎng) 選取飽滿且大小一致的生菜種子200粒，常溫水浸泡4 h，將浸泡好的種子撈出均勻撒播于裝有滅菌沙的育苗盤中，保持育苗盤適當(dāng)水分，于22℃、100μmol/（m2.s）、14 h光照/10 h黑暗條件下培養(yǎng)，待生菜長出4片葉時移栽。

1.2.4 接種及定殖檢測 選取大小一致的生菜苗，移栽至裝有1 kg滅菌河砂的盆缽（上口徑16 cm、高11 cm）中，每盆3株，同時移栽時每株根部加入3 mL菌懸液（20 g/L），不接菌處理加3 mL滅活菌懸液。置于22℃、14 h光照/8 h黑暗條件下共生培養(yǎng)，每2 d補充200 m L缺磷Hoagland營養(yǎng)液。

接菌15 d后，隨機取接菌處理3株苗的根系，用自來水沖洗干凈后，再用純凈水沖洗1遍，剪成1 cm長小段，經(jīng)10%NaOH過夜洗凈，再經(jīng)1%HCl浸泡5 m in后洗凈，最后用0.05%臺朌藍染色制片，400倍光學(xué)顯微鏡（舜宇數(shù)碼DMC5）下觀察根內(nèi)孢子的定殖［20］。

1.3 測定指標(biāo)及方法

共生培養(yǎng)4周后，采用便攜式SPAD-502plus葉綠素測定儀測定生菜葉片（倒二葉）葉綠素含量（SPAD值），同時，小心取出生菜幼苗，用自來水和蒸餾水沖洗幼苗根系（洗凈為止），用吸水紙吸干水分，分開測定地上部和地下部鮮質(zhì)量，然后將樣品置于烘箱中80℃殺青30 min，60℃烘干至恒定質(zhì)量，取出測定地上和地下部質(zhì)量。用粉碎機將地上部及根系烘干樣粉碎，并用H2SO4-H2O2消煮，釩鉬黃比色法測定全磷含量［21］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用DPS 9.0軟件進行數(shù)據(jù)處理及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 印度梨形孢真菌在生菜根系的定殖

如圖1所示，該真菌的厚垣孢子主要集中在生菜根表皮細胞中，在根中其他區(qū)域基本沒有印度梨形孢定殖，共檢測1 cm長的印度梨形孢處理的生菜根段50段，檢測到孢子的小段數(shù)有36段，定殖率為72%。

2.2 不同磷水平下接種印度梨形孢對生菜葉片葉綠素含量的影響

圖2所示，不同磷水平下，接種印度梨形孢相比不接種印度梨形孢的生菜葉片葉綠素SPAD值均有增加。其中，在常規(guī)磷、50%常規(guī)磷、25%常規(guī)磷水平下，接菌后的生菜葉片SPAD值分別顯著高于不接菌處理23.6%、13.5%、11.3%。而不施磷條件下，接菌處理SPAD值較不接菌處理有所增加，但差異未達到顯著水平。說明不同磷水平下，接種印度梨形孢能夠增加生菜的葉綠素含量。

2.3 不同磷水平下接種印度梨形孢對生菜地上部鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的影響

圖3所示，不同供磷水平下，接菌處理的生菜地上部鮮質(zhì)量均顯著高于不接菌處理，其中，常規(guī)磷+不接種處理與50%常規(guī)磷+接種處理相比，地上部鮮質(zhì)量差異不顯著。表明50%常規(guī)磷水平下，接種印度梨形孢能促進生菜地上部生長。

圖4所示，在8個處理組合中，常規(guī)磷+接菌處理生菜地上部干質(zhì)量最高，且與常規(guī)磷+不接菌處理比差異顯著。低常規(guī)磷處理（50%常規(guī)磷、25%常規(guī)磷和無磷）下，接菌處理的生菜地上部干質(zhì)量均顯著高于不接菌處理。

2.4 不同磷水平下接種印度梨形孢對生菜地下部鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的影響

圖5所示，不同磷水平下，接菌后的生菜地下部鮮質(zhì)量明顯高于不接菌處理，其中，在25%常規(guī)磷水平下，與不接菌處理相比，接菌處理地下部鮮質(zhì)量增加最多，達1.22 g，增加比率為21%。在50%常規(guī)磷水平下，接菌處理地下部鮮質(zhì)量大于不接菌處理地下部鮮質(zhì)量，但差異不明顯。而且25%常規(guī)磷+接菌處理地下部鮮質(zhì)量與50%常規(guī)磷+不接菌地下部鮮質(zhì)量無顯著差異（P＞0.05），這說明磷水平越低，印度梨形孢越能促進生菜地下部的生長，從而有利于獲取更多的養(yǎng)分來維持生長。

從圖6可以看出，常規(guī)磷和無磷水平下，接菌處理的生菜地下部干質(zhì)量均明顯高于不接種處理；而在50%常規(guī)磷和25%常規(guī)磷水平下，接菌處理的地下部干質(zhì)量高于不接菌處理的地下部干質(zhì)量，但差異不顯著（P＞0.05）。

2.5 不同磷水平下接種印度梨形孢對生菜全磷吸收利用的影響

圖7表明，不同磷水平下，接種印度梨形孢的生菜植株全磷含量分別是不接菌處理的1.25、1.18、1. 48、1.71倍，差異均達到顯著水平（P＜0.05）。表明印度梨形孢在一定程度上可以促進生菜對磷素的吸收，從而增加植株的全磷含量。

3 結(jié)論與討論

Sun等［10］研究發(fā)現(xiàn)，接種印度梨形孢真菌的小白菜地上部和地下部與對照相比都有顯著差異，且側(cè)根數(shù)顯著增加，印度梨形孢具有提高小白菜抗旱性的作用。王鳳讓等［12］研究表明，接種印度梨形孢真菌的番茄地上部和地下部的長度、鮮質(zhì)量，以及側(cè)根數(shù)等指標(biāo)比不接種印度梨形孢有顯著增加。本試驗中，不同磷水平下，接種印度梨形孢能增加生菜地上部、地下部的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量。特別是，50%常規(guī)磷水平下，接種印度梨形孢生菜的地上部鮮質(zhì)量與100%常規(guī)磷+不接種處理的地上部鮮質(zhì)量基本一致，促生效果明顯。

本研究表明，不同磷水平下接種印度梨形孢的生菜植株總磷含量都顯著高于不接種處理，說明接種印度梨形孢可以提高生菜對磷素的吸收利用，從而提高其他養(yǎng)分的吸收利用率。但其中的機制尚不明確。這可能與Strack等［22］、劉進法等［23］的研究結(jié)果類似，即叢枝菌根真菌可以將土壤中結(jié)合態(tài)的磷和其他元素轉(zhuǎn)運至植物根系。本試驗中，一方面印度梨形孢提高了生菜對可溶性磷的吸收利用，可能是由于印度梨形孢與生菜植株共生，在生菜根部形成諸多菌根，擴大了生菜的養(yǎng)分吸收面積，從而提高了磷的吸收；另一方面印度梨形孢可能作為一種溶磷真菌將難溶性磷溶解為生菜可以吸收利用的水溶性磷，或是印度梨形孢與生菜建立共生體系后，會釋放一些溶磷物質(zhì)如草酸、檸檬酸、蘋果酸等［24-27］，活化了難溶性無機磷，使得生菜可以吸收利用。此外，印度梨形孢與生菜共生調(diào)控磷代謝的分子機制尚待研究。

［1］ 魯如坤.我國的磷礦資源和磷肥生產(chǎn)消費Ⅰ.磷礦資源和磷肥生產(chǎn)［J］.土壤，2004，36（2）：113-116.

［2］ 冀宏杰，張懷志，張維理，等.我國農(nóng)田磷養(yǎng)分平衡研究進展［J］.中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，23（1）：1-8.

［3］ Arm in E，Cardinale M，Martin G，et al.Biotic stress shifted structure and abundance of enter obacteriaceae in the lettucemicribiome［J］.PLoSOne，2015，10（2）：1-14.

［4］ 劉建玲，廖文華，張鳳華，等.菜園土各形態(tài)磷庫的變化及空間分布［J］.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，27（6）：6-11.

［5］ 蘇苑君，胡笑濤，王文娥，等.磷對水培生菜生長及礦質(zhì)元素動態(tài)吸收的影響［J］.中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，23（10）：1244-1252.

［6］ Verma S，Varma A，Rexer K H，et a l.Piriformospora indica，a new root-colonizing fungus［J］.Mycologia，1998，90：896-903.

［7］ Varma A，Verma S，Sudha A，et al.Piriformospora indica，a cultivable plant-growth promoting root neophyte［J］.Applied and Environmental Microbiology，1999，65：2741-2744.

［8］ Singh A，Sharma J，Rexer K H，et al.Plant productivity determinants beyond minerals，water and light：Piriformospora indica a revolutionary plant growth promoting fungus［J］.Current Science，2000，79：1548-1554.

［9］ Johnson J M，Sherameti I，Ludwig A，et a l.Protocols for Arabidopsis thaliana and Piriformospora indica co-cultivation a model system to study plant beneficial traits［J］. Journal of Endocytobiosis and Cell Research，2011，21：101-131.

［10］ Sun C，Johnson JM，Cai D G，et al.Piriformospora indica confers drought tolerance in Chinese cabbage leaves by stimulating antioxidant enzymes，the expression of droughtrelated genes and the plastid-localized CAS protein［J］. Journal of Plant Physiology，2010，167：1009-1017.

［11］ 王襯，毛黎娟，惠非瓊，等.不同氮素水平下內(nèi)生真菌印度梨形孢定殖對煙草生長發(fā)育及物質(zhì)代謝的影響［J］.煙草科技，2014（5）：76-78.

［12］ 王鳳讓，毛克克，李國鈞，等.印度梨形孢及其近似種Sebacina vermifera促進番茄生長發(fā)育及磷吸收［J］.浙江大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2011，37（1）：61-68.

［13］ Baltruschat H，F(xiàn)odor J，Harrach B D，et al.Salt tolerance of barley induced by the root entophyte Piriformospora indica is associated with a strong increase in antioxidants［J］.New Phytologist，2008，180：501-510.

［14］ 陳佑源，樓兵干，高其康，等.印度梨形孢誘導(dǎo)油菜抗旱性機理的初步研究［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2013，21（3）：272-281.

［15］ 武美燕，蒿若超，張文英，等.印度梨形孢誘導(dǎo)紫花苜蓿提高抗旱性研究初報［J］.草地學(xué)報，2013，21（6）：1219-1222.

［16］ Ghahfarokhi R M，Goltapeh M E.Potential of the root endophytic fungus Piriformospora indica；Sebacina vermifera and Trichoderma species in biocontrol of take-all disease of wheat Gaeumannomyces graminis var.tritici in vitro［J］.Journal of Agricultural Technology，2010，6（1）：11-18.

［17］ Kumar M，Yadav V，Kumar H，et al.Piriformospora indica enhances plant growth by transferring phosphate［J］.Plant Signaling and Behavior，2011，6：723-725.

［18］ 徐澤凌，陳復(fù)旦，毛碧增.印度梨形孢的研究進展及其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用前景［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（11）：1505-1508.

［19］ Hill T W，Kafer E.Imp roved protocols for Aspergillums mini-malmedium：Trace element and m inimal medium salt stock solutions［J］.Fungal Genetics Newsletter，2001，48：20-21.

［20］ Rai M，Acharya D，Singh A.Positive grow th responses of themedicical plants Spilanthes calva and Withania somnifera to inoculation by Piriformospora indica in a field trial［J］.Mycorrhiza，2001，11（3）：123-128.

［21］ 魯如坤.土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社，2000：312-314.

［22］ Strack D，F(xiàn)ester T，Hause B，et al.Arbuscular mycorrhiza：biological，chemical，and molecular aspects［J］.Journal of Chemical Ecology，2003，29：1955-1979.

［23］ 劉進法，夏仁學(xué)，王明元，等.叢枝菌根促進植物根系吸收難溶態(tài)磷的研究進展［J］.亞熱帶植物科學(xué)，2007，36（4）：62-66.

［24］ 孫海國，張福鎖.缺磷條件下的小麥根系酸性磷酸酶活性研究［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2002，13（3）：379-381.

［25］ 唐超西，龔明波，李順鵬，等.草酸青霉菌Ⅰ1的cDNA文庫構(gòu)建及其溶磷相關(guān)基因的篩選［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（18）：3792-3800.

［26］ 顧冕，陳愛群，徐國華.植物缺磷及菌根信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，35（5）：133-146.

［27］ 劉文干，曹慧，樊建波，等.一株紅壤花生根際溶磷真菌的分離鑒定及溶磷能力的研究［J］.土壤學(xué)報，2012，49（5）：989-995.

Effects of Piriformospora indica on Growth and Phosphorus Absoption of Lettuce under Different Phosphorus Levels

WEIQiao，WU Meiyan，ZHANG Wenying*
（Research Center of Crop Stresses Resistance Technologies，Ministry of Education Engineering Research Center of Ecology and Agriculture Use of Wetland，Yangtze University，Jingzhou 434025，China）

The colonization of Piriformospora indica in the roots and its effects on growth and phosphorus absorption of lettuce p lants were investigated under four different phosphorus levels［recommended dose（RD），50%RD，25%RD and non-phosphorus（NP）］by pot experiment.The results showed that P.indica colonized the root of lettuce with 72%in the experiment.The SPAD value of p lants colonized by P.indica was increased significantly by 23.6%，13.5%and 11.3%under RD，50%RD and 25%RD treatments as compared to the control without inoculation of P.indica.The fungus was capable of improving the shoot and root biomass of lettuce under different phosphorus levels，especially，the fresh weight of shoot was nearly equal between 50%RD+P.indica and RD（without P.indica）.P contents of the colonized p lants were 1. 25，1.18，1.48，1.71 times under RD，50%RD，25%RD and NP as compared to the control，respectively. Therefore，P.indica can increase phosphorus absorption in lettuce and promote growth of lettuce.

Piriformospora indica；lettuce；phosphorous

S636.2

A

1004-3268（2017）01-0100-05

2016-07-12

國家自然科學(xué)基金項目（31471496）；長江大學(xué)作物抗逆技術(shù)研究中心開放課題（2015002）；濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心開放基金項目（KF201506）

韋 巧（1991-），男，重慶人，在讀碩士研究生，研究方向：真菌與作物互作。E-mail：387722897@qq.com

*通訊作者：張文英（1972-），男，湖北天門人，教授，博士，主要從事植物非生物逆境抗性研究。E-mail：wyzhang@yangtzeu.edu.cn