β-葡萄糖苷酶抗體的制備及比較分析

余厚美，張振文

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所/國家薯類加工技術(shù)研發(fā)分中心/農(nóng)業(yè)部木薯種質(zhì)資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 儋州 571737)

β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase，EC3.2.1.21)是一種水解酶，也叫β-D-葡萄糖苷水解酶、龍膽二糖酶[1]，能夠水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，同時(shí)釋放出β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基[2]，相對(duì)分子質(zhì)量一般在40×103～250×103之間。1837 年， LIEBIG和 WOHLER首次在苦杏仁中發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶，其廣泛存在于許多古細(xì)菌、細(xì)菌、真菌、酵母、曲霉、昆蟲、動(dòng)物和植物中[3-5]。不同來源的β-葡萄糖苷酶的相對(duì)分子質(zhì)量差異較大，這是由其結(jié)構(gòu)和組成的不同導(dǎo)致的。由于參與生物體的糖代謝，β-葡萄糖苷酶對(duì)維持生物體的正常生理功能有著重要作用[2]，已經(jīng)在哺乳動(dòng)物的疾病防治和人類的癌癥治療方面廣泛開展了應(yīng)用研究[2,6]；此外，β-葡萄糖苷酶還能將果、蔬、茶中的風(fēng)味前體物質(zhì)水解為具有濃郁天然風(fēng)味的香氣物質(zhì)，協(xié)助纖維素酶降解纖維素等功能[1-2,7-8]，在飼料工業(yè)、生物合成和生物燃料等領(lǐng)域，β-葡萄糖苷酶同樣有巨大的應(yīng)用價(jià)值[4,9]。目前，β-葡萄糖苷酶的檢測(cè)技術(shù)主要是酶活法，主要測(cè)試方法有分光光度法、熒光法、電化法和比色法[8]和以京尼平苷為底物檢測(cè)酶活的一種新方法[10]。分光光度法容易受到干擾，靈敏度低；熒光法靈敏度高，但是操作復(fù)雜，重復(fù)性差[11]。比色法雖然靈敏度不如以京尼平苷為底物的方法高，但是總體來說，簡單、快速、重復(fù)性好[8，11]。酶聯(lián)免疫法(ELISA)是免疫學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一，是將免疫學(xué)技術(shù)與現(xiàn)代測(cè)試手段相結(jié)合而建立的一種超微量的檢測(cè)技術(shù)。ELISA的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)成本低、可大批量檢測(cè)、專一性強(qiáng)、靈敏度高、安全性好，可進(jìn)行定性或者定量檢測(cè)，不需要昂貴的儀器，操作簡單，容易推廣普及，尤其適合樣本量大、檢測(cè)種類多的現(xiàn)場(chǎng)和基層檢測(cè)[12-14]。免疫學(xué)分析技術(shù)主要利用抗原抗體的特異性結(jié)合，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個(gè)研究領(lǐng)域。近年來免疫學(xué)分析技術(shù)以其抗原抗體反應(yīng)的高度專一性和特異性，在人類臨床診斷、食品安全等領(lǐng)域 廣泛應(yīng)用[15]。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料以β-葡萄糖苷酶為抗原，該抗原分別購自北京索萊寶公司、上海源葉生物公司、上海麥克林公司(表1)；DMEM不完全培養(yǎng)基購自北京索萊寶公司； HAT、HT、DMSO、小鼠抗體亞型鑒定試劑盒、鑰孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)、牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)為Sigma公司產(chǎn)品；QuickAntibody-mouse 5w佐劑、clone easy培養(yǎng)基購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；弗氏佐劑、HRP-羊抗鼠、PEG融合劑、TMB底物液、封閉液和抗體稀釋液購自海南億康生物科技有限公司；胎牛血清、小牛血清購自蘭州民海生物公司；Tween-20、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉、氯化鉀和甘油等化學(xué)試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司； Babl/C小鼠購自汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)中心；SP2/0保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所國家薯類加工技術(shù)研發(fā)分中心實(shí)驗(yàn)室。

表1 不同廠家的抗原信息

1.2動(dòng)物免疫將不同廠商生產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶分別編號(hào)為A，B，C， 按每鼠50 μg的劑量與QuickAntibody-mouse 5w佐劑等劑量混勻，后腿肌肉注射免疫4只小鼠，第21 天按同樣方式再免疫 1 次，第35 天斷尾采血，全血37 ℃ 放置 2 h后4 ℃ 放置12 h，4 ℃ 10 000 r·min-1離心15 min，收集血清，每只小鼠血清都用A，B，C 3種蛋白作為包被原，ELISA間接法檢測(cè)血清效價(jià)。

1.3單克隆抗體的制備取50 g 免疫原用生理鹽水定容到500 μL，腹腔沖擊免疫抗體效價(jià)高的小鼠，沖擊免疫后72 h 左右摘眼球取全血分離血清保存，備用。將小鼠在體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精中浸泡10 min，無菌條件下取出小鼠脾臟并分離脾細(xì)胞，與 SP2/0 細(xì)胞在 PEG 作用下融合，HAT 篩選培養(yǎng)，培養(yǎng)7～10 d ，以免疫原為包被原，用上述間接ELISA 檢測(cè)細(xì)胞上清，陽性細(xì)胞用有限稀釋法克隆直至陽性單克隆率為 100%，小鼠體內(nèi)誘生腹水法制備抗體，將陽性雜交瘤細(xì)胞于液氮中長期保存[13]。

1.4腹水純化參考?xì)W文軍等方法[15]并加以改進(jìn)，將新采集的腹水于4 ℃、10 000 r·min-1離心15 min，去沉淀，用0.05 mol·L-1、pH7.0的PBS 5倍稀釋，在冰浴條件下等體積逐滴加入飽和硫酸銨溶液，冰浴攪拌30 min后4 ℃靜置12 h，4 ℃、10 000 r·min-1離心15 min，棄上清，沉淀用與腹水等體積的0.02 mol·L-1、 pH 7.2 的PBS溶解，冰浴條件下再逐滴加入總PBS體積半量的飽和硫酸銨溶液使之達(dá)到33%飽和度，連續(xù)攪拌30 min后4 ℃、10 000 r·min-1離心15 min，棄上清，沉淀用0.02 mol·L-1、pH 7.2 的PBS透析72 h后分裝，- 20 ℃凍存。每個(gè)抗體純化前后各取10 μL，用SDS-PAGE對(duì)抗體進(jìn)行電泳，考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)純化效果。

1.5抗體效價(jià)和特異性檢測(cè)采用棋盤法測(cè)定抗體效價(jià)，即抗原用pH 9.6，0.05 mol·L-1的碳酸鹽緩沖液稀釋，按照100 ng·mL-1，200 ng·mL-1，500 ng·mL-1，1 μg·mL-1，2 μg·mL-1，5 μg·mL-1的濃度梯度包被于酶標(biāo)板，每孔100 μL，37 ℃ 包被2 h，PBST 洗滌1次，每孔用120 μL含5% 小牛血清的PBST，37 ℃封閉1.5 h，每孔加100 μL梯度稀釋的抗體，37 ℃反應(yīng)30 min，PBST洗滌 4～5 次，每孔加100 μL酶標(biāo)羊抗鼠二抗，37 ℃反應(yīng)30 min，PBST 洗滌4～5 次，TMB底物液37 ℃顯色反應(yīng)15 min，0.5 mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)后，酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測(cè)每孔的吸光度值。選擇陽性孔OD值大于陰性O(shè)D值的2.1倍的抗體最高稀釋倍數(shù)為抗體的效價(jià)。然后分別在酶標(biāo)板上包被1 μg·mL-1Aβ-葡萄糖苷酶、Bβ-葡萄糖苷酶、Cβ-葡萄糖苷酶、KLH、BSA，采用ELISA方法檢測(cè)抗體的特異性。

1.6抗體亞型鑒定用小鼠抗體亞型鑒定試劑盒檢測(cè)單抗的亞型。

1.7電泳鑒定3種β-葡萄糖苷酶抗原分別取20 μg ABC 3種抗原，用SDS-PAGE對(duì)抗原進(jìn)行電泳，考馬斯亮藍(lán)染色。

2 結(jié)果與分析

2.1抗原SDS-PAGE鑒定抗原相對(duì)分子質(zhì)量大小對(duì)免疫結(jié)果至關(guān)重要。本研究將3種抗原進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定，結(jié)果見圖1。由圖1可見，3種抗原電泳條帶差異明顯。A、B抗原在250×103附近有條帶出現(xiàn)，但是出現(xiàn)位置不同，C抗原在該區(qū)域沒有條帶出現(xiàn)；3個(gè)抗原在95×103附近都有條帶出現(xiàn)，但是出現(xiàn)位置幾乎不重復(fù)，B抗原在95×103附近只有1條帶，A、C抗原均有2條帶；B、C抗原在55×103～72×103間有1個(gè)比較粗的蛋白條帶出現(xiàn)。在所有蛋白里面， B抗原條帶最多。

表2 小鼠血清效價(jià)檢測(cè)

2.2小鼠血清效價(jià)檢測(cè)用免疫前的小鼠血清作為陰性對(duì)照，抗原包被5 μg·mL-1，12只小鼠血清分別梯度稀釋，得到的血清效價(jià)見表2。A免疫原免疫的小鼠只對(duì)A抗原顯色，對(duì)B，C抗原不顯色，B和C免疫的小鼠也出現(xiàn)和A抗原免疫的小鼠一樣的情況，即只對(duì)本身免疫原顯色，對(duì)其余抗原均不顯色。挑選A抗原效價(jià)高的2#小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。

2.3抗體純化前后效價(jià)測(cè)定和SDS-PAGE對(duì)比融合共鋪板8塊96孔板，融合細(xì)胞孔陽性率為1%，融合后的雜交瘤細(xì)胞經(jīng)過3次的有限稀釋克隆，得到5株陽性單克隆細(xì)胞。5株陽性單克隆細(xì)胞體外誘導(dǎo)法制備的腹水的效價(jià)均達(dá)到105及以上，結(jié)果見表3。純化前后進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖2，純化后的抗體條帶主要集中在25×103和55×103附近，純化后雜質(zhì)明顯少于純化前，效價(jià)有所下降，但是變化不大，說明抗體純化保留了抗體的有效成分，成功去除了雜質(zhì)，達(dá)到了純化的目的。

2.4抗體純化后亞型測(cè)定和特異性測(cè)定將所有純化的抗體加入事先包被好的β-葡萄糖苷酶A 抗原、B 抗原、C 抗原、KLH、BSA板孔檢測(cè)抗體的特異性，結(jié)果(表4)表明，所有抗體均與B 抗原、C 抗原、KLH、BSA無交叉反應(yīng)，說明抗體均為A 抗原特異性抗體。通過抗原抗體特異性結(jié)合把抗體固定在酶標(biāo)板上，加亞型抗體測(cè)定的單克隆抗體亞型均為IgG1型。

表 3 腹水純化前后效價(jià)檢測(cè)

表 4 純化后抗體特異性和抗體亞型測(cè)定

3 討 論

抗原抗體反應(yīng)是免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)[16]，抗體是免疫分析技術(shù)的核心試劑[18]。機(jī)體產(chǎn)生抗體的強(qiáng)度，受到動(dòng)物物種、年齡、體質(zhì)狀況、免疫部位、抗原結(jié)構(gòu)、抗原性質(zhì)、抗原劑量、佐劑、免疫途徑、間隔時(shí)間等因素的影響[18]。本研究使用的小鼠年齡、注射方式、注射劑量、免疫部位等完全一樣的情況下，所用的3 個(gè)β-葡萄糖苷酶均標(biāo)注來自于杏仁，分別免疫后的抗體只對(duì)相應(yīng)原免疫原顯色，對(duì)其不同來源免疫源都不顯色。即A免疫的小鼠所得血清，只對(duì)A抗原顯色，對(duì)B、C抗原均不顯色；B免疫原和C免疫原免疫動(dòng)物檢測(cè)結(jié)果A相同，都只對(duì)免疫原顯色，對(duì)其余抗原均不顯色。首先驗(yàn)證是不是抗原活性原因引起的差異，所以要求廠商分別做質(zhì)控，但是反饋質(zhì)控活性正常；又分別購買同一生產(chǎn)廠商其他貨號(hào)的產(chǎn)品，檢測(cè)所得的結(jié)果和免疫原相似，即同一廠商的不同貨號(hào)和批次的蛋白均對(duì)從該廠商采購的β-葡萄糖苷酶為免疫原免疫的鼠產(chǎn)生的抗體顯色，對(duì)其余抗體不顯色，即A免疫的小鼠所得血清，只對(duì)A廠商來源的抗原顯色，對(duì)B、C抗原均不顯色，只是不同批次和貨號(hào)間效價(jià)有差異；B和C免疫后也得到相同的結(jié)果。本研究中，3個(gè)不同來源抗原經(jīng)電泳分析表明其相對(duì)分子質(zhì)量差別較大，A和B、C抗原條帶幾乎沒有重疊，所以產(chǎn)生的抗體間無交叉反應(yīng)，B、C抗原在55×103～72×103間有2個(gè)相似的條帶，但是B、C抗原免疫動(dòng)物后，抗體檢測(cè)結(jié)果表明抗原間仍然沒有交叉反應(yīng)?？梢?，不同來源的抗原均產(chǎn)生了特異性抗體。β-葡萄糖苷酶免疫小鼠產(chǎn)生抗體差異如此大，可能是跟β-葡萄糖苷酶的蛋白結(jié)構(gòu)差異有關(guān)，因?yàn)椴煌瑏碓?即使是同一菌屬的不同菌株或者同一植物組織)的β-葡萄糖苷酶的相對(duì)分子質(zhì)量差異40×103～250×103的范圍[2]，而且有單亞基、多亞基的區(qū)別，其結(jié)構(gòu)差異就有可能大相徑庭[19]。

不同的結(jié)構(gòu)有不同的空間構(gòu)象，抗體的產(chǎn)生是抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，不同構(gòu)象的抗原免疫，肯定得到不同的抗體，這也是不同廠商來源的β-葡萄糖苷酶差異巨大的原因之一。此外，有研究表明，不同來源(化學(xué)合成、不同克隆表達(dá)產(chǎn)物、自然感染表達(dá)等)的同一生物分子的抗原存在差異，抗原中單個(gè)氨基酸替代突變所致抗原性的序貫漂移和抗原不穩(wěn)定等因素都對(duì)抗原抗體的結(jié)合產(chǎn)生很大的影響[20]。甚至在僅有一個(gè)氨基酸差異或僅為幾個(gè)小分子DNP的情況下，也會(huì)出現(xiàn)與抗體結(jié)合的情況，使之能逃避宿主的免疫應(yīng)答、抗體效價(jià)相差巨大的情況出現(xiàn)[16，21]。為此，避免因抗原來源不同導(dǎo)致產(chǎn)生特異性抗體，開展同一來源的抗體制備是解決出現(xiàn)特異性抗體的關(guān)鍵，也是今后研究的重點(diǎn)。