環(huán)丙氨嗪在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用及其檢測技術(shù)研究進(jìn)展

邢云瑞，姚靜靜，王方雨，孫亞寧，鄧瑞廣，胡驍飛*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫學(xué)重點實驗室，河南 鄭州450002； 2.河南科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，河南 洛陽 471000)

環(huán)丙氨嗪在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用及其檢測技術(shù)研究進(jìn)展

邢云瑞1，2，姚靜靜1，王方雨1，孫亞寧1，鄧瑞廣1，胡驍飛1*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫學(xué)重點實驗室，河南 鄭州450002； 2.河南科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，河南 洛陽 471000)

環(huán)丙氨嗪是一種常用的昆蟲抑制劑類殺蟲劑，對畜禽養(yǎng)殖場的蠅蛆繁殖控制效果顯著，在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用廣泛。然而長期使用環(huán)丙氨嗪易造成細(xì)菌耐藥性，從而危害動物健康，且會在動物組織中形成藥物殘留，并通過食物鏈危害人類健康，甚至危及生命。因此，環(huán)丙氨嗪的監(jiān)控檢測對保證食品安全至關(guān)重要。綜述了環(huán)丙氨嗪的性質(zhì)、應(yīng)用、危害、檢測方法等，并展望了免疫學(xué)檢測技術(shù)在環(huán)丙氨嗪監(jiān)控檢測中的應(yīng)用前景，以期為環(huán)丙氨嗪的科學(xué)應(yīng)用及監(jiān)控檢測提供參考。

環(huán)丙氨嗪； 藥物殘留； 食品安全； 檢測技術(shù)

環(huán)丙氨嗪是一種高效的昆蟲生長抑制劑，常作為飼料添加劑廣泛應(yīng)用于動物飼料中，以原藥以及代謝產(chǎn)物的形式隨糞便排出體外，并沉積在糞便中以殺滅糞便中的蠅蛆，從而達(dá)到凈化環(huán)境的目的，且能提高動物生長性能[1]。在動物養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中，許多養(yǎng)殖戶為了減少養(yǎng)殖場的蚊蠅，把環(huán)丙氨嗪長期應(yīng)用于動物飼料中，導(dǎo)致畜禽肌肉組織中藥物殘留超標(biāo)，嚴(yán)重威脅著消費(fèi)者身體健康。我國及美國已經(jīng)將其列為具有潛在致癌性化合物[2]。世界各國對其在動物制品中的殘留做了嚴(yán)格的限量要求，目前，關(guān)于環(huán)丙氨嗪監(jiān)控檢測的研究較少。因此，綜述了環(huán)丙氨嗪的性質(zhì)、應(yīng)用、危害、檢測方法等，旨在為環(huán)丙氨嗪的應(yīng)用及監(jiān)控檢測提供參考。

1 環(huán)丙氨嗪的理化性質(zhì)

環(huán)丙氨嗪，又名“滅蠅胺”，養(yǎng)殖場通常稱為“蠅蛆凈”，化學(xué)名為2-環(huán)丙氨基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪，分子式為C6H10N6，屬于1,3,5-三嗪類昆蟲生長調(diào)節(jié)劑，為無色晶體，微溶于水[1-2]。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)和美國環(huán)境保護(hù)署(EPA)于1974年正式批準(zhǔn)生產(chǎn)[1]。本品主要作用于昆蟲發(fā)育過程中的第2個階段，具有很強(qiáng)的殺蟲抑蟲性能，其殺蟲抑蟲活性明顯優(yōu)于其他種類殺蟲劑，且不受交叉抗藥性的影響[2-3]。

2 環(huán)丙氨嗪在動物飼料中的應(yīng)用

近年來，環(huán)丙氨嗪廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)，用來控制畜禽舍以及周圍環(huán)境中的有害昆蟲，效果顯著，并能夠促進(jìn)動物生產(chǎn)性能的提高。環(huán)丙氨嗪在動物飼料中的應(yīng)用主要是作為預(yù)混劑拌入全價料中，動物體內(nèi)的環(huán)丙氨嗪絕大部分以原藥形式隨糞便排出體外，并在糞便中殺滅蠅蛆，通過誘使蠅蛆在形態(tài)上發(fā)生畸變,使成蟲羽化不全或受到抑制,從而達(dá)到控制蠅蛆過量繁殖的目的,其藥效可以達(dá)到4～6周[4]。

環(huán)丙氨嗪作為飼料添加劑在不同種屬動物的飼料中均有應(yīng)用，在雞飼料中應(yīng)用最為廣泛且效果顯著。環(huán)丙氨嗪的常用劑型不僅有預(yù)混劑，還有水溶劑和注射劑。由于預(yù)混劑具有操作方便、經(jīng)濟(jì)效益顯著的特點，在畜牧養(yǎng)殖過程中使用廣泛。將1%的環(huán)丙氨嗪以0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的比例拌入飼料中，飼喂不同年齡段的雞群，其糞便自然堆放，不會產(chǎn)生各種蠅蛆，且對其產(chǎn)蛋量等生產(chǎn)性能指標(biāo)無明顯影響[1]。江善祥[5]將環(huán)丙氨嗪預(yù)混劑按2 mg/kg混飼給藥，結(jié)果表明，給藥后1 d至停藥后1 d，各處理組雞糞中蠅蛆死亡率均為100%。翁亞彪等[6]在供試雞群每噸飼料中添加蠅滅(含1%環(huán)丙氨嗪的飼料添加劑)500 g，結(jié)果顯示，蠅滅能很好地控制糞便中蠅蛆的孳生繁殖。環(huán)丙氨嗪也可用于豬、牛、羊等生產(chǎn)中。同時采用混飼、混飲、氣霧噴灑的方法驅(qū)蟲滅蠅，用藥第8天，蒼蠅數(shù)量明顯減少[7]。Robert等[8]在實驗室條件下，采用環(huán)丙氨嗪混飼給藥方法檢測環(huán)丙氨嗪對不同動物糞便中普通家蠅的抑制效果，環(huán)丙氨嗪添加劑量分別為雞1.5 mg/kg，豬、牛0.5 mg/kg，連用5 d，停藥24 h后觀察，結(jié)果顯示，雞和豬糞便中普通家蠅均被100%抑制，并且持續(xù)時間較長，而牛糞便中普通家蠅抑制效果不及雞和豬。Williama等[9]采用環(huán)丙氨嗪混飼和噴灑2種途徑來檢測環(huán)丙氨嗪控制雞糞中普通家蠅繁殖的效果，在混飼試驗中，環(huán)丙氨嗪的添加劑量為1.5 mg/kg，采用給藥1 d、停藥 1 d的模式進(jìn)行，用藥結(jié)束后，普通家蠅致死率為100%；噴灑給藥時,環(huán)丙氨嗪劑量為 0.025%、0.050%和 0.100%，用藥17 d后，普通家蠅均減少 70%或更多。Hart等[10]將環(huán)丙氨嗪溶液(1 g/L)噴灑羊全身，能有效地降低蚊蠅所引起的疾病的發(fā)生率，隨著藥物劑量的提高,對綿羊無不良影響。Miller等[11]將環(huán)丙氨嗪作為飼料添加劑應(yīng)用于牛，廄舍內(nèi)蠅類的繁殖在一定程度上受到抑制，檢測發(fā)現(xiàn)，奶牛排出的尿液中含有一定量的環(huán)丙氨嗪。楊金琛等[12]將環(huán)丙氨嗪藥液對五齡期 4～12日齡柞蠶進(jìn)行噴蠶噴葉處理，處理4 d后，柞蠶體壓升高、體軀伸長、節(jié)間膜膨起，導(dǎo)致產(chǎn)生6.1%～46.4%畸形蛹，雌蛾產(chǎn)卵量顯著降低。

3 環(huán)丙氨嗪藥物動力學(xué)及殘留規(guī)律

環(huán)丙氨嗪通過口服可以迅速被吸收，其血漿藥物質(zhì)量濃度在1.8 h后就可以達(dá)到0.2 mg/L，生物利用率(AUC)達(dá)到34%，在一定劑量范圍內(nèi)，其AUC與劑量呈正相關(guān)，多次給藥并不會產(chǎn)生蓄積。藥物被吸收后廣泛分布在肝臟、膽囊、體液、直腸、腎組織及組織體液中。環(huán)丙氨嗪在吸收一段時間后的消除作用主要通過以原藥形式經(jīng)腎排泄、腸道排泄、肝生物轉(zhuǎn)化來實現(xiàn)。動物試驗結(jié)果表明，環(huán)丙氨嗪的再吸收及排泄迅速。飼喂環(huán)丙氨嗪24 h后，其中80%～95%通過尿液排泄，2%～7%經(jīng)糞便排出體外[1,13]。

環(huán)丙氨嗪在吸收、分布、消除轉(zhuǎn)化的過程中產(chǎn)生了一定的殘留。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)丙氨嗪殘留的主要器官是肝臟和腎臟。牛應(yīng)用環(huán)丙氨嗪的研究表明，在腎臟中殘留含量最高，其次是板油和肝臟，肌肉中也有少量存在。當(dāng)環(huán)丙氨嗪深入動物脂肪組織中時，在動物產(chǎn)品中可以檢測到少量殘留，由于環(huán)丙氨嗪不能通過血腦屏障，因此，在腦組織中通常檢測不到殘留。雞飼料中添加環(huán)丙氨嗪，連續(xù)用藥16周后，在雞蛋、脂肪、肌肉中均能檢測到殘留。牛、羊連續(xù)用藥后，在奶、肌肉、脂肪中均檢測到殘留。在飼養(yǎng)過程中許多養(yǎng)殖戶為了控制圈舍蠅蛆繁殖而將環(huán)丙氨嗪長期應(yīng)用于產(chǎn)蛋期雞飼料和肥育豬、牛、羊飼料中，不遵循休藥期規(guī)定，這樣就造成了動物源性食品中的藥物殘留，并最終威脅到人類健康[14-17]。

4 環(huán)丙氨嗪殘留危害

目前，已經(jīng)有越來越多的證據(jù)表明，環(huán)丙氨嗪具有一定的毒性作用。Wilson等[18]將不同劑量的環(huán)丙氨嗪混飼喂養(yǎng)來航種雞，以此來判斷環(huán)丙氨嗪對種雞繁殖性能的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)環(huán)丙氨嗪質(zhì)量濃度為2 000 mg/kg時，產(chǎn)蛋量明顯下降，種蛋孵化率降低，但精子質(zhì)量不受影響。Brake等[19]在蛋雞不同日齡混飼不同劑量的環(huán)丙氨嗪，觀察環(huán)丙氨嗪對蛋雞產(chǎn)蛋量、種蛋孵化率及雛雞健康狀況的影響。結(jié)果顯示，1 000 mg/kg組雛雞死亡率明顯高于其他組。50周齡時各組蛋殼質(zhì)量無顯著差異，但60周齡時，300 mg/kg及1 000 mg/kg組蛋殼質(zhì)量明顯降低。Brake等[20]將環(huán)丙氨嗪以不同劑量(0、500、1 000、2 000 mg/kg)混飼飼喂1～16周齡火雞，測定環(huán)丙氨嗪對火雞不同性能的影響，結(jié)果顯示，2 000 mg/kg劑量組的火雞性成熟前生長緩慢，性成熟后，受精率和蛋質(zhì)量降低。尸檢發(fā)現(xiàn)，腎臟損傷嚴(yán)重，出現(xiàn)腫大、結(jié)節(jié)和壞死灶癥狀。在慢性、亞慢性毒理試驗中，環(huán)丙氨嗪可導(dǎo)致動物體質(zhì)量下降，肝臟腫大，血細(xì)胞數(shù)量減少。環(huán)丙氨嗪在動物體內(nèi)代謝產(chǎn)物為三聚氰胺，殘留的環(huán)丙氨嗪最終導(dǎo)致三聚氰胺的蓄積，從而對動物機(jī)體或者人類產(chǎn)生危害[21]。

為了確保動物源性食品中殘留的環(huán)丙氨嗪對人體不會產(chǎn)生危害，目前我國及世界上其他國家規(guī)定了動物性食品環(huán)丙氨嗪的殘留上限。美國環(huán)境保護(hù)署規(guī)定，在牛、羊、馬、豬、雞的脂肪、肌肉及副產(chǎn)品中，環(huán)丙氨嗪的最高殘留量為0.05 mg/kg，在雞蛋中為0.25 mg/kg[22]。我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定在牛和雞的肌肉、脂肪、肝、腎組織中，環(huán)丙氨嗪最高殘留量分別為0.3 mg/kg和0.05 mg/kg[23]。

5 環(huán)丙氨嗪的監(jiān)控監(jiān)測技術(shù)

環(huán)丙氨嗪濫用導(dǎo)致的藥物殘留嚴(yán)重威脅人類健康，因此，監(jiān)控監(jiān)測環(huán)丙氨嗪對保證動物產(chǎn)品安全、維護(hù)消費(fèi)者健康安全尤為重要。

目前，國內(nèi)外已報道的檢測環(huán)丙氨嗪的方法主要包括氣相色譜法(GC)[24-25]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[26]、傅里葉變換紅外(FTIR)光譜法[27]、傅里葉變換拉曼(FT-Raman)光譜法、高效液相色譜法(HPLC)及衍生方法[28-35]。高效液相色譜法是包括美國食品藥品監(jiān)督管理局等組織使用的經(jīng)典方法。雞組織和雞蛋中的環(huán)丙氨嗪分別采用提取液乙腈/水(90/10，V/V)、甲醇/水(90/10，V/V)來提取，陽離子、陰離子交換柱凈化，最后用甲醇定容后采用4.6 mm×250 mm NH2柱，以乙腈/水(95/5，V/V)為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為214 nm。該方法肝臟和雞蛋中回收率分別為108.3%～108.7%和64.3%～68.7%[30]。蔣成君等[36]建立了環(huán)丙氨嗪含量測定的高效液相色譜方法，采用 Phenomenex Podigy Cr18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，以甲醇/乙腈/緩沖液(5/2/93,V/V/V)為流動相，流速為 2.0 mL/min，檢測波長 214 nm,柱溫 20 ℃。該方法線性范圍為 0.007 99～0.012 29 mg/mL，系統(tǒng)精密度為0.25%，平均回收率為99.2%。Shin等[37]建立了高效液相色譜法檢測禽肉和蛋中環(huán)丙氨嗪殘留的方法，樣品中環(huán)丙氨嗪用乙腈/氨水(80/20，V/V)提取，萃取凈化后溶于乙腈進(jìn)行分析。分別以C18柱、乙腈/0.5×10-3mol/L硫酸(15/85，V/V)為流動相，NH2柱、乙腈/水(75/25，V/V)為流動相作對比，前一種方法環(huán)丙氨嗪的保留時間低于4 min，增加乙腈含量并不能延長保留時間，因此,不適宜作為分析模式;第二種分析模式下，藥物的吸收峰與雜質(zhì)吸收峰有明顯區(qū)別，分離效果較好，檢測限為0.02 mg/kg，回收率超過92.8%。周煒等[38]建立了高效液相色譜法檢測雞、鴨、羊可食性動物組織中環(huán)丙氨嗪殘留檢測方法，樣品用提取液(V乙腈∶V1%三氯乙酸溶液=15∶85)提取后，用MCX固相萃取柱凈化，最后采用高效液相色譜儀測定。方法的檢測限為10 μg/kg，定量限為25 μg/kg，回收率在74.4%～107.0%，批內(nèi)變異系數(shù)在0.9%～11.9%，批間變異系數(shù)在0.3%～11.1%。樊苑牧等[39]建立了采用高效液相色譜法測定含脂羊毛中滅蠅胺的方法，樣品用80 mL的1%三氯乙酸溶液超聲提取,MCX柱凈化,Hypersil NH2色譜柱分離,水/乙腈為流動相梯度洗脫,214 nm波長處檢測，滅蠅胺檢出限為0.02 mg/kg。錢鳴蓉等[40]建立了親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定蔬菜中滅蠅胺及其代謝物三聚氰胺的方法，將蔬菜樣品勻漿后經(jīng)甲醇-水提取，取適量酸化后提取液，用陽離子固相萃取柱凈化，洗脫液用氮氣吹干，殘留物用 5 mL流動相定容。采用親水作用色譜分離，在電噴霧-選擇反應(yīng)監(jiān)測模式下，進(jìn)行定性和定量分析。以基質(zhì)校正曲線計算，添加劑量為0.04 mg/kg時，滅蠅胺的回收率為 84.2%～101.3%，滅蠅胺的定量限為 0.01 mg/kg。陸春波等[28]采用FTIR光譜和FT-Raman光譜2種方法來測定固體農(nóng)藥制劑中環(huán)丙氨嗪的含量，F(xiàn)TIR光譜法中，采用甲醇萃取環(huán)丙氨嗪，測定萃取物在1 622 cm-1的峰高，F(xiàn)T-Raman光譜法則是在拉曼光譜強(qiáng)度為623～633 cm-1時直接測定固體粉末樣品。

雖然上述這些方法靈敏度及準(zhǔn)確度高，且是國際貿(mào)易爭端的仲裁方法，但這些方法均具有不足之處，需要對樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理，處理所用的儀器設(shè)備價格昂貴，且檢測耗時較長，檢測費(fèi)用較高，且需要專業(yè)的技術(shù)人員進(jìn)行操作等，只能在一些先進(jìn)的科研院所及食品、飼料安全監(jiān)督監(jiān)測單位使用，限制了其推廣普及。隨著我國食品安全形勢的發(fā)展，急需建立操作簡單、檢測快捷、費(fèi)用低廉的環(huán)丙氨嗪檢測技術(shù)。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是經(jīng)典的免疫分析方法，是以抗原抗體的特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)建立起來的分析檢測方法，具有靈敏性強(qiáng)、特異性高、操作簡便快捷等優(yōu)點，適用于大批量樣品的快速檢測分析。因此，檢測范圍也由最初的病毒、細(xì)菌的檢測擴(kuò)大到了獸藥、農(nóng)藥、激素及毒素等半抗原小分子的定量檢測[41-44]，在臨床醫(yī)學(xué)、生物學(xué)和分析化學(xué)等領(lǐng)域得到了極為廣泛的應(yīng)用。截止目前，國內(nèi)外均未見利用免疫學(xué)方法檢測環(huán)丙氨嗪的相關(guān)文獻(xiàn)報道。環(huán)丙氨嗪屬于小分子化合物，可以通過選擇合適的偶聯(lián)方法合成環(huán)丙氨嗪人工抗原，然后通過單克隆抗體技術(shù)獲得特異性強(qiáng)、敏感性高的環(huán)丙氨嗪單克隆抗體，利用ELISA的原理建立起檢測食品中環(huán)丙氨嗪的免疫學(xué)快速檢測方法，組裝環(huán)丙氨嗪快速檢測試劑盒，用于環(huán)丙氨嗪含量的檢測。這種檢測方法，不需要使用高昂的儀器設(shè)備，操作簡單易行，適合進(jìn)行大批量樣品的快速檢測。所以，環(huán)丙氨嗪免疫學(xué)檢測技術(shù)產(chǎn)品具有比較廣闊的市場前景。

6 展望

隨著環(huán)丙氨嗪在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的普及使用，環(huán)丙氨嗪殘留所帶來的危害也越來越明顯，盡管環(huán)丙氨嗪理化檢測方法能夠相對準(zhǔn)確地測定飼料及畜產(chǎn)品中的環(huán)丙氨嗪，但畜禽養(yǎng)殖企業(yè)迫切需要的是經(jīng)濟(jì)、簡便、快捷的環(huán)丙氨嗪檢測技術(shù)，免疫學(xué)技術(shù)可以很好地解決這一問題，可以通過免疫學(xué)技術(shù)制備出環(huán)丙氨嗪單克隆抗體，開發(fā) ELISA檢測試劑盒。除此之外，還可以結(jié)合熒光偏振、各種化學(xué)發(fā)光技術(shù)、膠體金標(biāo)記等，研制出更加靈敏、觀測結(jié)果更方便的檢測產(chǎn)品。這些檢測方法更加簡便、快捷，在監(jiān)控檢測飼料中環(huán)丙氨嗪含量的同時，不僅能及時發(fā)現(xiàn)環(huán)丙氨嗪造成的食品安全隱患，還可以更好地控制環(huán)丙氨嗪的濫用及可能造成的危害。

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Research Progress of Application and Detection Methods of Cyromazine in Animal Husbandry

XING Yunrui1,2,YAO Jingjing1,WANG Fangyu1,SUN Yaning1,DENG Ruiguang1,HU Xiaofei1*

(1.Henan Key Laboratory of Animal Immunology,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China; 2.College of Animal Science and Technology,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471000,China)

Cyromazine is a common insects inhibitor,which has significant effects on controlling maggot breeding of livestock and poultry farms.It is widely used in animal husbandry.However,the long-term use of cyromazine would lead to drug-resistance of bacteria and subsequently damages animal health.Moreover,it also leads to the drug residues in animal tissues，meanwhile,it does harm to human health and even life through the food chain.Therefore,monitoring and detection of cyromazine is crucial to ensure food safety and the health of consumers.This paper summarizes the properties,applications,harm,residue detection methods of cyromazine and gives a perspective to the application of immunological detection methods in the monitoring and detection of cyromazine,so as to provide a reference for further research of cyromazine related work.

cyromazine; drug residue; food safety; detection methods

2016-06-03

國家科技支撐計劃項目(2014BAD13B05)；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院優(yōu)秀青年基金項目(2016YQ27)；河南省基礎(chǔ)前沿項目(142300413222)

邢云瑞(1990-)，女，河南舞陽人，在讀碩士研究生，研究方向：食品安全快速檢測。E-mail：xyrui1201@163.com

*通訊作者：胡驍飛(1972-)，男，河南汝南人，副研究員，博士，主要從事飼料食品免疫學(xué)快速檢測技術(shù)研究。 E-mail：huxf1972@126.com

S859.79

A

1004-3268(2017)03-0020-05