月季花純露提取的最佳工藝及有效成分的驗證

王 珍，鄭 霞，周琛彥，趙 瑩

（連云港師范高等?？茖W校海洋港口學院，江蘇連云港222006）

月季花又稱“月月紅”，在中國已有兩千多年的栽培歷史，種植面積十分廣泛。因花期較長、花色豐富、價格低廉、觀賞價值高，月季花被廣泛用于園林綠化。月季花還可以入藥，從中提取的香料具有活血調(diào)經(jīng)、消炎解毒的作用[1]。此外，月季花還有活血美容的功效，被越來越多地應(yīng)用到美容保健中[2]。純露又叫水精油，是在提煉精油的過程中分離出的飽和蒸餾原液，為精油提煉的副產(chǎn)品[3-4]。純露呈透明液體狀，除了含有少量的精油成分以外，還含有水溶性物質(zhì)，成分天然，香味清淡。相比于精油，純露低濃度的特性使肌膚更容易吸收而受到現(xiàn)代人的追捧，是不可或缺的日常美容護膚用品[5-7]。筆者采用旋轉(zhuǎn)蒸餾法提取月季花純露，是對高宏建的水蒸汽蒸餾法[8]的進一步改進，在提取過程中進行單因素實驗與正交實驗，分析實驗結(jié)果并找出月季花純露提取的最佳工藝，同時對實驗所提取的純露進行有效成分的驗證。結(jié)果表明，采用薄層色譜方法來驗證月季花純露的有效成分，方法簡單有效，快速便捷。

一、供試材料

原料：月季花，市場上購置的月季花純露。

器材：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（型號為RE52-99，上海亞榮生化儀器廠）、電熱恒溫鼓風干燥箱（型號為DHG型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、電子稱（型號為JJ3000，常熟市雙杰測試儀器廠）、硅膠薄板（HSGF254）、燒杯、量筒、研缽、冰箱、標簽紙、滴管、16 目篩、容量瓶、培養(yǎng)皿、玻璃棒、藥匙、一次性手套、透明小袋。

試劑：蒸餾水、石油醚、乙酸乙酯、乙酸、二苯胺、苯胺、磷酸、醋酸乙酯、丁酮、甲酸、氯化鋁、乙醇，以上試劑均為分析純。

二、實驗方法

（一）月季花的預(yù)處理

將采集到的月季花放至干燥箱中以40℃烘48h（注意翻面，花與花之間要有一定的間隔，不能靠到箱體，以防烘焦）。烘干后用研缽將月季花粉碎，過16目篩子，制備多份樣品。每份樣品用電子稱準確稱取3.00g，放入冰箱冷藏備用。

（二）月季花純露的提取

取樣品一份，置于500mL燒杯中，加入一定量的石油醚（沸程60℃－90℃）和水并充分攪拌混勻，靜置、浸提一定時間。將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀連接完整，打開電源，然后將浸提液與月季花粉末一起倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的料液瓶中，打開冷凝水裝置，讓冷凝水充滿冷凝器，在水浴鍋操作面板上設(shè)置水浴鍋的溫度。取出加料的橡皮塞，打開真空泵，抽走系統(tǒng)里的空氣后蓋上橡皮塞，使整個系統(tǒng)處于密封的狀態(tài)。調(diào)整轉(zhuǎn)速，蒸餾20min。將蒸餾后的浸提液和月季花粉末再加入第一次浸提的一半量的水和石油醚浸提，再次蒸餾。將兩次蒸餾收集到的蒸餾液混合再蒸餾一次，量取最后所得蒸餾液的體積。實驗結(jié)束，先關(guān)閉加熱開關(guān)與旋轉(zhuǎn)開關(guān)，使旋轉(zhuǎn)瓶上升，打開橡皮塞，關(guān)閉真空泵與電源，最后關(guān)閉冷凝水開關(guān)。

（三）單因素實驗

1.料液比

按照 1：5、1：15、1：25、1：35、1：45、1：55 的料液比（g/mL），依次量取 10mL 石油醚與 5mL、35mL、65mL、95mL、125mL、155mL蒸餾水混合于500mL燒杯中，取6份樣品分別加入上述比例的混合液中進行第一次浸提。浸提60min后，在蒸餾溫度70℃中蒸餾20min，進行第一次蒸餾；然后將料液比、浸提時間和蒸餾時間分別減半進行二次蒸餾，將兩次的蒸餾液混合進行第三次蒸餾，最后用量筒量取蒸餾得到的純露的體積。

2.浸提時間

浸提時間從混合料液開始到倒入旋轉(zhuǎn)瓶為止。取6份樣品，分別放進料液比（g/mL）為1：25的混合液（10mL石油醚和65mL蒸餾水混合，置于500mL燒杯中）中，浸泡 20min、40min、60min、80min、100min、120min。在蒸餾溫度70℃中蒸餾20min，進行第一次蒸餾，第二次、第三次蒸餾方法同上，最后用量筒量取蒸餾得到的純露的體積。

3.蒸餾溫度

蒸餾溫度的設(shè)定與浸提所添加的石油醚的沸程有關(guān)。本次實驗所用石油醚的沸程為60℃-90℃，所以蒸餾溫度設(shè)定為 60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃，蒸餾后用量筒量取所得純露的體積。

（四）正交實驗

為了發(fā)現(xiàn)提取月季花純露的最佳工藝條件，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以料液比、浸提時間、蒸餾溫度設(shè)計并進行三因素、三水平正交實驗。

（五）月季花純露中有效成分的驗證

純露的有效成分含量很少，采用顏色反應(yīng)方法對其進行定性分析結(jié)果不顯著，因此采用薄層色譜實驗法驗證月季花純露有效成分，方法簡單有效，快速便捷。薄層色譜實驗的主要原理是根據(jù)各組分在溶劑中的溶解度的不同、吸附劑對樣品各組分的吸附能力的差異，最終將混合物分離成一系列的斑點[9-10]。與高效液相色譜法相比，薄層色譜實驗法有明顯的優(yōu)勢。制備高效液相色譜柱比較困難且費用較高，而薄層層析的操作比較快捷、簡單，具有靈敏度高和準確可靠等特點，因此常用于實驗室研究[11]。所以，本次實驗采用薄層色譜實驗法來驗證提取的月季花純露中是否含有糖類物質(zhì)。

1.月季花純露中糖類物質(zhì)的驗證

點樣。用鉛筆在硅膠薄板上距離底邊1.5cm的地方劃一條直線，作為點樣的位置（注意劃線時不能將薄層戳破，否則會影響后面的展層）。在直線上用0.3×100mm的點樣毛細管吸取實驗制備的純露后點樣，將點樣的斑點直徑控制在2mm左右，不能過大。待第一次點樣的斑點完全干燥后，在原斑點的地方進行第二次點樣，可以用吹風機使點樣斑點加速風干。這是因為純露中有效成分的含量較少，只進行一次點樣展層顯色后沒有明顯效果。經(jīng)過反復(fù)實驗證明，點樣8次效果最佳。點樣次數(shù)過少，有些成分分離不出；點樣次數(shù)過多，會產(chǎn)生較嚴重的拖尾現(xiàn)象，分離效果不好。按同樣的方法點樣鑒定購買的月季花純露。

展層。將之前配制的展開劑（乙酸乙酯、乙酸、水按照體積比2：1：1配制）倒在培養(yǎng)皿中，將點樣的硅膠薄板的一端放入展開劑中，注意展開劑液面的高度不能超過點樣時所做的標記線，蓋上燒杯，使整個展開層析的裝置處于一個密封的環(huán)境，樣品從底端開始展層，待展開劑到達距離薄板頂部大約1cm時取出層析板，同時用鉛筆在頂端記錄最終展開的距離，用吹風機烘干。

顯色。將1g二苯胺加入1mL苯胺中，等完全溶解后再加入50mL的丙酮，攪拌均勻后加入5mL的85%磷酸，一邊滴加一邊攪拌，直至溶液變透明沒有渾濁為止[12]。最后將配制的顯色劑轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中保存?zhèn)溆茫芄獗４娣乐乖噭┮姽夥纸鈸]發(fā)變質(zhì)。將配制好的顯色劑倒入培養(yǎng)皿中，用鑷子將烘干的薄板完全浸沒于顯色劑中，然后取出薄板，用電吹風烘干直至層析的斑點出現(xiàn)。我們將薄板完全浸沒在顯色劑中，而沒有采用噴霧的方法顯色，是因為噴霧法控制不好會影響最后顯色的效果。

2.月季花純露中黃酮類物質(zhì)的驗證

點樣。用鉛筆在硅膠薄板上距離底邊1.5cm的地方劃一條直線，在直線處用0.3×100mm的點樣毛細管吸取實驗制備的純露后點樣，控制斑點的大小，使直徑保持在2mm左右。用吹風機加速斑點干燥，多次點樣增加樣品濃度。根據(jù)糖類物質(zhì)鑒定的需要，同樣點樣8次。按同樣的方法點樣鑒定市場購買的月季花純露。

展層。采用上述同樣的方法展層，注意展層環(huán)境密封避光，點樣的斑點不能進入展開劑（醋酸乙酯、丁酮、甲酸和水按體積比5：3：1：1配制）中，當展開劑距離薄板頂端大約1cm處時取出薄板，做好記號，用吹風機烘干。

顯色。將展層完畢的薄板浸入顯色劑（1%氯化鋁乙醇溶液，1g氯化鋁用乙醇溶解并定容至100mL）中；全程使用鑷子操作，要小心謹慎，不能破壞薄層，取出后用吹風機加熱烘干。

觀察。黃酮的顯色在自然光下無法觀察，必須在紫外燈（365nm）下觀察[13]。

3.月季花純露中氨基酸的驗證

配制氨基酸展開劑和顯色劑。氨基酸展開劑用正丁醇、乙酸（30%的冰乙酸）和水按 4：1：1（正丁醇40mL，乙酸 10mL，蒸餾水 10mL）的比例配制，其中30%的冰乙酸可以按照3mL冰醋酸加7mL蒸餾水配制；顯色劑用0.2%茚三酮-乙醇、0.2g茚三酮加0.2mL冰乙酸用無水乙醇定容至100mL配制而成，置于陰暗處保存。

點樣。用毛細管吸取提取到的月季花純露，在距硅膠板一端1.5cm處點樣，吹干。

展開。先在培養(yǎng)皿中放入展開劑，將點樣的硅膠板一端浸入展開劑，另一端靠在培養(yǎng)皿壁上，使硅膠板呈約30°傾斜，用大燒杯蓋住培養(yǎng)皿，使得展開環(huán)境密閉，待展開劑前沿距離薄板頂端1cm處將硅膠板取出。

顯色。將展好的硅膠板置于顯色劑中，浸透后，取出，用電吹風完全吹干薄層，直至色斑出現(xiàn)為止。

計算Rf值。Rf=色斑中心至點樣點中心的距離/溶劑前沿至點樣點中心的距離。若點樣一次顯色后無色斑，可多次點樣驗證。

二、結(jié)果與分析

（一）單因素實驗結(jié)果

1.月季花純露提取的最適料液比

1：25的料液比可以使提取的月季花純露質(zhì)量達到最高，1：35次之。這是因為一定的料液浸泡可以使月季花中的水溶性物質(zhì)充分溶出，質(zhì)壁分離效果更好，從而達到更好的提取效果。隨著料液比的增加，純露的提取量逐漸下降，可能是因為月季花本身的水溶性物質(zhì)揮發(fā)后就無法再蒸餾出來，料液比的增加使整個旋轉(zhuǎn)瓶內(nèi)混合液的有效物質(zhì)比重減少，反而影響了蒸餾的速度（見圖1）。

圖1 料液比對月季花純露提取的影響

2.月季花純露提取的最佳浸提時間

浸提時間對月季花純露提取的影響不顯著，也呈現(xiàn)先升后降的趨勢。浸提時間過長或過短都不利于純露的提取，根據(jù)實驗情況，最終確定最佳浸提時間是60min左右（見圖2）。

圖2 浸提時間對月季花純露提取的影響

3.月季花純露提取的最適蒸餾溫度

純露提取量隨著蒸餾溫度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢（見圖3）。蒸餾溫度的設(shè)定與添加的有機溶劑石油醚有關(guān)，因為此次實驗使用的石油醚沸程在60℃－90℃，所以蒸餾溫度必須在此范圍內(nèi)。由于熱敏物質(zhì)在溫度的上升過程中容易損失，所以溫度越高，純露的提取量反而呈下降趨勢；而溫度過低時，內(nèi)部的芳香物質(zhì)不能完全提取出來，也影響純露的提取量。為了能提取更多的月季花純露，蒸餾溫度控制在70℃左右比較合適。此外，過高的溫度在實驗過程中還會引起爆沸現(xiàn)象，為了實驗的安全，應(yīng)該選取適當?shù)恼麴s溫度。

圖3 蒸餾時間對月季花純露提取的影響

（二）正交實驗結(jié)果及分析

為了確定在多因素條件下蒸餾溫度、料液比、浸提時間與在單因素條件下實驗的結(jié)果是否吻合，正交實驗的料液比（g/mL）選擇 1：25、1：35、1：45，浸提時間選擇 40min、60min、80min，蒸餾溫度選擇 68℃、70℃、72℃（詳見表 1）。

表1 正交實驗因素水平表

由表2可以知道，各因素對純露提取的影響根據(jù)極差 R 判斷，11.6＞2.7＞2，即 C（蒸餾溫度）＞A（料液比）＞B（浸提時間），由此得出結(jié)論，蒸餾溫度是影響月季花純露提取量最重要的一個因素，其次是料液比，而浸提時間對純露提取量的多少影響最小。由極差的分析結(jié)果可知，月季花純露的較優(yōu)提取條件是A1B2C2，即料液比為 1：25（g/mL）、浸提時間 60min、蒸餾溫度70℃，與單因素實驗結(jié)果相吻合。

表2 正交實驗結(jié)果分析表

（三）月季花純露中有效成分的驗證結(jié)果

1.糖類物質(zhì)的顯色結(jié)果

實驗提取的月季花純露在點樣8次后呈現(xiàn)明顯的斑點顯色，結(jié)果見圖4的A薄板。在點樣次數(shù)相同的情況下，購買的純露顯色結(jié)果不明顯，當點樣次數(shù)加到10次后，呈現(xiàn)和A薄板相似的結(jié)果，結(jié)果見圖4的B薄板?？梢愿鶕?jù)斑點的相對位置，計算Rf值。Rf=原點到薄層層析斑點中心的距離/原點到展層溶劑前沿的距離（Rf=2.8/6=0.467）。

采用不同的展層溶劑會影響到最后的Rf值，樣品在固定相與流動相中不同的溶解度會影響Rf值的大小，若固定相中的溶解度大于流動相則Rf值偏小，反之則偏大。同時薄層的厚度、展層的距離、溫度等都會影響Rf值的大小，所以不能僅僅依據(jù)Rf值鑒定未知的樣品成分，但可以推測純露中可能有葡萄糖、果糖等成分。

圖4 糖類物質(zhì)顯色結(jié)果

2.黃酮類物質(zhì)的顯色結(jié)果

實驗制備的純露薄板點樣8次后在紫外燈的照射下有熒光的斑點出現(xiàn)，如圖5中的薄板A所示。而相同點樣次數(shù)下市場購買的則沒有斑點顯色。根據(jù)公式計算：Rf=2.1/6=0.35，推測可能有花色素、槲皮素、山奈酚等成分。黃酮類物質(zhì)是在純露中所獨有的，是植物精油中所不含的成分。黃酮類物質(zhì)有抗氧化的作用，雖然含量微少，但是作用強大，是純露有效成分中極其重要的組分。而市場購買的純露在點樣12次后有熒光斑點，如圖5的薄板B所示，說明購買的純露與實驗制備的純露相比，其黃酮化合物含量更甚微。

圖5 黃酮類物質(zhì)顯色結(jié)果

3.氨基酸的顯色結(jié)果

展開劑展出來的斑點為藍綠色，點樣次數(shù)為8次，如圖6所示。Rf=色斑中心至點樣點中心的距離/溶劑前沿至點樣點中心的距離，根據(jù)公式進行計算：Rf=2.1/6=0.35。符合藥典規(guī)范的范圍0.2-0.8。

圖6 氨基酸的顯色結(jié)果

三、討論

采用旋轉(zhuǎn)蒸餾的方法提取月季花純露，用正交實驗探究影響提取因素的條件，料液比1：25（mL）、浸提時間60min、蒸餾溫度70℃時為純露提取的最佳條件。旋轉(zhuǎn)蒸餾法比超臨界CO2萃取方法操作簡單，適合普通實驗室操作，但是在提取率上不及其他蒸餾方法，這說明該提取方法值得進一步研究。此次月季花純露提取采用的月季花都是干燥后的花，能夠保證提取條件的統(tǒng)一。為了使芳香類物質(zhì)不損失，最好采用新鮮月季花進行蒸餾提取[14]，但整個實驗周期較長。

在對有效成分的鑒定過程中，沒有發(fā)現(xiàn)一系列的斑點，可能與跑樣的長度以及試劑的選擇有關(guān)，如果采用氣相色譜儀實驗數(shù)據(jù)可能更準確。對于糖類，氨基酸和黃酮所測得的Rf值都符合藥典規(guī)定，因此可以確定月季花純露中含有這三種物質(zhì)，且實驗結(jié)果顯示實驗提取的純露的有效含量略高于購買的純露。純露作為皮膚的調(diào)理劑，具有保濕、消炎、美白等功效，但是目前純露的標準還沒有明確的規(guī)范，市場上魚龍混雜[15]，為了安全起見，建議消費者購買正規(guī)商家生產(chǎn)的純露。

本實驗對消費者在購買純露時具有指導(dǎo)借鑒意義，因為操作、設(shè)備等問題，存在一定的誤差，仍需要進行進一步的探討。

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