菌種保藏方法及復(fù)壯技術(shù)

●食用菌栽培●

菌種保藏方法及復(fù)壯技術(shù)

10.16627 /j.cnki.cn22-1215/s.2017.06.022

菌種保藏的原理是通過干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營養(yǎng)等方法，使菌種的代謝水平降低，乃至完全停止，達到半休眠或完全休眠的狀態(tài)，而在一定時間內(nèi)得到保存。需要時再通過提供適宜的生長條件使保藏物恢復(fù)活力，使菌種在較長期的保藏之后仍然保持著原有的生命力、典型的形態(tài)特征、優(yōu)良生產(chǎn)性能。目前常用的菌種保藏方法有以下幾種。

1 菌種保藏方法

1.1 斜面低溫保藏法

將需要保藏的菌種，接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，菌絲長滿斜面時，用硫酸紙包扎棉塞，旋轉(zhuǎn)在4℃的冰箱保藏。由于微生物的新陳代謝活動未停止，試管內(nèi)培養(yǎng)基易失水變干，因此，保藏時間較短，轉(zhuǎn)管次數(shù)多，不適于長期保藏。每隔六個月轉(zhuǎn)管一次。草菇菌種不耐低溫，需保藏在10～12℃，或在草菇菌落上灌注3～4毫升的防凍劑（10%的甘油）。如菌絲長滿斜面后，在無菌條件下，用無菌橡皮塞代替棉塞，并用石蠟密封，即可在室溫或冰箱中保藏。這種方法可防止雜菌污染，隔絕氧氣，避免培養(yǎng)基干燥，使用方便。

1.2 液體石蠟保藏法

石蠟防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，隔絕斜面菌絲與空氣接觸，降低微生物代謝活性，使其處于休眠狀態(tài)，因此能延長微生物的生命，保持菌種優(yōu)良的種性。一般可保藏3～5年，是一種中長期的菌種保藏方法。

液體石蠟選用化學(xué)純的，在121℃下高溫滅菌30分鐘，再將液體石蠟在160℃烘箱中保溫1～2小時，蒸發(fā)掉液體石蠟中的水，或?qū)⒏邏簻缇蟮囊后w石蠟放置在40～60℃溫箱中，使滅菌后的液體石蠟層由乳白色變成無色透明。在無菌條件下，將滅菌除水的液體石蠟用無菌吸管罐到長滿菌絲的斜面試管中，液體石蠟要高出斜面尖端1厘米左右，然后用無毒泡沫試管塞塞好，直立地放在試管架上或罐頭瓶中，置于冰箱或室溫中保藏。液體石蠟灌注過多，移種時不方便；過少，時間長容易干涸。如將棉塞齊試管中剪平，用石蠟溶封，或用無菌橡皮塞代替棉塞，可延長保藏時間。

1.3 濾紙保藏法

在無菌條件下，用干燥的濾紙條收集孢子，然后用鑷子將濾紙條及干燥硅膠放入試管中，并將試管放在真空干燥器中1～2天，除去濾紙條上水分，最后將試管口密封，貼好標(biāo)簽，置于冰箱保藏，或?qū)V紙條裝入無菌塑料瓶中，密封保藏。保藏期限可達2～5年。

1.4 真空冷凍干燥保藏法

此法系將菌種同時處于低溫、干燥和缺氧的條件下，使菌種的代謝活動相對靜止，保藏時間可達數(shù)年或更長久。其方法是：將需要保藏的菌種或懸浮液，裝在安瓿瓶里后，驟然冰凍，立即抽真空，使其快速脫水而干燥，再溶封后，置于低溫或室溫下保藏。復(fù)蘇培養(yǎng)時，可在開啟的安瓿管內(nèi)注入0.3～0.5毫升的無菌生理鹽水或1%麥芽汁。菌種安瓿瓶開啟時，應(yīng)先將安瓿瓶的封端加熱，在浸有來蘇爾等消毒液的濕布上擦一下，使管壁形成裂縫，然后再輕輕敲碎。切忌猛烈割斷，以免空氣驟然沖入，導(dǎo)致污染。

1.5 液態(tài)氮超低溫保藏法

液氮超過低溫保藏法是把菌種裝在含有冷凍保護劑的安瓿瓶內(nèi)，將該安瓿瓶放入液氮（-196℃）中進行保藏，由于菌絲體處于-196℃，其代謝降低到完全停止的狀態(tài)。所以不需定期移植。液氮超低溫保藏法是菌種長期保藏的最有效最可靠的方法。

1.5.1 菌種制備：菌種在PDA培養(yǎng)基平板上于22～24℃下培養(yǎng)10～15天，菌絲體充分生長后，用打孔器（直徑2～4毫米）切割瓊脂塊，或用手術(shù)刀片把菌絲培養(yǎng)物切成2毫米×4毫米長方形小塊。

1.5.2 安瓿管制備：安瓿管的玻璃，要能經(jīng)受溫度突變而不破裂，容易用火焰熔封管口，恢復(fù)培養(yǎng)時容易打開。一般采用硼硅玻璃管，管的大小根據(jù)需要而定，通常是75毫米×10毫米或能容1.2毫升液體的安瓿管比較合適。選好安瓿管后，用印油書寫欲保藏的食用菌菌種的菌號于管壁上，160℃干熱滅菌，使印記牢固地固定在管壁上。

1.5.3 保護劑：每管加進0.8毫升高壓滅菌的10%甘油水溶液或10%二甲亞砜水溶液可作為冷凍保護劑。用無菌鑷子將這種帶有菌絲體的瓊脂塊移入加有保護劑的安瓿管中。用火焰將安瓿管上部熔封，浸在水中檢查有無漏氣。

1.5.4 液氮保藏：把已做好的安瓿菌種管放入具有孔洞的小塑料瓶中（在塑料瓶的底部放一塊鐵片，使塑料瓶連同安瓿管能一起沉入液氮罐中），蓋好瓶蓋，在瓶蓋上連接一條細繩并作記號，以便提出所需的菌種。把裝有安瓿管的塑料瓶吊在液氮罐口上，使安瓿管緩慢地降溫，大約30分鐘后，把安瓿管浸入液氮中進行長期保存。啟用液氮罐中保存的菌種時，應(yīng)先將安瓿管置于35～40℃的溫水中，使瓶內(nèi)的冰塊迅速融解，然后在無菌條件下開啟安瓿管，用接種針取菌塊移接于適宜的培養(yǎng)基上，置于22～24℃條件下活化培養(yǎng)。

2 菌種的退化與復(fù)壯

2.1 菌種的退化

菌種在傳代過程中，因遺傳物質(zhì)發(fā)生變異而引起的原有的優(yōu)良性狀漸漸消失或變壞，出現(xiàn)長勢差、出菇遲、產(chǎn)量不高、質(zhì)量不好、子實體叢生等現(xiàn)象。這些現(xiàn)象人們泛稱為“退化”?！巴嘶笔且粋€群體概念，既栽培中子實體群體中有少數(shù)子實體與親本不同，不能算退化，只有相當(dāng)一部分乃至大部分個體的性狀都明顯變劣，群體生長性能顯著下降時，才能視為菌種退化。菌種退化是一個漸變的過程，在發(fā)生有害變異的個體在群體中顯著增多以至占據(jù)優(yōu)勢時才會顯露出來。因此盡管個體的變異可能是一個瞬時的過程，但菌種呈現(xiàn)“退化”即需要較長的時間。

2.1.1 菌種發(fā)生退化的原因：①菌種混雜：在菌種繼代培養(yǎng)過程中，不同品種間交叉感染，導(dǎo)致不同品種的菌絲體混雜在一起，導(dǎo)致原有品種生產(chǎn)性狀的改變，常常表現(xiàn)出產(chǎn)量下降、質(zhì)量變劣等。②有害突變的發(fā)生：一般來說，一個正常菌株經(jīng)過多代移植，不會導(dǎo)致遺傳性狀的改變。但是如果一個菌株的菌絲體細胞中發(fā)生有害突變，而且突變體能適應(yīng)外界環(huán)境條件，那么，隨著移接次數(shù)的增加，有害突變體在菌絲細胞群中所占的比例會逐漸增大。這樣，該菌株的生產(chǎn)性能就會隨之惡化，退化現(xiàn)象就逐漸顯現(xiàn)出來。③病毒的感染：菌種感染病毒后，病毒不僅會隨著菌絲體的擴大繁殖而增加，而且會通過帶毒孢子傳染下一代，當(dāng)菌種攜帶一定濃度的病毒粒子，在栽培中都會表現(xiàn)出明顯減產(chǎn)，菇質(zhì)量下降等退化現(xiàn)象。

2.1.2 防止菌種退化的措施：①防止菌種的混雜：在菌種轉(zhuǎn)管、出菇試驗等工作中，均應(yīng)加強品種隔離，減少品種間的混雜，以保證優(yōu)良品種的遺傳組成在較長時間內(nèi)能保持相對的穩(wěn)定。②控制菌種傳代次數(shù)：菌種傳代次數(shù)越多，產(chǎn)生變異的幾率就越高，因此菌種發(fā)生退化的概率就會越多，生產(chǎn)中應(yīng)嚴格控制菌種的移接代數(shù)。③采用有效的菌種保藏方法保存菌種：菌種保存應(yīng)是短期、中期和長期三者相結(jié)合，根據(jù)不同的要求從不同保藏方法中進行轉(zhuǎn)接，確保菌種能長期保持該品種的原有優(yōu)良性狀。④創(chuàng)造菌種生長良好營養(yǎng)條件和外界環(huán)境：菌種培養(yǎng)基的營養(yǎng)條件應(yīng)適宜，才能使菌種生長健壯，減少退化的發(fā)生。營養(yǎng)不足和過于豐富對菌種生長均不利。菌種的生長繁殖受到物理、化學(xué)、生物等外界條件的影響，如條件適宜，菌種生長正常，不易退化；不相適宜，則會引起菌種的退化。⑤防止病毒感染：對菌種可能遭受病毒的感染應(yīng)保持警惕。及時檢驗有疑問的菌種。淘汰感染病毒菌株，尤其是淘汰病毒粒子含量大、菌絲體及子實體性狀已受到嚴重影響的菌株。

2.2 菌種的復(fù)壯

保持菌種的優(yōu)良性狀及生活力強的特性是保證食用菌優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的重要條件。為了避免食用菌優(yōu)良性狀的退化，必須采取復(fù)壯措施。常用的菌種復(fù)壯方法如下：

系統(tǒng)選育：生產(chǎn)中選擇具本品種典型性狀的幼嫩子實體進行組織分離，重新獲得生長旺盛、活力強的雙核菌絲。這種方法簡便易行，周期短，生產(chǎn)上易于采用。反復(fù)進行無性繁殖，菌種會衰退，定期通過有性孢子分離和篩選，從中優(yōu)選出具有該品種典型性狀的新菌株，逐漸替代原始菌株，可不斷地使該品種得到恢復(fù)。

適當(dāng)更換培養(yǎng)基：長期在同一培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)的菌種，生活力可能逐漸下降。在菌種保藏傳代中，經(jīng)常改變培養(yǎng)基成分，或在原有的培養(yǎng)基中添加酵母膏、麥芽汁、氨基酸類物質(zhì)和維生素等，以刺激菌絲生長，提高菌種活力。

菌絲尖端分離：挑取健壯菌絲體頂端部分，進行純化培養(yǎng)，以保持菌種的純度，使菌種恢復(fù)原來的生活力和優(yōu)良種性，達到復(fù)壯的目的。