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    雉雞多殺性巴氏桿菌的分離及其藥敏試驗(yàn)

    2017-02-01 05:12:25許英民
    家禽科學(xué) 2017年2期
    關(guān)鍵詞:雉雞殺性氏桿菌

    許英民

    (黑龍江省鐵力市172信箱,黑龍江 鐵力 152500)

    雉雞多殺性巴氏桿菌的分離及其藥敏試驗(yàn)

    許英民

    (黑龍江省鐵力市172信箱,黑龍江 鐵力 152500)

    對黑龍江省鐵力市某珍禽養(yǎng)殖場發(fā)生疑似禽巴氏桿菌病對發(fā)病雉雞進(jìn)行了細(xì)菌分離,通過染色、鏡檢與生化特性等試驗(yàn)鑒定為多殺性巴氏桿菌。經(jīng)菌株的藥敏試驗(yàn)以及致病性試驗(yàn),結(jié)果表明對頭孢噻呋、氟苯尼考、新生霉素、復(fù)方新諾明、三甲氧芐胺嘧啶為敏感藥,對氨芐青霉素、卡那霉素、慶大霉素、青霉素、鏈霉素不敏感。

    雉雞;多殺巴氏桿菌;鑒定;藥敏試驗(yàn)

    巴氏桿菌病又稱禽霍亂、禽出血性敗血癥,是由多殺性巴氏桿菌引起的一種侵害家禽和野禽的接觸性傳染病,可引起禽類的急性死亡。臨床癥狀表現(xiàn)為急性、亞急性或慢性敗血癥,發(fā)病率和死亡率都很高,是對養(yǎng)禽業(yè)危害非常嚴(yán)重的傳染病之一。從2012~2015年禽巴氏桿菌病例發(fā)生的比較多,而且出現(xiàn)了新的流行特點(diǎn),如發(fā)病的家禽品種從蛋雞、肉雞、鴨、鵝到肉鴿、灰雁、鵪鶉、鷓鴣、鴕鳥及雉雞等特禽;發(fā)病禽的日齡趨于小齡化,藥物控制難度大,經(jīng)濟(jì)損失也有所增加。

    2016年3月下旬,黑龍江省鐵力市某林業(yè)局一林業(yè)經(jīng)營所某珍禽養(yǎng)殖場,飼養(yǎng)雉雞740只,已開始產(chǎn)蛋,最近幾天發(fā)現(xiàn)有的山雞開始發(fā)病,表現(xiàn)為食欲廢絕,精神萎靡,排出黃綠色糞便,開始零星死亡,而后死亡率迅速增加,每天死亡雉雞5~8只不等,同時(shí)產(chǎn)蛋量有所下降。對病死雉雞進(jìn)行剖檢,主要病變?yōu)樾陌e液,心臟有出血點(diǎn);肝臟表面布滿密布的壞死點(diǎn);脾臟萎縮;十二指腸出現(xiàn)嚴(yán)重;血液凝固不全。根據(jù)臨床癥狀和病理變化,初步懷疑是巴氏桿菌病。對該病例進(jìn)行細(xì)菌分離,通過染色、鏡檢、細(xì)菌形態(tài)、培養(yǎng)與生化特性等試驗(yàn)鑒定為多殺性巴氏桿菌。

    1 材料

    1.1 病料來源 病料來源于黑龍江省鐵力市某林業(yè)局下屬的珍禽養(yǎng)殖場,死亡和發(fā)病雉雞,具有典型的巴氏桿菌病癥狀。

    1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 21日齡未經(jīng)禽巴氏桿菌疫苗免疫的健康雉雞15只,由某珍禽養(yǎng)殖場提供。

    1.3 疫苗 使用的禽霍亂油乳劑滅活苗、禽霍亂蜂膠滅活苗,采用分離鑒定的菌株常規(guī)方法制備;多殺性巴氏桿菌病活疫苗,為省獸醫(yī)衛(wèi)生防疫站提供。

    1.4 試劑 革蘭氏染料、瑞氏染料、糖發(fā)酵管和藥敏試紙,營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基粉、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基粉、營養(yǎng)肉湯粉均購自杭州微生物試劑有限公司。參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)如下1對引物,該引物擴(kuò)增片段為457bp,上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成p1:5′-ATCCGCTATTTACCCAGTGG -3;p2:5 -GCGTAAACGAACTCGCCAC-3′。

    2 方法

    2.1 剖檢變化與病理組織學(xué)觀察 對發(fā)病死亡的雉雞進(jìn)行解剖檢查,觀察各臟器的病理變化。采集病變明顯的心臟、肝臟、肺和腦等器官的組織,用10%福爾馬林固定后,按常規(guī)方法進(jìn)行病理組織切片的制作,及用光學(xué)顯微鏡檢查各組織的病理變化。

    2.2 病原的分離 病料的選取與細(xì)節(jié)分離,取剛發(fā)病死亡的雉雞,經(jīng)無菌操作從肝臟、脾臟和腦組織器官劃線接種于鮮血瓊脂平板上,經(jīng)37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h,觀察細(xì)菌生長情況。挑取單個(gè)疑似巴氏桿菌菌落,于鮮血瓊脂平板上劃線,然后進(jìn)行純化培養(yǎng)。

    2.3 病原菌的培養(yǎng)特性及菌落形態(tài)觀察 將純化的培養(yǎng)物分別接種于鮮血瓊脂平板上、麥康凱瓊脂平板、普通營養(yǎng)瓊脂平板、營養(yǎng)肉湯上,37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h,觀察培養(yǎng)物在這3個(gè)平板及肉湯中的生長特點(diǎn)。取病死雉雞肝臟、脾臟組織觸片,分別經(jīng)美蘭染色和姬姆薩染色、鏡檢,觀察細(xì)菌形態(tài),并對分離菌純培養(yǎng)進(jìn)行涂片、革蘭氏染色、鏡檢。

    2.4 生化試驗(yàn) 對純化好的可疑細(xì)菌進(jìn)行生化試驗(yàn);用葡萄糖、果糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、吲哚、硝酸鹽、MR、VP,進(jìn)行觀察。

    2.5 藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法作藥敏試驗(yàn),對純化好的可疑菌作藥敏試驗(yàn),操作方法和判定標(biāo)準(zhǔn)參照杭州天和微生物試劑有限公司的操作方法和標(biāo)準(zhǔn)。藥敏紙片包括頭孢噻呋、氟苯尼考、阿莫西林、氨芐青霉素、先鋒霉素、阿米卡星、卡那霉素、鏈霉素、紅霉素、慶大霉素、妥布霉素、復(fù)方新諾明。

    2.6 PCR檢測 用接種環(huán)挑取可疑菌落和禽巴氏桿菌陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株,分別懸浮于含50μl無菌水的離心管中,100℃水煮5~10min,然后迅速置于冰上冷卻5min,10000r/min離心2min,分別取出上清液為PCR模板。采用25μl的反應(yīng)體系;10xTap緩存液2.5μm,25mmo/LdNTPs0.5μm,20μmol/L上、下游引物各0.5μl,Tap DNA集合酶0.5μl,無菌水 10μl,模板 10μl。95℃反應(yīng) 5min:95℃30s,56℃ 30s,72℃ 40s,進(jìn)行 35個(gè)循環(huán);最后 72℃延伸10min,產(chǎn)物于8℃短時(shí)間保存。取反應(yīng)產(chǎn)物各10μl,于含EB的10g/L瓊脂糖凝膠中,90V電泳30min,然后在紫外線下觀察。

    2.7 致病性試驗(yàn) 取6只20日齡未經(jīng)免疫禽霍亂疫苗的雉雞,肌肉注射分離菌經(jīng)24h純培養(yǎng)的菌液,1ml/只,觀察發(fā)病情況,記錄結(jié)果,對死亡雉雞進(jìn)行剖檢與病原菌復(fù)制分離。

    3 結(jié)果

    3.1 病理變化 全身組織器官出現(xiàn)嚴(yán)重的敗血癥,肝臟表面有灰白色、針尖大小、邊緣整齊的壞死點(diǎn),有時(shí)融合成塊狀;心包積液,心內(nèi)外膜嚴(yán)重出血;肺水腫、出血;氣囊膜出血、壁增厚、發(fā)生水腫(帶血、膠凍狀);腸管腫脹,充滿帶血內(nèi)容物,粘膜脫落,嚴(yán)重出血;脾臟出現(xiàn)出血、壞死;腺胃出血、氣管出現(xiàn);肺上皮細(xì)胞變性壞死;肝細(xì)胞索斷裂,空泡變性。肝血竇擴(kuò)張,充滿炎癥細(xì)胞、紅細(xì)胞、病原菌、肝細(xì)胞變性壞死;心肌細(xì)胞萎縮,間質(zhì)增寬,充滿大量紅細(xì)胞。

    3.2 涂片鏡檢 無菌操作采集病死的雉雞心血制成涂片,同時(shí)將肝臟、脾臟和淋巴結(jié)病變組織制成觸片,進(jìn)行革蘭氏染色,鏡檢,可見短小桿菌,兩端鈍圓;美蘭染色時(shí),可見典型的兩極著色的短桿菌。

    3.3 細(xì)菌分離與培養(yǎng) 從肝臟、脾臟和腦組織分離到的細(xì)菌,分離菌在鮮血瓊脂平板上長出灰白色、半透明、表面光滑的露珠狀小菌落,直徑 1~2mm,不溶血,在普通瓊脂平板上生長不良,在麥康凱平板上不生長,在肉湯培養(yǎng)初期呈均勻渾濁,24h后上清清亮,管底有灰白色絮狀物沉淀。培養(yǎng)物涂片,革蘭氏染色陰性,近似球型或雙球型。組織觸片,經(jīng)姬姆薩、美蘭染色可見到菌體呈明顯的兩極著色。

    3.4 生化試驗(yàn)結(jié)果 分離菌發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、甘露醇和甘露糖,不發(fā)酵棉子糖、乳糖和木糖,硝酸鹽試驗(yàn)陽性,硫化氫、明膠試驗(yàn)陰性,根據(jù)生化特性判定為多殺巴氏桿菌。

    3.5 PCR檢測結(jié)果 用引物擴(kuò)增時(shí),分離的疑似菌落和Pm陽性標(biāo)準(zhǔn)均有擴(kuò)增出目的條件,且大小基本一致,經(jīng)多分離菌的可疑菌落 Pm陽性PCR產(chǎn)物回收測序,與NCBI上發(fā)布的序列對比,同圓性為98.8%。

    3.6 藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法作藥敏試驗(yàn),結(jié)果分離菌株對頭孢噻呋、氟苯尼考、阿莫西林、丁胺卡那霉素高敏,對復(fù)方新諾明、妥布霉素、新霉素中敏,對青霉素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素不敏感。

    3.7 致病性試驗(yàn) 試驗(yàn)雉雞在攻毒后 24h內(nèi)即出現(xiàn)死亡,48h內(nèi)全部死亡,解剖后發(fā)現(xiàn)病變?yōu)椋盒丶?、腿肌出血?yán)重;心臟腫大,心包積液,心臟有大的出血點(diǎn)或潑水樣的出血點(diǎn);脾臟萎縮;肝臟病變不明顯;十二指腸彌漫性出血,雉雞的毛容易拔出,血液凝固不全。接種疫苗的雉雞期間未見死亡,72h對活雉雞進(jìn)行解剖,可見內(nèi)臟有輕微病變。死亡雉雞可見與自然病例相同的病理變化,并從死亡雉雞的心臟、肝臟等器官中重新分離出攻毒菌。

    4 小結(jié)與討論

    4.1 從發(fā)病死亡的雉雞中,通過解剖病變、分離細(xì)菌培養(yǎng)、染色鏡檢、生化試驗(yàn)、PCR試驗(yàn)和致病性試驗(yàn),分離到一株多殺性巴氏桿菌。由于珍禽場感染率高于分離率,說明鐵力地區(qū)部分區(qū)域已感染禽巴氏桿菌,巴氏桿菌病作為禽的疾病,對養(yǎng)禽業(yè)威脅很大。目前,養(yǎng)殖場長期、大量使用抗生素進(jìn)行豬病的預(yù)防和治療,導(dǎo)致細(xì)菌的抗藥性增強(qiáng),往往引發(fā)混合感染或繼發(fā)感染,導(dǎo)致對細(xì)菌的分離培養(yǎng)難度加大,使珍禽場治療效果也越來越差,因此,養(yǎng)禽場應(yīng)引起對雉雞的重視。

    4.2 從本試驗(yàn)結(jié)果來看,可疑菌落培養(yǎng)物攻毒在24h內(nèi)死亡,通過采集死亡雉雞臟器,再次進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定試驗(yàn),結(jié)果與本次試驗(yàn)結(jié)果相同,說明本次分離的雉雞巴氏桿菌具有較強(qiáng)的感染率。

    4.3 從藥敏結(jié)果來看,分離到的巴氏桿菌具有較強(qiáng)的致病性,對頭孢噻呋、氟苯尼考、阿莫西林和丁胺卡那高敏,但對青霉素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素和復(fù)方新諾明常用藥物產(chǎn)生抗藥性。說明這些常用藥物由于在臨床上長期使用,已形成嚴(yán)重的耐藥性,應(yīng)該引起養(yǎng)殖者的注意。在有條件的情況下,可通過藥敏試驗(yàn)篩選出高效的藥物進(jìn)行治療,制定合理的治療方案,如輪換用藥、控制劑量和療程。

    4.4 試驗(yàn)表明,應(yīng)用敏感藥物結(jié)合緊急疫苗接種,在短時(shí)間內(nèi)有效控制了該病的發(fā)生,但在實(shí)際生產(chǎn)中禽巴氏桿菌不能依賴于疫苗接種,更重要的是加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、獸醫(yī)衛(wèi)生工作,建立完善的衛(wèi)生消毒制度,堅(jiān)持以防為主、防治結(jié)合的方針,這樣才能很好地控制巴氏桿菌病的發(fā)生。

    4.5 本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的PCR引物,可直接從第1代培養(yǎng)皿上可疑菌做PCR檢查,無需提供細(xì)菌的基因組,最小檢查禽巴氏桿菌病原CFU為103/ml,檢測結(jié)果若為陽性,一般可分離出Pm,若為陰性則反之,耗時(shí)只需幾小時(shí),與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)及鑒定相比,PCR檢測大幅提升了該病的診斷速度,避免費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、漏檢、錯(cuò)檢等不足,顯示了PCR技術(shù)對疾病的早期診斷、及時(shí)治療,對減少經(jīng)濟(jì)損失具有重要意義。

    [1] Saif.YM著.蘇敬良,高福,索勛,等譯.禽病學(xué)(第 11版)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2005.

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    [3] 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)主編.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1999:209-230.

    [4] 陳博言.獸醫(yī)傳染病學(xué)(第 5版)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2006.

    [5] 徐步.我國家禽細(xì)菌病的新挑戰(zhàn)及其對策[J].中國家禽,2008,13:5-9.

    S858.394.4

    B

    1673-1085(2017)02-0047-03

    2017-01-22

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