雉雞多殺性巴氏桿菌的分離及其藥敏試驗(yàn)

許英民

（黑龍江省鐵力市172信箱，黑龍江 鐵力 152500）

雉雞多殺性巴氏桿菌的分離及其藥敏試驗(yàn)

許英民

（黑龍江省鐵力市172信箱，黑龍江 鐵力 152500）

對黑龍江省鐵力市某珍禽養(yǎng)殖場發(fā)生疑似禽巴氏桿菌病對發(fā)病雉雞進(jìn)行了細(xì)菌分離，通過染色、鏡檢與生化特性等試驗(yàn)鑒定為多殺性巴氏桿菌。經(jīng)菌株的藥敏試驗(yàn)以及致病性試驗(yàn)，結(jié)果表明對頭孢噻呋、氟苯尼考、新生霉素、復(fù)方新諾明、三甲氧芐胺嘧啶為敏感藥，對氨芐青霉素、卡那霉素、慶大霉素、青霉素、鏈霉素不敏感。

雉雞；多殺巴氏桿菌；鑒定；藥敏試驗(yàn)

巴氏桿菌病又稱禽霍亂、禽出血性敗血癥，是由多殺性巴氏桿菌引起的一種侵害家禽和野禽的接觸性傳染病，可引起禽類的急性死亡。臨床癥狀表現(xiàn)為急性、亞急性或慢性敗血癥，發(fā)病率和死亡率都很高，是對養(yǎng)禽業(yè)危害非常嚴(yán)重的傳染病之一。從2012～2015年禽巴氏桿菌病例發(fā)生的比較多，而且出現(xiàn)了新的流行特點(diǎn)，如發(fā)病的家禽品種從蛋雞、肉雞、鴨、鵝到肉鴿、灰雁、鵪鶉、鷓鴣、鴕鳥及雉雞等特禽；發(fā)病禽的日齡趨于小齡化，藥物控制難度大，經(jīng)濟(jì)損失也有所增加。

2016年3月下旬，黑龍江省鐵力市某林業(yè)局一林業(yè)經(jīng)營所某珍禽養(yǎng)殖場，飼養(yǎng)雉雞740只，已開始產(chǎn)蛋，最近幾天發(fā)現(xiàn)有的山雞開始發(fā)病，表現(xiàn)為食欲廢絕，精神萎靡，排出黃綠色糞便，開始零星死亡，而后死亡率迅速增加，每天死亡雉雞5～8只不等，同時(shí)產(chǎn)蛋量有所下降。對病死雉雞進(jìn)行剖檢，主要病變?yōu)樾陌e液，心臟有出血點(diǎn)；肝臟表面布滿密布的壞死點(diǎn)；脾臟萎縮；十二指腸出現(xiàn)嚴(yán)重；血液凝固不全。根據(jù)臨床癥狀和病理變化，初步懷疑是巴氏桿菌病。對該病例進(jìn)行細(xì)菌分離，通過染色、鏡檢、細(xì)菌形態(tài)、培養(yǎng)與生化特性等試驗(yàn)鑒定為多殺性巴氏桿菌。

1 材料

1.1 病料來源 病料來源于黑龍江省鐵力市某林業(yè)局下屬的珍禽養(yǎng)殖場，死亡和發(fā)病雉雞，具有典型的巴氏桿菌病癥狀。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 21日齡未經(jīng)禽巴氏桿菌疫苗免疫的健康雉雞15只，由某珍禽養(yǎng)殖場提供。

1.3 疫苗 使用的禽霍亂油乳劑滅活苗、禽霍亂蜂膠滅活苗，采用分離鑒定的菌株常規(guī)方法制備；多殺性巴氏桿菌病活疫苗，為省獸醫(yī)衛(wèi)生防疫站提供。

1.4 試劑 革蘭氏染料、瑞氏染料、糖發(fā)酵管和藥敏試紙，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基粉、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基粉、營養(yǎng)肉湯粉均購自杭州微生物試劑有限公司。參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)如下1對引物，該引物擴(kuò)增片段為457bp,上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成p1:5′-ATCCGCTATTTACCCAGTGG -3;p2:5 -GCGTAAACGAACTCGCCAC-3′。

2 方法

2.1 剖檢變化與病理組織學(xué)觀察 對發(fā)病死亡的雉雞進(jìn)行解剖檢查，觀察各臟器的病理變化。采集病變明顯的心臟、肝臟、肺和腦等器官的組織，用10%福爾馬林固定后，按常規(guī)方法進(jìn)行病理組織切片的制作，及用光學(xué)顯微鏡檢查各組織的病理變化。

2.2 病原的分離 病料的選取與細(xì)節(jié)分離，取剛發(fā)病死亡的雉雞，經(jīng)無菌操作從肝臟、脾臟和腦組織器官劃線接種于鮮血瓊脂平板上，經(jīng)37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h,觀察細(xì)菌生長情況。挑取單個(gè)疑似巴氏桿菌菌落，于鮮血瓊脂平板上劃線，然后進(jìn)行純化培養(yǎng)。

2.3 病原菌的培養(yǎng)特性及菌落形態(tài)觀察 將純化的培養(yǎng)物分別接種于鮮血瓊脂平板上、麥康凱瓊脂平板、普通營養(yǎng)瓊脂平板、營養(yǎng)肉湯上，37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，觀察培養(yǎng)物在這3個(gè)平板及肉湯中的生長特點(diǎn)。取病死雉雞肝臟、脾臟組織觸片，分別經(jīng)美蘭染色和姬姆薩染色、鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)，并對分離菌純培養(yǎng)進(jìn)行涂片、革蘭氏染色、鏡檢。

2.4 生化試驗(yàn) 對純化好的可疑細(xì)菌進(jìn)行生化試驗(yàn)；用葡萄糖、果糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、吲哚、硝酸鹽、MR、VP，進(jìn)行觀察。

2.5 藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法作藥敏試驗(yàn)，對純化好的可疑菌作藥敏試驗(yàn)，操作方法和判定標(biāo)準(zhǔn)參照杭州天和微生物試劑有限公司的操作方法和標(biāo)準(zhǔn)。藥敏紙片包括頭孢噻呋、氟苯尼考、阿莫西林、氨芐青霉素、先鋒霉素、阿米卡星、卡那霉素、鏈霉素、紅霉素、慶大霉素、妥布霉素、復(fù)方新諾明。

2.6 PCR檢測 用接種環(huán)挑取可疑菌落和禽巴氏桿菌陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株，分別懸浮于含50μl無菌水的離心管中，100℃水煮5～10min，然后迅速置于冰上冷卻5min，10000r/min離心2min，分別取出上清液為PCR模板。采用25μl的反應(yīng)體系；10xTap緩存液2.5μm，25mmo/LdNTPs0.5μm，20μmol/L上、下游引物各0.5μl，Tap DNA集合酶0.5μl，無菌水 10μl，模板 10μl。95℃反應(yīng) 5min:95℃30s，56℃ 30s，72℃ 40s，進(jìn)行 35個(gè)循環(huán)；最后 72℃延伸10min，產(chǎn)物于8℃短時(shí)間保存。取反應(yīng)產(chǎn)物各10μl，于含EB的10g/L瓊脂糖凝膠中，90V電泳30min，然后在紫外線下觀察。

2.7 致病性試驗(yàn) 取6只20日齡未經(jīng)免疫禽霍亂疫苗的雉雞，肌肉注射分離菌經(jīng)24h純培養(yǎng)的菌液，1ml/只，觀察發(fā)病情況，記錄結(jié)果，對死亡雉雞進(jìn)行剖檢與病原菌復(fù)制分離。

3 結(jié)果

3.1 病理變化 全身組織器官出現(xiàn)嚴(yán)重的敗血癥，肝臟表面有灰白色、針尖大小、邊緣整齊的壞死點(diǎn)，有時(shí)融合成塊狀；心包積液，心內(nèi)外膜嚴(yán)重出血；肺水腫、出血；氣囊膜出血、壁增厚、發(fā)生水腫（帶血、膠凍狀）；腸管腫脹，充滿帶血內(nèi)容物，粘膜脫落，嚴(yán)重出血；脾臟出現(xiàn)出血、壞死；腺胃出血、氣管出現(xiàn)；肺上皮細(xì)胞變性壞死；肝細(xì)胞索斷裂，空泡變性。肝血竇擴(kuò)張，充滿炎癥細(xì)胞、紅細(xì)胞、病原菌、肝細(xì)胞變性壞死；心肌細(xì)胞萎縮，間質(zhì)增寬，充滿大量紅細(xì)胞。

3.2 涂片鏡檢 無菌操作采集病死的雉雞心血制成涂片，同時(shí)將肝臟、脾臟和淋巴結(jié)病變組織制成觸片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，可見短小桿菌，兩端鈍圓；美蘭染色時(shí)，可見典型的兩極著色的短桿菌。

3.3 細(xì)菌分離與培養(yǎng) 從肝臟、脾臟和腦組織分離到的細(xì)菌，分離菌在鮮血瓊脂平板上長出灰白色、半透明、表面光滑的露珠狀小菌落，直徑 1～2mm，不溶血，在普通瓊脂平板上生長不良，在麥康凱平板上不生長，在肉湯培養(yǎng)初期呈均勻渾濁，24h后上清清亮，管底有灰白色絮狀物沉淀。培養(yǎng)物涂片，革蘭氏染色陰性，近似球型或雙球型。組織觸片，經(jīng)姬姆薩、美蘭染色可見到菌體呈明顯的兩極著色。

3.4 生化試驗(yàn)結(jié)果 分離菌發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、甘露醇和甘露糖，不發(fā)酵棉子糖、乳糖和木糖，硝酸鹽試驗(yàn)陽性，硫化氫、明膠試驗(yàn)陰性，根據(jù)生化特性判定為多殺巴氏桿菌。

3.5 PCR檢測結(jié)果 用引物擴(kuò)增時(shí)，分離的疑似菌落和Pm陽性標(biāo)準(zhǔn)均有擴(kuò)增出目的條件，且大小基本一致，經(jīng)多分離菌的可疑菌落 Pm陽性PCR產(chǎn)物回收測序，與NCBI上發(fā)布的序列對比，同圓性為98.8%。

3.6 藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法作藥敏試驗(yàn)，結(jié)果分離菌株對頭孢噻呋、氟苯尼考、阿莫西林、丁胺卡那霉素高敏，對復(fù)方新諾明、妥布霉素、新霉素中敏，對青霉素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素不敏感。

3.7 致病性試驗(yàn) 試驗(yàn)雉雞在攻毒后 24h內(nèi)即出現(xiàn)死亡，48h內(nèi)全部死亡，解剖后發(fā)現(xiàn)病變?yōu)椋盒丶?、腿肌出血?yán)重；心臟腫大，心包積液，心臟有大的出血點(diǎn)或潑水樣的出血點(diǎn)；脾臟萎縮；肝臟病變不明顯；十二指腸彌漫性出血，雉雞的毛容易拔出，血液凝固不全。接種疫苗的雉雞期間未見死亡，72h對活雉雞進(jìn)行解剖，可見內(nèi)臟有輕微病變。死亡雉雞可見與自然病例相同的病理變化，并從死亡雉雞的心臟、肝臟等器官中重新分離出攻毒菌。

4 小結(jié)與討論

4.1 從發(fā)病死亡的雉雞中，通過解剖病變、分離細(xì)菌培養(yǎng)、染色鏡檢、生化試驗(yàn)、PCR試驗(yàn)和致病性試驗(yàn)，分離到一株多殺性巴氏桿菌。由于珍禽場感染率高于分離率，說明鐵力地區(qū)部分區(qū)域已感染禽巴氏桿菌，巴氏桿菌病作為禽的疾病，對養(yǎng)禽業(yè)威脅很大。目前，養(yǎng)殖場長期、大量使用抗生素進(jìn)行豬病的預(yù)防和治療，導(dǎo)致細(xì)菌的抗藥性增強(qiáng)，往往引發(fā)混合感染或繼發(fā)感染，導(dǎo)致對細(xì)菌的分離培養(yǎng)難度加大，使珍禽場治療效果也越來越差，因此，養(yǎng)禽場應(yīng)引起對雉雞的重視。

4.2 從本試驗(yàn)結(jié)果來看，可疑菌落培養(yǎng)物攻毒在24h內(nèi)死亡，通過采集死亡雉雞臟器，再次進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定試驗(yàn)，結(jié)果與本次試驗(yàn)結(jié)果相同，說明本次分離的雉雞巴氏桿菌具有較強(qiáng)的感染率。

4.3 從藥敏結(jié)果來看，分離到的巴氏桿菌具有較強(qiáng)的致病性，對頭孢噻呋、氟苯尼考、阿莫西林和丁胺卡那高敏，但對青霉素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素和復(fù)方新諾明常用藥物產(chǎn)生抗藥性。說明這些常用藥物由于在臨床上長期使用，已形成嚴(yán)重的耐藥性，應(yīng)該引起養(yǎng)殖者的注意。在有條件的情況下，可通過藥敏試驗(yàn)篩選出高效的藥物進(jìn)行治療，制定合理的治療方案，如輪換用藥、控制劑量和療程。

4.4 試驗(yàn)表明，應(yīng)用敏感藥物結(jié)合緊急疫苗接種，在短時(shí)間內(nèi)有效控制了該病的發(fā)生，但在實(shí)際生產(chǎn)中禽巴氏桿菌不能依賴于疫苗接種，更重要的是加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、獸醫(yī)衛(wèi)生工作，建立完善的衛(wèi)生消毒制度，堅(jiān)持以防為主、防治結(jié)合的方針，這樣才能很好地控制巴氏桿菌病的發(fā)生。

4.5 本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的PCR引物，可直接從第1代培養(yǎng)皿上可疑菌做PCR檢查，無需提供細(xì)菌的基因組，最小檢查禽巴氏桿菌病原CFU為103/ml,檢測結(jié)果若為陽性，一般可分離出Pm，若為陰性則反之，耗時(shí)只需幾小時(shí)，與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)及鑒定相比，PCR檢測大幅提升了該病的診斷速度，避免費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、漏檢、錯(cuò)檢等不足，顯示了PCR技術(shù)對疾病的早期診斷、及時(shí)治療，對減少經(jīng)濟(jì)損失具有重要意義。

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S858.394.4

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1673-1085（2017）02-0047-03

2017-01-22