• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    一株鵝源鴨甲肝病毒1型的分離及A GP和RT-PCR鑒定

    2017-03-14 07:17:34季艷菊張偉王林川
    家禽科學(xué) 2017年2期
    關(guān)鍵詞:甲肝雛鵝肝炎

    季艷菊,張偉,王林川

    (1.惠州工程技術(shù)學(xué)校,廣東 惠州 516001;2.惠東縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,廣東 惠東 516300;3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510642)

    一株鵝源鴨甲肝病毒1型的分離及A GP和RT-PCR鑒定

    季艷菊1,張偉2,王林川3*

    (1.惠州工程技術(shù)學(xué)校,廣東 惠州 516001;2.惠東縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,廣東 惠東 516300;3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510642)

    鴨甲肝病毒性肝炎是一種主要針對(duì)雛鴨感染的發(fā)病急、致死性高和傳播迅速的病毒病,以肝臟腫大、出血為主要病變特征。本文從一個(gè)鵝鴨混養(yǎng)場(chǎng)的病死雛鵝肝脾臟中分離到1株病毒,進(jìn)行動(dòng)物攻毒回歸試驗(yàn),使人工攻毒雛鵝發(fā)病復(fù)制出與自然發(fā)病雛鵝相似的角弓反張及肝臟腫大出血的主要病征,即證實(shí)該分離毒株為此次鵝自然發(fā)病的致病原。后利用AGP和RT-PCR方法均鑒定出該分離毒株為鴨甲肝病毒1型,從而進(jìn)一步佐證了國內(nèi)近些年來先后報(bào)道鴨甲肝病毒1型(DHAV-1)可使雛鵝發(fā)生與雛鴨相似臨床癥狀和剖檢病理變化的鵝源鴨甲肝病毒性肝炎。啟示養(yǎng)鵝業(yè)以后也要注意鴨甲肝炎的防控,特別是在鴨鵝混養(yǎng)的地區(qū)。

    鵝源;鴨甲肝病毒I型;分離;鑒定

    鴨病毒性肝炎(Duck viral hepatitis,DVH)是一種發(fā)病急、致死性高和傳播迅速的傳染病,為鴨主要傳染病之一。該病早先有3個(gè)血清型,即DHV-I、DHV-II和DHV-III。后DHV-II和DHV-III被歸為星狀病毒科成員[1]。而同屬于小RNA病毒科的DHV-I、臺(tái)灣和韓國發(fā)現(xiàn)的新型DHV分別被命名DHV-A、DHV-B和DHV-C,其中DHV-B僅臺(tái)灣有病例報(bào)告過,DHV-C目前僅在中國大陸與韓國報(bào)告過[2]。為了避免混淆,后又將DHV-A、DHV-B和DHV-C統(tǒng)稱鴨甲肝病毒,則又有A型鴨甲肝病毒、B型鴨甲肝病毒和C型鴨甲肝病毒之稱[3]。

    根據(jù)2012年最新出版的國際病毒分類委員會(huì)第九次分類報(bào)告,將DHV-I、臺(tái)灣型鴨肝炎病毒、韓國型鴨肝炎病毒分別定名為鴨甲肝病毒1型(DHAV-1)、鴨甲肝病毒2型(DHAV-2)和鴨甲肝病毒3型(DHAV-3),它們同屬于微RNA病毒目微RNA病毒科禽肝炎病毒屬成員[4]。

    鴨甲肝病毒1型(DHAV-1),即經(jīng)典的DHV-I,現(xiàn)仍呈世界性分布,主要侵害3周齡以內(nèi)雛鴨,傳播迅速,病鴨多呈“角弓反張”姿勢(shì),以肝腫大且斑點(diǎn)狀出血為特征,死亡率達(dá)90%以上,對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)危害極大。而國內(nèi)近些年來,也先后報(bào)道鴨甲肝病毒1型還給同為水禽的鵝產(chǎn)業(yè)帶來不小的沖擊。它常發(fā)生于孵化季節(jié),主要侵害 5~30日齡的雛鵝,且傳播迅速,成鵝不易感,主要病理特征是肝腫大,并有出血點(diǎn)[5-14]。

    2016年4月份,廣東省粵東某縣的一個(gè)鵝鴨混養(yǎng)場(chǎng)的一批19日齡雛鵝出現(xiàn)精神萎靡、不喜走動(dòng),2~3d后大批出現(xiàn)“角弓反張”姿勢(shì)的陣發(fā)性抽搐并死亡,第5天達(dá)發(fā)病死亡高峰期,后統(tǒng)計(jì)到此發(fā)病率為31%,死亡率19%,對(duì)病死鵝剖檢病變?yōu)楦文[大、點(diǎn)狀出血,該場(chǎng)同時(shí)飼養(yǎng)有50多日齡和60多日齡番鴨各一批,雖未發(fā)病,但了解到場(chǎng)里有鴨甲肝病發(fā)病史。通過雛鵝發(fā)病的臨床癥狀及解剖病理變化等,初步懷疑雛鵝感染DHAV。本文作者通過采集1份疑似感染DHAV的病鵝肝臟,接種鴨胚,從致死胚中分離獲得1株病毒(暫命名為GHZ16),并先后經(jīng)過AGP和 RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定,確診造成鵝發(fā)病死亡的病原為鵝源鴨甲肝病毒I型。

    1 材料

    1.1 病料 病料取自廣東省粵東某縣的一個(gè)鵝鴨混養(yǎng)場(chǎng)的疑似鴨甲肝典型臨床癥狀和病理變化的病死鵝的肝、脾臟組織。

    1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 9日齡無DVH免疫番鴨胚,購自惠州惠東某種鴨場(chǎng);1日齡無DVH母源抗體的雛鵝,購自惠州博羅某種鵝場(chǎng)。

    1.3 DHAV-1兔高免血清 由廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室家禽病毒病研究分室提供。

    1.4 試 劑 ViraPrepTM MammalKit: 購 自MaxyBio公司,Trizol Reagent購自 Invitrogen上海有限責(zé)任公司,M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Tag DNA聚合酶購自 Fements公司,dNTP Mixture、DNA marker DL2000購自寶生物工程(大連)有限公司,瓊脂糖為0XIOD公司產(chǎn)品,DEPC購自北京鼎國公司,磷酸緩沖鹽溶液、普通瓊脂平板等自行配制。

    2 方法

    2.1 病毒的分離 將采取的具有疑似DVH典型臨床癥狀和病理變化的病死鵝的肝、脾臟組織,按照 1:5~10(g/ml)比例加入無菌生理鹽水,充分剪碎研磨并反復(fù)凍融三次,后6000r/min離心10min,取上清,加入2000IU/ml雙抗(青、鏈霉素)處理,置于4℃冰箱過夜,通過尿囊腔接種9日齡無DVH免疫番鴨胚,0.2ml/枚,接種10枚,37℃恒溫傳代培養(yǎng),同時(shí)設(shè)無菌生理鹽水注射10枚番鴨胚對(duì)照組,每日照胚2次,棄去24h內(nèi)死亡的,將24h~96h內(nèi)死亡的放于4℃過夜,回收尿囊液于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.2 病毒的純化

    2.2.1 病毒的傳代 將鴨胚尿囊液經(jīng)無菌處理,再次接種9日齡的健康番鴨胚(0.2ml/枚),接種10枚,同時(shí)設(shè)立無菌生理鹽水對(duì)照組,盲傳 3代,將病毒進(jìn)行初步純化,收集死胚尿囊液,于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.2.2 濃縮、純化試劑處理 將傳代的初步純化病毒尿囊液以3000r/min,4℃離心30min,取上清液;再以10000r/min,4℃離心30min,取上清。后經(jīng)透析袋透析濃縮為原體積的1/4~1/5。

    濃縮病毒液用ViraPrepTM Mammal Kit處理:將一定體積濃縮病毒液,加入等體積的BUFFER 1,反復(fù)顛倒混勻;再加入1/4原濃縮病毒液體積的VIRAFFINITY,反復(fù)顛倒混勻,于室溫放置5min。室溫1000r/min離心10min,棄上清;沉淀用原體積的BUFFER 1重懸,室溫1000r/min,重復(fù)操作兩次;加3倍原體積的BUFFER 2,若需要最小的稀釋,則用1倍原體積BUFFER 2,反復(fù)顛倒混勻,沉淀完全溶解后,用離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速離心10min,收集上清;此上清即為純化好的病毒液。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.3 病毒的鑒定

    2.3.1 動(dòng)物攻毒回歸試驗(yàn) 選擇無鴨病毒性肝炎母源抗體的1日齡雛鵝 20只,分為2組,10只/組。A組將2.2.2獲得的純化病毒液采取腿部肌注進(jìn)行攻毒,攻毒量為0.5ml/只;B組為生理鹽水對(duì)照。兩組試驗(yàn)鴨分開隔離飼養(yǎng)。每日觀察記錄病死情況,并剖檢死鵝且記錄剖檢變化。

    2.3.2 AGP鑒定 取普通瓊脂平板,中間孔加入

    2.2.2濃縮、純化的病毒液,周圍孔加入依次 20、2-1、2-2、2-3、2-4、2-5稀釋的兔高免血清, 后先將瓊脂板正放入濕盒并 37℃作用 1h,再倒放于 37℃作用12~36h,觀察AGP結(jié)果。

    2.3.3RT-PCR鑒定

    2.3.3.1 引物設(shè)計(jì) 參照馬秀麗[15]的方法由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成鑒定DHAV-1的引物,其擴(kuò)增長度為199bp。上游引物為:5'-CACCCATCACCATTCTATAAGC-3';下游引物為:5'-GGGGAGACCAAACGACAA-3'。使用前,用DEPC水溶解成20pmol/μl溶液,小量分裝,于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.3.3.2 病毒RNA提取 參照Trizol法提取。取病毒液200μl,加750μl的Trizol溶液充分振蕩,室溫作用 10min;后加 200μl氯仿抽提 1次,12, 000rpm離心5min,取上清液;加等體積異丙醇,于室溫作用 10min,12,000rpm離心 5min;沉淀用75%乙醇洗滌,12,000rpm離心5min,取沉淀物;加適量的DEPC水溶解沉淀,于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.3.3.3 RT-PCR反應(yīng) RT反應(yīng)體系 (20μl)按如下表1。置于PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng),M-MLV(5U/μl)1μl于42℃時(shí)加入;反應(yīng)程序:70℃ 5min,42℃ 30min,94℃ 2min。

    表1 RT反應(yīng)體系

    PCR反應(yīng)體系(50μl)按如下表2。置于 PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性 5min;94℃變性30s、53℃退火30s、72℃延伸30s,35個(gè)循環(huán);72℃后延伸7min;4℃保存。

    表2 PCR反應(yīng)體系

    PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠(0.5μg/ml EB)中電泳檢測(cè)。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 動(dòng)物攻毒回歸試驗(yàn) 攻毒A組,雛鵝于攻毒后第2天開始發(fā)病,病初表現(xiàn)精神不振,離群不愿走動(dòng),食欲下降,排黃白或綠色稀糞;第3天出現(xiàn)神經(jīng)癥狀,雙腳呈痙攣性劃動(dòng)或在地上翻滾、旋轉(zhuǎn),臨死前多呈角弓反張姿勢(shì)(如圖1),數(shù)小時(shí)后急性死亡。第5天達(dá)發(fā)病死亡高峰期,最后統(tǒng)計(jì)到發(fā)病率為30%,死亡率20%,剖檢特征病變?yōu)楦闻K腫大,表面多有彌漫性出血點(diǎn)或出血斑(如圖 2)。對(duì)照B組,健康未發(fā)病。詳見表3。

    圖1 角弓反張

    圖2 肝臟腫大且有彌漫性出血點(diǎn)斑

    表3 動(dòng)物回歸試驗(yàn)鴨病死情況

    攻毒A組發(fā)病的系列癥狀、剖檢變化與當(dāng)初采集病料時(shí)鵝的臨床發(fā)病及剖檢結(jié)果相似,說明該動(dòng)物攻毒回歸試驗(yàn)成功復(fù)制出鵝自然發(fā)病病例,即分離毒株為鵝自然發(fā)病病例的致病原。

    3.2 病毒分離 將病料接種10日齡番鴨胚96h后,番鴨胚全部死亡,陰性對(duì)照未死亡。病料接種死亡番鴨胚體的病變表現(xiàn)為:全身出血與水腫,肝臟腫大且明顯出血點(diǎn)(如圖3)。凍存的胚液繼續(xù)盲傳2代,第3代對(duì)番鴨胚的致死率均為100%。確定了該鵝場(chǎng)的致病原是病毒。

    圖3 病毒分離試驗(yàn)對(duì)照?qǐng)D

    3.3 病毒的鑒定

    3.3.1 AGP鑒定結(jié)果 取瓊脂板,中間孔加入疑似DHV尿囊液,周圍孔加入依次20、2-1、2-2、2-3、2-4、2-5稀釋的兔高免血清,后37℃作用,觀察AGP結(jié)果,說明疑似DHV為DHAV-1。分離毒株的AGP結(jié)果如下圖4。

    圖4 AGP結(jié)果

    3.3.2 RT-PCR鑒定結(jié)果 利用馬秀麗鑒定DHAV-1的特異引物,對(duì)疑似DHAV毒株進(jìn)行RTPCR反應(yīng),結(jié)果能擴(kuò)增到與預(yù)期相符的199bp特異性目的片段(圖5)。說明疑似DHAV為DHAV-1。

    圖5 疑似DHAV毒株RT-PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)結(jié)果

    4 討論

    1950年,由Levine與Fabricant首次分離出鴨甲肝病毒(DHAV)[16],之后鴨甲肝病毒在許多國家和地區(qū)相繼分離出來。近些年來,鴨甲肝病毒性肝炎的流行病學(xué)特征及其病毒的基因型等發(fā)生了一定的改變,在我國大陸及臺(tái)灣地區(qū),一些養(yǎng)鴨場(chǎng)有用經(jīng)典的DHAV-I弱毒疫苗或用其高免卵黃抗體免疫注射鴨群后仍發(fā)生典型鴨肝炎的報(bào)道。于是,研究學(xué)者們從臺(tái)灣和韓國病死鴨中分別分離到鴨甲肝病毒 2型 (DHAV-2)和鴨甲肝病毒 3型(DHAV-3)[2],鴨甲肝病毒2型(DHAV-2)、鴨甲肝病毒3型 (DHAV-3)與經(jīng)典的鴨甲肝病毒1型(DHAV-1)現(xiàn)同屬于微RNA病毒目微RNA病毒科禽肝炎病毒屬成員,為3個(gè)鴨甲肝病毒不同的基因型[4]。

    鴨甲肝炎一般常見發(fā)生于雛鴨,成年種鴨即使在污染的圈舍中也無臨床癥狀,產(chǎn)蛋正常。而國內(nèi)近些年來,也先后報(bào)道鴨甲肝病毒1型(DHAV-1)還可使雛鵝發(fā)生與雛鴨相似臨床癥狀和剖檢病理變化的鵝源鴨甲肝炎[5-14]。

    本文利用AGP和RT-PCR檢測(cè)方法,從疑似發(fā)生鵝源病毒性肝炎的病死鵝肝脾臟組織中檢測(cè)到DHAV-1型病毒,用鴨胚分離純化得到鴨甲肝炎病毒GHZ16株(DHAV-1型),及GHZ16株病毒人工感染雛鵝能復(fù)制出與臨床自然病例相似的病例,由此可確診:2016年 4月份,廣東省粵東某縣的一個(gè)鵝鴨混養(yǎng)場(chǎng)的一批19日齡雛鵝暴發(fā)的疾病由DHAV-1型感染所致。

    本文證實(shí)鴨甲肝炎病毒1型能自然感染雛鵝發(fā)病,從而進(jìn)一步佐證了國內(nèi)近些年來先后報(bào)道鴨甲肝病毒1型(DHAV-1)可使雛鵝發(fā)生與雛鴨相似臨床癥狀和剖檢病理變化的鵝源鴨甲肝病毒性肝炎,也導(dǎo)致雛鵝較高的發(fā)病率和死亡率。因此,在雛鵝養(yǎng)殖過程,除加強(qiáng)小鵝瘟等疾病的防控外,也不可忽視鴨甲肝炎病毒感染的危害,特別是在有鴨鵝混養(yǎng)的地區(qū),以給養(yǎng)鵝業(yè)帶來重要啟示。

    [1] Todd D,smyth V J,Ball N W,et al.Identification of chicken enteroviruslike viruses,duck hepatitis virus type 2 and duck hepatltis virus type 3 as astroviruses[J].AvlanPathl,2009,38:21-30.

    [2] Wang Liyan,Pan Meng,F(xiàn)u Yu,et al.Classification of duck hepatitis virus Into three genotypes based on molecular evolutionary analysis[J].Virus Genes,2008,37:52-59.

    [3] Fu Y,Pan M,Wang x,et al.Molecular detection and typing of duck hepatitis A virus directly from clinicalspecimens[J].vctMicrobiol,2008,131:247-257.

    [4] 張忠信.ICTV第九次報(bào)告對(duì)病毒分類系統(tǒng)的一些修改[J].病毒學(xué)報(bào),2012,28(5):595-599

    [5] 孫泉云,周錦萍,張?zhí)K華,等.雛鵝鴨肝炎病毒的分離與鑒定[J].中國家禽,2002,24(14):19

    [6] 許國強(qiáng),廖成瑩,張洪培.一例雛鵝感染鴨病毒性肝炎的診治 [J]。中國禽業(yè)導(dǎo)刊,2004,21(21):33.

    [7] 曲麗萍,閻德平,吳紅波,等.鵝病毒性肝炎的診治[J].水禽世界,2008,(4):25-26.

    [8] 許家榮,郭俊清,高金寶.雛鵝病毒性肝炎的診治[J].畜牧與獸醫(yī),2009,41(1):74-75.

    [9] LIU M,F(xiàn)ANYI M,LI X J,et a1.Goose haemorrhagic hepatitis caused by a new subtype duck hepatitis type 1 virus[J].VetMicrobiol,2011,152(3/4):280-283.

    [12] 傅光華,陳紅梅,黃瑜,等.雛番胰腺型鴨l型甲肝病毒分離鑒定及VP1基因分析 [J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2012,27(9):945-950.

    [13] 唐妤,甘艷君,陳思懷等.重慶地區(qū)雛鵝暴發(fā)鴨病毒性肝炎[J].中國獸醫(yī)雜志,2012,48:12-15.

    [14] 陳珍,陳紅梅,傅光華,等.種鵝源鴨甲肝病毒1型的分離鑒定及其 VP1l基因分析[J].畜牧與獸醫(yī),2015,47(8):81-84.

    [15] 馬秀麗,宋敏訓(xùn),黃兵,等.I型鴨病毒性肝炎病毒RT-PCR檢測(cè)方法的建立 [J].家禽科學(xué),2006,(11):11-13.

    [16] SAIF Y M.蘇敬良,高福,索勛,譯.禽病學(xué)(第 12版)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2012:431-436.

    Solation and Identification of Duck Hepatitis Virus A type 1 with Goose-origin

    JI Yan-ju1,ZHANG Wei2,WANG Lin-chuan3
    (1.Huizhou Engineering and Technology School,Huizhou 516000,China;2.HuidongAnimal Disease Control Center,Huidong 516300,China;3.South China Agricultural University,Guangzhou,510642,China)

    Duck hepatitis virus A hepatitis is a major disease in ducks infected with acute and lethal and viral disease spread rapidly, with the enlargement of the liver, bleeding as the main pathological syndrome. In this paper, isolated from a goose and duck polyculture field in the spleen of the dead young goose 1 virus strains were inoculated,animal regression test,the artificial inoculation of gosling incidence to replicate the majorsymp to mssimilarto natural incidence of gosling opposthotonis and enlargement of the liver hemorrhage, which confirmed the pathogen strains for the natural occurrence of goose the.After using AGP and RT-PCR methods were identified in the isolate of duck hepatitis virus Atype 1. Further evidence of China in recent years has reported duck hepatitis virusA type 1(DHAV-1)can make the occurrence of gosling goose duck hepatitis virus hepatitis and ducklings similar clinical symptoms and pathological pathological changes.After the revelation of goose industry should also pay attention to the prevention and control of duck hepatitis A, especially in the area of polyculture duck goose.

    goose-origin;Duck Hepatitis Virus A type 1;isolation;identification

    S858.332.65

    B

    1673-1085(2017)02-0030-05

    2017-01-14

    季艷菊(1980-),女,畜牧獸醫(yī)講師,在讀在職獸醫(yī)專業(yè)博士,從事獸醫(yī)教學(xué)和科技研究工作。研究方向:動(dòng)物傳染病研究,郵箱:weiran809@163.com。

    *通訊作者:王林川(1965-),男,教授,博士,研究方向:畜禽疫病病原及其防控研究。

    猜你喜歡
    甲肝雛鵝肝炎
    灌云縣2001—2018 年出生兒童甲肝疫苗預(yù)防接種效果評(píng)價(jià)
    《世界肝炎日》
    世界肝炎日
    雛鵝新型病毒性腸炎的診斷與防治
    雛鵝痛風(fēng)“三步五防”更有效
    吃錯(cuò)海鮮,小心得肝炎
    春季甲肝高發(fā)需謹(jǐn)慎
    戰(zhàn)勝肝炎,沿需努力
    關(guān)注肝炎 認(rèn)識(shí)肝炎
    雛鵝的飼養(yǎng)管理技術(shù)淺析
    国产伦在线观看视频一区| 午夜福利在线在线| 国产三级在线视频| 精华霜和精华液先用哪个| 欧美黑人精品巨大| 中亚洲国语对白在线视频| 在线观看免费午夜福利视频| 国产成人啪精品午夜网站| 国产精品野战在线观看| 久热爱精品视频在线9| 波多野结衣高清无吗| 午夜福利18| 国产一区二区在线观看日韩 | 亚洲专区国产一区二区| 国产精品久久久av美女十八| 日本精品一区二区三区蜜桃| 深夜精品福利| 亚洲av成人av| 一边摸一边抽搐一进一小说| 欧美成人免费av一区二区三区| 午夜精品一区二区三区免费看| 欧美乱色亚洲激情| 好男人电影高清在线观看| 国产精品久久久av美女十八| 麻豆久久精品国产亚洲av| 九色成人免费人妻av| 在线免费观看的www视频| 亚洲激情在线av| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 男女下面进入的视频免费午夜| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久久久久九九精品二区国产 | 色在线成人网| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲午夜理论影院| 黄色丝袜av网址大全| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产在线观看jvid| 三级国产精品欧美在线观看 | 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产亚洲精品久久久久5区| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 极品教师在线免费播放| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 久久草成人影院| 夜夜夜夜夜久久久久| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产成人欧美在线观看| 亚洲男人的天堂狠狠| √禁漫天堂资源中文www| 最近最新中文字幕大全电影3| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 精品日产1卡2卡| 亚洲av电影不卡..在线观看| 制服诱惑二区| 国产亚洲欧美在线一区二区| 欧美性猛交黑人性爽| 一个人免费在线观看的高清视频| 91成年电影在线观看| a级毛片a级免费在线| 久久久精品欧美日韩精品| 午夜福利免费观看在线| 成人午夜高清在线视频| 国产真实乱freesex| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲男人天堂网一区| 999久久久国产精品视频| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲全国av大片| 日本五十路高清| 色噜噜av男人的天堂激情| avwww免费| 色噜噜av男人的天堂激情| 他把我摸到了高潮在线观看| 深夜精品福利| 久久久久久国产a免费观看| 久久久久久大精品| 久久久久久国产a免费观看| 岛国在线免费视频观看| 麻豆av在线久日| 一本一本综合久久| 99在线视频只有这里精品首页| e午夜精品久久久久久久| 午夜福利成人在线免费观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲男人的天堂狠狠| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲欧美激情综合另类| 国产亚洲欧美98| 精品久久久久久久久久久久久| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产激情欧美一区二区| 亚洲中文日韩欧美视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲精品av麻豆狂野| 啦啦啦韩国在线观看视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产免费男女视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 91在线观看av| 国产亚洲精品av在线| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 久久午夜综合久久蜜桃| 级片在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲成av人片在线播放无| 国产精品乱码一区二三区的特点| 久久国产精品影院| 亚洲全国av大片| 男女下面进入的视频免费午夜| 99热只有精品国产| 露出奶头的视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产成人aa在线观看| 国产精品一区二区免费欧美| 999精品在线视频| 宅男免费午夜| 桃色一区二区三区在线观看| 韩国av一区二区三区四区| 18禁观看日本| 黄色视频,在线免费观看| 久9热在线精品视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 欧美激情久久久久久爽电影| 99久久精品热视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 亚洲免费av在线视频| 亚洲午夜理论影院| 免费电影在线观看免费观看| 日韩大码丰满熟妇| 窝窝影院91人妻| 亚洲成人久久性| 90打野战视频偷拍视频| 国产视频内射| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 欧美日本亚洲视频在线播放| 99国产精品一区二区蜜桃av| 久久香蕉激情| 亚洲五月天丁香| 亚洲乱码一区二区免费版| 五月伊人婷婷丁香| 国产精品一及| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲av第一区精品v没综合| or卡值多少钱| 国产精品一及| videosex国产| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 啪啪无遮挡十八禁网站| 最近在线观看免费完整版| bbb黄色大片| 亚洲欧美精品综合久久99| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久久久免费精品人妻一区二区| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲 国产 在线| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国产精品综合久久久久久久免费| 黄色视频不卡| 精品一区二区三区四区五区乱码| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产野战对白在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 中出人妻视频一区二区| 小说图片视频综合网站| 一区福利在线观看| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产高清视频在线观看网站| 男人的好看免费观看在线视频 | 色哟哟哟哟哟哟| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲欧美日韩高清专用| 欧美最黄视频在线播放免费| 男女午夜视频在线观看| 免费搜索国产男女视频| √禁漫天堂资源中文www| 小说图片视频综合网站| 深夜精品福利| 1024手机看黄色片| 国产1区2区3区精品| 在线观看www视频免费| 日本精品一区二区三区蜜桃| 99热这里只有精品一区 | 国产三级中文精品| 国产精品 国内视频| 日日夜夜操网爽| 国产真人三级小视频在线观看| 国产av又大| 又黄又粗又硬又大视频| 色综合站精品国产| 精品一区二区三区av网在线观看| 一a级毛片在线观看| 一级作爱视频免费观看| 欧美日韩精品网址| 床上黄色一级片| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久精品91蜜桃| 99国产综合亚洲精品| 国产久久久一区二区三区| 日本成人三级电影网站| 亚洲男人天堂网一区| 搡老妇女老女人老熟妇| 男插女下体视频免费在线播放| 又大又爽又粗| 免费搜索国产男女视频| e午夜精品久久久久久久| 人人妻人人看人人澡| 十八禁人妻一区二区| 久久中文字幕一级| 久久久久国内视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 日韩大尺度精品在线看网址| 一二三四在线观看免费中文在| 大型黄色视频在线免费观看| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲国产欧美一区二区综合| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲国产精品久久男人天堂| 一本大道久久a久久精品| 两个人的视频大全免费| 亚洲激情在线av| 精品免费久久久久久久清纯| 黄色a级毛片大全视频| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 色av中文字幕| 国产高清视频在线播放一区| 一个人免费在线观看电影 | 亚洲av成人精品一区久久| 久久久久亚洲av毛片大全| 欧美成人性av电影在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲乱码一区二区免费版| 日本 欧美在线| 成人一区二区视频在线观看| 欧美在线黄色| 日本一二三区视频观看| 中文字幕av在线有码专区| 成人三级黄色视频| 午夜免费激情av| 亚洲av成人一区二区三| 国产91精品成人一区二区三区| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产真人三级小视频在线观看| 日韩大码丰满熟妇| 一级毛片高清免费大全| www日本黄色视频网| 亚洲五月婷婷丁香| 日本成人三级电影网站| 亚洲精华国产精华精| 一本大道久久a久久精品| av有码第一页| 99精品在免费线老司机午夜| 日韩精品免费视频一区二区三区| 最近在线观看免费完整版| 9191精品国产免费久久| 少妇被粗大的猛进出69影院| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 婷婷亚洲欧美| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产日本99.免费观看| 精品福利观看| 国产av不卡久久| www国产在线视频色| 国产精品亚洲一级av第二区| or卡值多少钱| 精品第一国产精品| av中文乱码字幕在线| 中国美女看黄片| 精品高清国产在线一区| 国产又色又爽无遮挡免费看| 日韩有码中文字幕| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 亚洲成a人片在线一区二区| 成人欧美大片| 国产精品av视频在线免费观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 99久久99久久久精品蜜桃| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲人与动物交配视频| 国产乱人伦免费视频| 久久久久久久午夜电影| www.精华液| 一区二区三区高清视频在线| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产1区2区3区精品| 国产又色又爽无遮挡免费看| 热99re8久久精品国产| 成人永久免费在线观看视频| 香蕉av资源在线| 很黄的视频免费| av免费在线观看网站| 男女做爰动态图高潮gif福利片| av福利片在线| 岛国在线观看网站| 国产欧美日韩精品亚洲av| 最新在线观看一区二区三区| 一级黄色大片毛片| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| √禁漫天堂资源中文www| 大型黄色视频在线免费观看| 午夜福利在线观看吧| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲美女视频黄频| 精品一区二区三区四区五区乱码| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 我要搜黄色片| 国内精品久久久久精免费| 一级a爱片免费观看的视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 黄片小视频在线播放| 女警被强在线播放| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 叶爱在线成人免费视频播放| 怎么达到女性高潮| 香蕉av资源在线| 欧美中文日本在线观看视频| 日韩欧美 国产精品| 一级片免费观看大全| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 久久亚洲精品不卡| 女人被狂操c到高潮| 日本黄大片高清| 制服丝袜大香蕉在线| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产野战对白在线观看| 久99久视频精品免费| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 丝袜人妻中文字幕| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产一区二区激情短视频| 日韩欧美在线二视频| 日韩精品青青久久久久久| 男人的好看免费观看在线视频 | 国产精品,欧美在线| 久久久久性生活片| 国产99白浆流出| 岛国在线免费视频观看| 99国产精品99久久久久| 美女免费视频网站| 操出白浆在线播放| 亚洲中文字幕日韩| 日韩高清综合在线| 亚洲人成77777在线视频| 免费在线观看完整版高清| 欧美色视频一区免费| 国产99白浆流出| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 精品一区二区三区av网在线观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 久久精品91无色码中文字幕| 中文资源天堂在线| 在线永久观看黄色视频| 国产成人aa在线观看| 全区人妻精品视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 中文在线观看免费www的网站 | 国产成人影院久久av| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产主播在线观看一区二区| 国模一区二区三区四区视频 | 观看免费一级毛片| 午夜影院日韩av| 欧美成狂野欧美在线观看| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲av成人av| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 此物有八面人人有两片| 在线观看午夜福利视频| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产男靠女视频免费网站| 久久性视频一级片| 国产精品国产高清国产av| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 中文字幕最新亚洲高清| 村上凉子中文字幕在线| 午夜精品久久久久久毛片777| 国语自产精品视频在线第100页| 久久中文字幕人妻熟女| 脱女人内裤的视频| 亚洲,欧美精品.| 精品国产乱子伦一区二区三区| 黄色视频不卡| 欧美日韩国产亚洲二区| 69av精品久久久久久| 久热爱精品视频在线9| 黄片大片在线免费观看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 在线视频色国产色| 亚洲男人的天堂狠狠| 免费av毛片视频| 九色国产91popny在线| 亚洲18禁久久av| 免费一级毛片在线播放高清视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 成年版毛片免费区| 成年人黄色毛片网站| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 搡老妇女老女人老熟妇| 一级黄色大片毛片| 成人av在线播放网站| 午夜福利在线在线| 成人亚洲精品av一区二区| 久久这里只有精品中国| 欧美久久黑人一区二区| 国产三级黄色录像| 欧美乱色亚洲激情| 国模一区二区三区四区视频 | 在线观看免费午夜福利视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲精华国产精华精| 欧美日韩瑟瑟在线播放| a级毛片a级免费在线| 色综合婷婷激情| 国产三级黄色录像| 淫妇啪啪啪对白视频| 久久久久久久久久黄片| 日韩欧美在线乱码| cao死你这个sao货| 国产一区二区三区视频了| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 午夜影院日韩av| 亚洲男人的天堂狠狠| 美女黄网站色视频| 免费一级毛片在线播放高清视频| 一夜夜www| 在线a可以看的网站| 久久性视频一级片| 亚洲精品在线观看二区| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲激情在线av| 啦啦啦韩国在线观看视频| 叶爱在线成人免费视频播放| av免费在线观看网站| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美日本亚洲视频在线播放| 色尼玛亚洲综合影院| 深夜精品福利| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲五月天丁香| 免费在线观看影片大全网站| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 久久精品影院6| 亚洲一区二区三区不卡视频| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 淫妇啪啪啪对白视频| 舔av片在线| 国产精品99久久99久久久不卡| 精品欧美国产一区二区三| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲国产中文字幕在线视频| 九色成人免费人妻av| 国产伦一二天堂av在线观看| 日韩高清综合在线| www.自偷自拍.com| 亚洲男人的天堂狠狠| www.999成人在线观看| 9191精品国产免费久久| 麻豆av在线久日| 精品电影一区二区在线| 婷婷丁香在线五月| 亚洲18禁久久av| 亚洲一区二区三区不卡视频| 日韩大码丰满熟妇| 国产av在哪里看| 欧美国产日韩亚洲一区| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久久久亚洲av毛片大全| 日韩欧美在线二视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲最大成人中文| 欧美色视频一区免费| 亚洲国产精品sss在线观看| 久久人妻av系列| 听说在线观看完整版免费高清| 一二三四在线观看免费中文在| 日韩有码中文字幕| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲七黄色美女视频| 欧美日韩黄片免| 国产成人欧美在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 又黄又粗又硬又大视频| 成年人黄色毛片网站| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲在线自拍视频| 一夜夜www| 身体一侧抽搐| 久久草成人影院| 国产精品一区二区三区四区久久| 亚洲在线自拍视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产探花在线观看一区二区| 麻豆国产97在线/欧美 | 99re在线观看精品视频| 特大巨黑吊av在线直播| 美女免费视频网站| 亚洲国产中文字幕在线视频| 黄色女人牲交| 伦理电影免费视频| 久久久久久久久久黄片| 一级毛片女人18水好多| 麻豆国产97在线/欧美 | 18禁国产床啪视频网站| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 黄色视频不卡| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 九色国产91popny在线| www.999成人在线观看| 丁香六月欧美| 极品教师在线免费播放| 天天一区二区日本电影三级| 一级片免费观看大全| 精品国产亚洲在线| 国产熟女午夜一区二区三区| 精品电影一区二区在线| 国产亚洲欧美98| 国产不卡一卡二| 黄色丝袜av网址大全| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产av麻豆久久久久久久| 一个人免费在线观看电影 | 丝袜美腿诱惑在线| 99国产精品99久久久久| 一个人免费在线观看的高清视频| 香蕉久久夜色| 天天添夜夜摸| 国产免费男女视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲av片天天在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 中文字幕av在线有码专区| 精品久久久久久久毛片微露脸| 午夜日韩欧美国产| 国产伦人伦偷精品视频| 国产乱人伦免费视频| 久久九九热精品免费| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲欧美激情综合另类| 国产成人系列免费观看| 国产精品永久免费网站| 一二三四社区在线视频社区8| 中文字幕av在线有码专区| 国产亚洲精品久久久久5区| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 午夜精品久久久久久毛片777| 午夜福利在线在线| 老司机福利观看| 亚洲激情在线av| 一级毛片精品| 天天添夜夜摸| 曰老女人黄片| 欧美成狂野欧美在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看 | 欧美又色又爽又黄视频| 校园春色视频在线观看| 国产精品,欧美在线| 成人精品一区二区免费| 制服丝袜大香蕉在线| 国产精品一区二区精品视频观看| 夜夜爽天天搞| 欧美一级毛片孕妇| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产成人av激情在线播放| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 好男人在线观看高清免费视频| 欧美又色又爽又黄视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 美女午夜性视频免费| 午夜久久久久精精品| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 亚洲欧美日韩东京热| tocl精华| 亚洲美女黄片视频| 精品第一国产精品| 精品久久久久久久毛片微露脸|