c-fos基因在麻醉藥麻醉機理研究中的應用

■文/貴州大學動物科學學院 劉金平

c-fos基因在麻醉藥麻醉機理研究中的應用

■文/貴州大學動物科學學院 劉金平

c-fos基因是一種存在于正常神經(jīng)核內(nèi)的原癌基因，具有高度保守性。c-fos基因當機體受到外界刺激時，c-fos基因便迅速表達，通過轉錄和翻譯等一系列過程形成Fos蛋白。麻醉藥的使用會影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)中c-fos基因的表達，可以根據(jù)c-fos基因的轉錄和翻譯情況從基因和蛋白質(zhì)的水平研究麻醉藥的麻醉機理，這為麻醉藥的研究提供了一個思路。

c-fos基因；Fos蛋白；獸用麻醉藥

C-fos基因的研究可以追溯到20世紀80年代中后期，它是FBJ和FBR小鼠肉瘤病毒(MSVs)中病毒癌基因v-fos細胞同源序列。通過基因比對發(fā)現(xiàn)，人與小鼠的相同序列高達94%，非常保守。人的c-fos基因位于14q16～31，是一個包含4個外顯子和3個內(nèi)含子的DNA片段，其長度為9kb[1,2]。在受到外界刺激時，c-fos基因可轉錄為mRNA c-fos，進一步翻譯為Fos蛋白。根據(jù)c-fos基因的特點建立了c-fos技術，就是利用機體受到刺激時c-fos基因表達量迅速增加和產(chǎn)物Fos蛋白堆積于細胞核內(nèi)的特點，采用原位雜交、免疫組化和蛋白印跡等方法來研究神經(jīng)元功能的技術。

隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，獸用麻醉藥使用逐漸普遍。獸醫(yī)臨床手術中的應用最為常見，其能夠減少動物在治療過程中的痛苦，同時使動物處于安靜狀態(tài)，方便醫(yī)務人員進行治療[3]；麻醉藥為野生動物體格檢查和日常管理提供方便[4]；近年來，麻醉藥應用于魚類?；钸\輸中，在長距離長時間運輸過程中，外界的應激會導致肉質(zhì)損傷[5]，甚至出現(xiàn)魚類的死亡，合理地使用麻醉藥可以降低魚類的應激，減少魚類的死亡率，MS-222(3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸鹽)已被美國國家食品及藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準為漁用麻醉劑[6]，丁香酚作為一種麻醉劑，因具有價格低廉、對人體健康無害、休藥期短、不會誘發(fā)機體產(chǎn)生突變物質(zhì)等優(yōu)點也被廣泛應用在魚類的運輸中[7]。

麻醉藥的使用帶來諸多好處，掌握麻醉藥在機體內(nèi)的作用機理是麻醉藥臨床使用的前提，這可以為臨床使用中出現(xiàn)意外提供合理解決方案。近年來，對獸用麻醉藥作用機理的研究主要分為動物行為水平的研究、基因水平的研究、蛋白水平的研究等，本文就麻醉藥使用后c-fos基因的表達情況進行探討和分析。

1 c-fos基因

原癌基因家族中，有一類基因能夠接收第二信使的信號，使細胞外刺激信號轉化為調(diào)節(jié)細胞核內(nèi)基因表達的信號，進行核內(nèi)蛋白的編碼，調(diào)節(jié)下游基因的表達，從而影響細胞結構、功能的改變，這類基因被稱為“即刻早期基因”(immediate early gene，EG)，是目前較為理想的腦功能活動的定位標記[8]。這類基因在正常生理情況下表達量很少，但當機體受到外界刺激時能迅速表達、堆積形成蛋白，可以通過原位雜交或免疫組化等技術來進行研究。目前已發(fā)現(xiàn)的EG有十幾種，按它們的結構和功能特征大致分為c-fos家族、c-jun家族、c-myc家族和egr家族[9]。目前研究比較多的是c-fos基因和c-jun基因。

c-fos基因普遍存在動物體內(nèi)各組織器官中，且中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布最為廣泛，參與腦各種活動的信號轉導和調(diào)控過程[10]。具體的調(diào)節(jié)機制如下：第一類，Ca2+-鈣調(diào)蛋白介導的信號轉導途徑、cAMP依賴性蛋白激酶(PKA)磷酸化激活途徑、甘油二酯依賴的蛋白激酶C(PKC)途徑[11]；第二類，興奮性氨基酸(EAA)受體和G-蛋白偶聯(lián)受體(速激肽、腎上腺素能和α-MSH受體)誘導途徑[12]；第三類，N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體激活途徑[13]；第四類，絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)途徑[14]。

2 Fos蛋白

Fos蛋白是c-fos基因轉錄、翻譯的產(chǎn)物。機體受到外界刺激時，c-fos基因被迅速激活轉錄形成c-fos mRNA，可在刺激30～45min達高峰期，12min為半衰期，編碼形成由380個氨基酸組成的核內(nèi)蛋白Fos，F(xiàn)os蛋白可在刺激20～90min檢測出來，60～90min達高峰期，持續(xù)時間為2～5h，半衰期為2h[15]。形成的FOS蛋白經(jīng)過一系列過程完成細胞核內(nèi)信號的轉導，因此被稱為核內(nèi)“第三信使”[16]。

中樞Fos蛋白具有多種功能，常被用作神經(jīng)元激活的標志。①FOS蛋白參與機體細胞的正常分化、生長以及中樞的學習、記憶等過程；②藥物研究方面，目前已經(jīng)有研究表明FOS蛋白的表達可以用于偏頭痛、麻醉等種類藥物的篩選、用藥后的藥效評價和疾病發(fā)病機理研究模型的建立；③在臨床上，通常作為提示腦部受傷時間的參考指標，當腦部受傷時，根據(jù)FOS蛋白堆積的數(shù)量可以判斷受傷時間；④FOS蛋白的表達還是細胞終末分化的標志及發(fā)生死亡的先兆[17]?？偟膩碚f，F(xiàn)os蛋白的表達可以用于各個方面的研究，為科研工作者在蛋白水平的研究提供了一個思路。

3 麻醉藥作用機理的研究概況

全麻藥的作用機理有很多種說法，比較多的是“脂質(zhì)學說”、“蛋白質(zhì)學說”、“突觸學說”等。近來的研究表明，全麻藥的作用機理是多機制、多效應、多部位和多靶點的共同作用[18]，藥物進入機體選擇性的作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不同部位或神經(jīng)通路，主要的作用靶點包括受體、離子通道、酶等[19]，研究較多的NMDA受體[20]、神經(jīng)煙堿受體[21]、GABA A受體[22～25]等，中樞神經(jīng)系統(tǒng)cAMP信號轉導通路、中樞神經(jīng)系統(tǒng)NO-cGMP信號轉導通路等，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶等。而對于局麻藥和靜脈麻醉藥的作用機理還不太清楚，有待進一步研究。

4 c-fos基因在麻醉藥作用機理中的研究概況

在麻醉藥作用機理的研究中，c-fos基因已有較多報道。楊軍等[26]在異丙酚麻醉大鼠實驗中，運用反轉錄-聚合酶聯(lián)反應(RT-PCR)和蛋白印跡技術(Western Blot)分析異丙酚對大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)海馬各區(qū)c-fos、c-jun基因及蛋白表達的影響中發(fā)現(xiàn)，注射異丙酚后，大鼠的海馬CA1區(qū)和DG區(qū)c-fos、c-jun基因和蛋白的表達水平顯著升高，且隨著異丙酚濃度的增加其升高趨勢越明顯，而海馬CA3區(qū)未發(fā)現(xiàn)異丙酚對c-fos、c-jun基因和蛋白表達水平的影響，最終得出異丙酚可能通過影響c-fos、c-jun基因的轉錄和翻譯，從而抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用實現(xiàn)麻醉功能，且此作用部位具有顯著差異性。李小波[27]研究表明，小型豬復合麻醉劑及塞拉嗪對大鼠的大腦皮層、丘腦、腦干、小腦、海馬5個腦區(qū)c-fos mRNA的表達有上調(diào)作用，從而推斷5個腦區(qū)可能是麻醉藥的作用部位，誘導c-fos mRNA的表達可能是小型豬復合麻醉劑及賽拉嗪的作用機制之一。孫凱[15]通過給大鼠腹腔注射不同劑量異丙酚發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)不同腦區(qū)Fos蛋白的表達發(fā)生變化，呈現(xiàn)劑量依賴性，推測異丙酚的麻醉作用可能與Fos蛋白有關，具體有待進一步研究。尹柏雙等[29]給大鼠腹腔注射小型豬特異性麻醉劑(XFM)的拮抗劑阿替美唑，研究阿替美唑對大鼠催醒與c-fos基因的關系得出結論，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的c-fos基因參與XFM麻醉作用，拮抗劑阿替美唑誘導大腦皮層Fos蛋白的表達，可能是阿替美唑催醒XFM麻醉大鼠的重要機理之一。

5 c-fos基因在麻醉藥作用機理中的研究展望

c-fos基因可以作為臨床藥物研究的觀察指標，同時提供了藥物研究的一些新思路。不管麻醉藥的作用對c-fos基因的表達是抑制作用還是促進作用，都可以從兩個不同的層面去思考麻醉機理。一是從c-fos mRNA方面，提取總mRNA，通過逆轉錄得到cDNA，運用RT-PCR得到擴增曲線和溶解曲線，比較麻醉前后c-fos mRNA的表達量，找出麻醉藥對c-fos mRNA表達起抑制還是表達作用，再討論麻醉藥的作用機理。二是從Fos蛋白方面。目前這方面的研究已有報道，一些麻醉藥使用后會促進Fos蛋白的形成，這時可以直接利用免疫組化或原位雜交技術確定Fos蛋白的表達量，也有一些麻醉藥會抑制Fos蛋白的表達，這時可以借助外界刺激使Fos蛋白表達增加，一定時間后使用麻醉藥，用上述的方法看麻醉藥對Fos蛋白的抑制作用，分析麻醉藥的作用機理。

根據(jù)上述兩個方面的研究，麻醉藥的作用機理存在兩種可能性。①可能直接影響c-fos基因的表達，而如何影響c-fos基因的表達，c-fos又是如何發(fā)揮麻醉鎮(zhèn)痛作用，這將是以后麻醉藥作用機理研究的一個方向。②可能作用于某一受體，然后影響c-fos基因的表達，這時可以利用受體的激動劑或拮抗劑控制麻醉藥的作用，觀察c-fos基因的表達情況，當使用某一受體的激動劑或拮抗劑，c-fos基因的表達量發(fā)生變化時，就可以推測該麻醉藥可能是作用于這一受體，具體如何作用還需進一步探討。

6 結語

c-fos基因在獸用麻醉藥麻醉過程中發(fā)揮重要作用，但c-fos基因如何參與麻醉過程、麻醉藥物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)c-fos基因表達影響的具體機理等報道較少，沒有形成系統(tǒng)的、清晰的思路，因此從c-fos基因方面研究獸用麻醉藥的作用機理具有重要意義。明確麻醉藥的具體作用機理，是研發(fā)一種新型麻醉藥的必需過程，同時為尋找麻醉藥合適的激動劑和拮抗劑提供幫助，激動劑和拮抗劑的使用可以更好地控制藥物效果和作用時間長短；預防麻醉藥使用過程中遇到的突發(fā)狀況，提前制定合理方案。■

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