異源表達(dá)細(xì)菌β-甘露聚糖酶研究進(jìn)展

那 金，王 瑤，郭尚旭，趙 丹

（1黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080；2黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱150500）

異源表達(dá)細(xì)菌β-甘露聚糖酶研究進(jìn)展

那 金1,2，王 瑤1,2，郭尚旭1,2，趙 丹1,2

（1黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080；2黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱150500）

甘露聚糖酶是一類水解甘露聚糖的關(guān)鍵酶，廣泛存在于動植物和微生物中，細(xì)菌來源尤為廣泛。為了更好地滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求，異源表達(dá)細(xì)菌來源的甘露聚糖酶基因，以獲得性質(zhì)優(yōu)良的甘露聚糖酶。對甘露聚糖酶的來源和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了概述，歸納了細(xì)菌甘露聚糖酶的異源表達(dá)在提高酶活、擴(kuò)大pH值作用范圍、改善安全性等方面的作用，包括對埃希氏大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及畢赤酵母進(jìn)行異源表達(dá)等。利用微生物資源拓寬甘露聚糖酶的應(yīng)用領(lǐng)域，使用微生物技術(shù)提高產(chǎn)酶量滿足工業(yè)需求，并為甘露聚糖酶定向進(jìn)化和改造奠定基礎(chǔ)。

細(xì)菌；甘露聚糖酶；分子生物學(xué)；異源表達(dá)；應(yīng)用

0 引言

甘露聚糖是一類自然界中儲量非常豐富的半纖維素多糖[1]，在造紙、紡織、化妝品等行業(yè)都有應(yīng)用[2]。甘露聚糖粘度高、水解困難，難以被動物和人體直接利用[3]。β-甘露聚糖酶(EC3.2.1.78，β-mannanse，以下簡稱甘露聚糖酶)是能夠隨機(jī)水解任意β-1,4-糖苷鍵的內(nèi)切水解酶[4]，廣泛存在于植物、動物和微生物中[5]。許多已發(fā)芽的植物種子如蘆筍、魔芋以及番茄果實(shí)和種子中都含有甘露聚糖酶[6]。動物源的種類較少，且大多數(shù)屬于軟體動物，如皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)、濱螺(Littorina brevicula)、貽貝(Mytilus Edulis)等[7]。相比而言，微生物來源的甘露聚糖酶具有活性高、成本低、提取方便以及作用條件寬泛等特點(diǎn)，已在工業(yè)生產(chǎn)和理論研究中得到了廣泛應(yīng)用，如飼料、食品、醫(yī)藥、石油開采以及尚未開發(fā)的生物能源等領(lǐng)域[8]。

微生物發(fā)酵產(chǎn)甘露聚糖酶往往受初始酶活低，菌株生物安全性無保障等限制，難以大規(guī)模工廠化生產(chǎn)。隨著基因和蛋白質(zhì)工程技術(shù)的廣泛運(yùn)用，甘露聚糖酶的研究開始轉(zhuǎn)向產(chǎn)酶基因的克隆和異源表達(dá)等方面。國內(nèi)外對異源甘露聚糖酶表達(dá)的研究主要集中在從環(huán)境中對產(chǎn)酶菌株進(jìn)行誘變選育[9]，并將不同微生物的甘露聚糖酶基因克隆在埃希氏大腸桿菌(Escherichia coli)[10-11]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[12]及畢赤酵母(Pichia pastoris)[13]等不同微生物中表達(dá)。本研究將對細(xì)菌甘露聚糖酶的來源、性質(zhì)、異源表達(dá)等方面的研究進(jìn)行綜述。

1 甘露聚糖酶來源及酶學(xué)性質(zhì)

1.1 來源

甘露聚糖酶作為一類重要的半纖維素酶(Hemicellulase)，植物種子、動物以及各種微生物中都有存在[14-15]，其中甘露聚糖酶的微生物源種類最為豐富。初步統(tǒng)計已發(fā)現(xiàn)100余種產(chǎn)酶微生物，包括細(xì)菌、真菌和放線菌等[16-17]。其中真菌主要是酵母菌(Saccharomycetessp.)、青霉菌(Penicilliumsp.)、曲霉菌(Aspergillussp.)和木霉菌屬(Trichodermasp.)等，而放線菌以鏈霉菌(Streptomycetesp.)為主[14]。細(xì)菌中研究較多的是弧菌(Vibriosp.)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)等，研究最多的是Bacillussp.，如嗜堿芽胞桿菌(B.alkalophilic)，地衣芽胞桿菌(B.licheniformis)等[18]。大多數(shù)細(xì)菌來源的甘露聚糖酶都是胞外酶，酶活力高，更容易提取[19]，已然成為國內(nèi)外眾多研究者的主要研究對象。

1.2 最適反應(yīng)pH值和溫度

不同微生物所產(chǎn)的甘露聚糖酶的分子質(zhì)量、最適反應(yīng)pH值、最適反應(yīng)溫度、酶動力學(xué)常數(shù)、底物專一性等都有一定的差異。甘露聚糖酶的分子質(zhì)量小的只有22 kDa，大的可以達(dá)到162 kDa，相差十分懸殊，但大部分集中在30～55 kDa之間[20]。不同微生物來源的甘露聚糖酶作用pH值和溫度也不盡相同，真菌來源的甘露聚糖酶的作用范圍偏酸，一般在pH 4.0～5.5之間，最適反應(yīng)溫度一般在55℃～75℃。Katrolia等[21]對來自Chaetomiumsp.的甘露聚糖酶進(jìn)行研究，結(jié)果表明，該酶的最適pH 5.0，最適反應(yīng)溫度為65℃。

細(xì)菌甘露聚糖酶中研究最多的是Bacillussp.，除B.alkalophilic高至pH 9.0以上之外，最適反應(yīng)大多在pH 5.5～7.0。最適反應(yīng)溫度一般為45℃～70℃。李云程等[22]研究的Bacillussp.B555，最適反應(yīng)pH 7.0，最適反應(yīng)溫度為50℃～55℃。Sudip等[23]從傳統(tǒng)韓國食品泡菜分離和鑒定一株產(chǎn)甘露聚糖酶的Bacillussp.CSB39，最適反應(yīng)pH 7.5，最適反應(yīng)溫度為70℃。與真菌來源的甘露聚糖酶相比，細(xì)菌來源的甘露聚糖酶最適作用pH值可以由弱酸到堿性，作用溫度范圍更加寬泛，甘露聚糖酶的性質(zhì)更多元化，應(yīng)用范疇更廣泛。

2 甘露聚糖酶基因的異源表達(dá)

2.1 異源表達(dá)的意義

大多數(shù)野生型菌株來源的甘露聚糖酶自身穩(wěn)定性和催化活性較差、底物親和力弱、Km值高，且產(chǎn)酶菌株生物安全性無保障，工業(yè)化應(yīng)用具有一定的局限性[24]。異源表達(dá)的意義在于克服以上限制，從而獲得作用寬泛，生產(chǎn)成本低，安全性高的甘露聚糖酶[25]。

Gyeong等[26]的研究表明，異源甘露聚糖酶與野生型甘露聚糖酶性質(zhì)基本一致，包括最適pH值和溫度、熱穩(wěn)定性和動力學(xué)參數(shù)。異源表達(dá)還可以擴(kuò)大甘露聚糖酶的pH值作用范圍。Zang等[27]研究的在E.coli中異源重組甘露聚糖酶的最佳約在pH 6.5，并且在pH 5～11的范圍穩(wěn)定。

馬鑫等[28]研究在E.coliBL21中表達(dá)的重組酶在25～95℃，在pH 3.0～9.6范圍內(nèi)均具有酶活性，在pH 3.0的酸性環(huán)境中依然具有1234 U/mg的比活力和寬泛的作用溫度區(qū)間，并且在酸性環(huán)境還擁有較高活力，可以應(yīng)用于生產(chǎn)作用于動物胃中的飼料和藥品工業(yè)中。隨著甘露聚糖酶研究的推進(jìn)，關(guān)于異源表達(dá)甘露聚糖酶的研究日新月異，重組甘露聚糖酶的作用條件的范圍也更加廣泛。

2.2 甘露聚糖酶異源表達(dá)系統(tǒng)

2.2.1 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) 在過去十年中，E.coli已經(jīng)成功地用作安全菌株(generally regarded as safe，GRAS)[29]。陸續(xù)有一些細(xì)菌來源的甘露聚糖酶基因在E.coli系統(tǒng)中過表達(dá)，并獲得較高的酶活力。Kim等[30]克隆Cellulosimicrobiumsp.的甘露聚糖酶基因(1272 bp)并在E.coli中表達(dá)，在50℃和pH 6.0條件下對甘露聚糖表現(xiàn)出較高的催化活性。成莉鳳等[31]從歐文氏桿菌(Erwinia carotovora)中克隆甘露聚糖酶基因，轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)中，重組甘露聚糖酶活性高達(dá)645.5 U/mL，是出發(fā)菌株的1.97倍。

Liu等[32]將B.subtilisYH12甘露聚糖酶基因在E.coliJM109中表達(dá)，在55℃和pH 6.5的條件下表現(xiàn)出很高的催化活性。唐嘉婕等[33]從短小芽孢桿菌(B.pumilus)Nsic-2中克隆得到甘露聚糖酶基因(manB)，在E.coliBL21(DE3)中成功地表達(dá)，得到甘露聚糖酶最高酶活為11021.3 U/mL。與原始菌株相比，重組甘露聚糖酶不僅酶活力高，并且在pH 6.0～9.0之間酶活相對穩(wěn)定，堿性條件下也表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性，因此其在工業(yè)應(yīng)用中具備較高的潛在應(yīng)用價值。Gaurav等[34]將來自Bacillussp.的manb-1601基因在E.coliBL21(DE3)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，使得重組甘露聚糖酶(ManB-1601)的生產(chǎn)量提高2.73倍，大大提高了產(chǎn)量。與野生型菌株產(chǎn)酶相比，E.coli具有更好的表達(dá)、完善的遺傳構(gòu)成和快速生長的能力，而成為細(xì)菌異源表達(dá)甘露聚糖酶最常用的宿主。

2.2.2 枯草芽胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)B.subtilis作為外源表達(dá)的宿主菌已經(jīng)廣泛地應(yīng)用到基因的克隆及過量表達(dá)過程中。Xu等[29]將來自B.subtilisB10-02甘露聚糖酶gmuG基因在B.subtilis亞種中過表達(dá)，原始菌株在酸性條件下穩(wěn)定性不佳。重組酶不僅在pH 6.5～8.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定，還使得純化的重組甘露聚糖酶在pH 7.0下具有3207.82 U/mL的較大活性。由此可見，異源表達(dá)不但增加了甘露聚糖酶的酸穩(wěn)定性，而且體現(xiàn)出較高的酶活力，改良和完善甘露聚糖酶在動物飼料工業(yè)中的適用性。

劉項(xiàng)羽等[35]從B.subtilisJNA3-10中克隆出含信號肽的manA2基因，在B.subtilis168中克隆表達(dá)。重組菌株的酶活力(235.94 U/mL)是原始菌株(17.96 U/mL)的13.1倍，在65℃和pH 6.5條件下具有較高的活性。B.subtilisJNA 3-10通過異源表達(dá)提高了甘露聚糖酶的分泌，使重組菌株有潛力作為飼用甘露聚糖酶出發(fā)菌株，為工業(yè)化酶的應(yīng)用提供了新的資源與選擇。

2.2.3 其他表達(dá)系統(tǒng) 作為乳酸菌(Lactic Acid Bacteria，LAB)的一員，干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)是公認(rèn)的安全菌株。通過食品級表達(dá)載體重組表達(dá)的酶無需純化，可用于飼料添加劑等食品級用途，對保持人體健康也有一定的有益作用[36]。Lin等[37]自B.pumilus中克隆manB基因在L.casei中表達(dá)。鄒業(yè)霞等[38]從B.pumilus中克隆manB基因的成熟肽編碼序列，將該基因克隆到L.casei中。重組甘露聚糖酶酶活可達(dá)23 U/mg，實(shí)現(xiàn)了Bacillussp.甘露聚糖酶基因在L.casei中的成功表達(dá)，對開拓LAB甘露聚糖酶的應(yīng)用前景意義重大。

2.2.4 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng) 不僅細(xì)菌重組可以獲得好的效果，真菌也可以作為異源表達(dá)的工程菌株。已有Bacillussp.、Penicilliumsp.、Aspergillussp.等不同微生物來源的manB基因在P.pastoris中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。Junnan等[39]將B.subtilisMAFIC-S11的甘露聚糖酶基因(1029 bp)在P.pastoris中克隆和表達(dá)，重組酶表達(dá)水平提高了2倍，比活力較高為3706 U/mg。Li等[40]通過PCR克隆將來自B.subtilisBS5的甘露聚糖酶基因整合到P.pastorisGS115的基因組中。重組甘露聚糖酶的最適溫度和pH值分別為50℃和pH 6.0，獲得的純化酶的特異性活性很高為7978 U/mg。實(shí)現(xiàn)了重組甘露聚糖酶的高活性表達(dá)，在酶活性、穩(wěn)定性等方面表現(xiàn)出獨(dú)特的性質(zhì)，將進(jìn)一步適應(yīng)實(shí)際生產(chǎn)的需要。

3 展望

甘露聚糖的應(yīng)用范圍非常廣泛，有很好的應(yīng)用前景。目前，很多實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的生產(chǎn)甘露聚糖酶的過程中控制和優(yōu)化技術(shù)已經(jīng)取得了較好的成果，但放大到工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)上卻受到種種限制。為了使甘露聚糖酶更好地服務(wù)于人們的生產(chǎn)生活，在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上，應(yīng)該繼續(xù)推進(jìn)甘露聚糖酶的研究：（1）利用微生物資源生產(chǎn)能廣泛用于不同領(lǐng)域的甘露聚糖酶，如將耐高溫甘露聚糖酶應(yīng)用到石油工業(yè)中；在造紙工業(yè)中應(yīng)用作用pH值范圍寬泛的甘露聚糖酶，以及將更加安全來源的酶應(yīng)用到食品和醫(yī)療中。（2）通過提高菌種產(chǎn)酶水平、酶比活率、酶耐熱性，改善產(chǎn)酶發(fā)酵工藝，開發(fā)出具有活性高、耐高溫、滿足更多要求的甘露聚糖酶，將其更好地應(yīng)用于工業(yè)及畜牧業(yè)的實(shí)際生產(chǎn)中。（3）此外，應(yīng)用研究不能僅滿足于實(shí)驗(yàn)室研究階段，充分利用分子生物學(xué)手段，不斷構(gòu)建外源高表達(dá)體系。加深對甘露聚糖酶基因結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識，為其定向進(jìn)化和改造奠定理論基礎(chǔ)。因此，異源表達(dá)在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用將是未來甘露聚糖酶工藝優(yōu)化的重要發(fā)展方向。相信隨著研究的不斷深入，異源表達(dá)的甘露聚糖酶在食品和飼料工業(yè)以及在紙和木漿漂白等工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用將越來越廣泛。

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Heterologous Expression Bacterialβ-mannanase:Research Progress

Na Jin1,2,Wang Yao1,2,Guo Shangxu1,2,Zhao Dan1,2
(1Key Laboratory of Microbiology,Life Science College,Heilongjiang University,Harbin 150080,Heilongjiang,China;2Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology,Ministry of Education,Heilongjiang University,Harbin 150500,Heilongjiang,China)

Mannanase is a key enzyme for hydrolyzing mannan,and is widely found in plants,animals and microorganisms,particularly in bacteria.In order to meet the needs of industrial production,heterologous expression of bacterial-derived mannanase gene is studied in order to obtain high-quality mannanase.In this paper,the origin and enzymatic properties of mannanase were reviewed,and the heterologous expression of bacterial mannanase was summarized concerning the aspects of improving the enzyme activity,expanding the pH range and improving the safety,including heterologous expression ofEscherichia coli,Bacillus subtilis and Pichia pastoris.The use of microbial resources can broaden the application of mannanase,and the use of microbial technology can improve the amount of enzyme production to meet industrial needs,these lay a foundation for the determinate evolution and transformation of mannanase.

Bacteria;β-mannanase;Molecular Biology;Heterologous Expression;Application

TS2，C39

A論文編號：cjas17040011

哈爾濱市科技局青年后備人才項(xiàng)目“功能性乳酸菌發(fā)酵酸菜生態(tài)學(xué)過程研究”(2014RFQXJ101)；黑龍江省政府博士后項(xiàng)目“疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)NF-05漆酶的產(chǎn)生、特性及應(yīng)用研究”(LBH-Z15214)。

那金，女，1994年出生，黑龍江哈爾濱人，碩士，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)。通信地址：150080黑龍江省哈爾濱市南崗區(qū)學(xué)府路74號黑龍江大學(xué)224信箱，Tel：0451-86609134，E-mail：najin8023@163.com。

趙丹，女，1980年出生，黑龍江齊齊哈爾人，副教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)。通信地址：150080黑龍江省哈爾濱市南崗區(qū)學(xué)府路74號黑龍江大學(xué)224信箱，Tel：0451-86609134，E-mail：zhaodan4u@163.com。

2017-04-11，

2017-06-08。