石蒜堿通過ERK信號(hào)通路誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡及自噬

張淑靜，馬俊英，楊丹丹

漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，漯河 462002

胃癌(GC)是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，是第四大最常見癌癥和第二大腫瘤死亡主要原因。由于胃癌非典型癥狀和其他原因，導(dǎo)致對(duì)早期的篩查關(guān)注不足，大多數(shù)患者確診時(shí)病情已經(jīng)進(jìn)入中晚期或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。目前化學(xué)療法在延長患者的生存時(shí)間和改善生活質(zhì)量方面起著重要作用[1]，然而，各種化學(xué)治療劑并不能有效地使所有腫瘤細(xì)胞最小化，這也預(yù)示預(yù)后不良。因此，迫切需要尋求新穎的具有較高療效、較少副作用的藥物，可更好的改善胃癌患者預(yù)后。

自噬是一種高度保守的自降解現(xiàn)象，廣泛存在于真核細(xì)胞中，可維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和蛋白質(zhì)再利用。細(xì)胞自消化會(huì)降解其自身在生理和病理?xiàng)l件下變異的和功能失調(diào)的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器[2]，并通過去除錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)、受損的細(xì)胞器進(jìn)行質(zhì)量控制，從而抑制異常突變和癌癥，可以減少癌細(xì)胞的不穩(wěn)定性和損傷，從而防止腫瘤的發(fā)生[3]。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，是絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)家族的一員，包括ERK1和ERK2，MAPK參與介導(dǎo)細(xì)胞存活，而ERK磷酸化在細(xì)胞增殖和死亡中的作用是有爭議的。據(jù)報(bào)道，ERK的磷酸化增加導(dǎo)致更多的細(xì)胞存活[4]，而其他研究表明，ERK的活化可能導(dǎo)致DNA損傷并促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。目前，ERK已顯示在自噬調(diào)節(jié)中起重要作用[5]，但是，尚未確定ERK在自噬啟動(dòng)或成熟中的確切作用。越來越多的證據(jù)表明，通過溶酶體功能破壞引起的自噬受損可能是由ERK激活引起的，從而增加細(xì)胞死亡[6]。

石蒜堿(lycorine)是從石蒜鱗莖中提取的一種異喹啉類生物堿，具有抗炎、抗病毒、抗瘧疾、保護(hù)心血管以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用，對(duì)癌細(xì)胞具有直接殺傷作用，且毒性較低[7]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，石蒜堿在體外可以抑制HepG-2細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其自噬，但對(duì)胃癌的研究較少[8]。本研究重點(diǎn)分析石蒜堿對(duì)胃癌增殖、凋亡及自噬的影響，并分析其機(jī)制，為胃癌的研究以及石蒜堿的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人胃癌SGC-7901細(xì)胞株購自南京科佰生物科技有限公司(編號(hào)CBP60500)。

1.2 藥物及試劑

石蒜堿(成都曼思特生物科技有限公司，HPLC≧98%)，采用含有0.1% DMSO的DMEM配置成不同濃度；CCK-8(南京建成生物研究所)；Hoechst 33258(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(美國BD公司)；3-甲基腺嘌呤(3-MA)自噬抑制劑、MDC 染液(美國Sigma公司)；兔抗人caspase-3(激活性)、Bcl-2、Bax、Beclin-1、LC3 II、p-ERK2抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；兔抗人Atg-3、Atg-7抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(美國，Abcam公司)。

1.3 儀器

CKX41-C31B倒置熒光顯微鏡(奧林巴斯(中國)有限公司)；MK3酶標(biāo)儀(賽默飛)。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)

胃癌SGC-7901采用含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM高葡萄糖培養(yǎng)基，并在37 ℃，5%CO2和95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將細(xì)胞進(jìn)行3代傳代，然后用于實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 CCK-8法檢測細(xì)胞活力

消化，離心并重懸對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL接種在96孔板(100 μL/孔)中，細(xì)胞貼壁后吸出培養(yǎng)基，加入含有不同濃度的石蒜堿(0.31、0.63、1.25、2.5、5、10、20 μM)的新鮮完全培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。另設(shè)細(xì)胞對(duì)照組(除不加藥物外，余處理同給藥組)和空白對(duì)照組(除不加DMSO、藥物及細(xì)胞，余處理同給藥組)孵育24、48和72 h后，避光加入10 μL CCK-8試劑，于培養(yǎng)箱中孵育1 h，采用酶標(biāo)儀于波長490 nm下檢測OD值，計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞增殖抑制率=(細(xì)胞對(duì)照組OD值-給藥組OD值)/(細(xì)胞對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值)×100%。

1.4.3 Hoechst 33258染色

調(diào)整對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞濃度，以5×105個(gè)/mL接種在6孔板中，每孔加入2 mL培養(yǎng)基。 細(xì)胞貼壁后，吸出培養(yǎng)基，并加入含有不同濃度的石蒜堿的(1.25、2.5、5 μM)的新鮮培養(yǎng)基，對(duì)照組加入2 mL含0.1%DMSO的培養(yǎng)基，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需的時(shí)間培養(yǎng)24 h。然后，棄去培養(yǎng)基，將處理的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌3次，在室溫下于Hoechst 33258孵育液孵育10 min，PBS緩沖液洗滌。熒光顯微鏡觀察細(xì)胞并照相。

1.4.4 流式細(xì)胞儀檢測胃癌SGC-7901凋亡

調(diào)整對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞濃度，以5×105個(gè)/mL接種在6孔板中，每孔加入2 mL培養(yǎng)基。細(xì)胞貼壁后，吸出培養(yǎng)基，并加入含有不同濃度的石蒜堿(1.25、2.5、5 μM)的新鮮培養(yǎng)基，對(duì)照組加入2 mL含0.1%DMSO的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)基，以1 500 rpm離心3 min，收集細(xì)胞。按照Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明處理細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.4.5 Western blot法

調(diào)整對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞濃度，以5×105個(gè)/mL接種在6孔板中，每孔加入2 mL培養(yǎng)基。細(xì)胞貼壁后，吸出培養(yǎng)基，加入不同濃度的石蒜堿(1.25、2.5、5 μM)，另外設(shè)置不給藥的對(duì)照組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，處理24 h，RIPA裂解緩沖液裂解SGC-7901細(xì)胞，BCA比色測定法測定細(xì)胞裂解液中蛋白質(zhì)含量，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上，用5%脫脂奶封閉2 h，加入抗Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3和β-actin的一抗，于4 ℃孵育過夜。將膜與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗(1∶1 000)孵育50 min。通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測印跡中的陽性條帶，以β-actin為內(nèi)參分析各蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.4.6 MDC染色法檢測人胃癌SGC-7901自噬泡的形成

將SGC-7901細(xì)胞接種于24孔板，細(xì)胞貼壁后，吸出培養(yǎng)基，給藥組加入不同濃度的石蒜堿(1.25、2.5、5 μM)，對(duì)照組加入等體積含0.1% DMSO的培養(yǎng)基，處理24 h，然后采用MDC(50 μM)孵育10 min。通過熒光顯微鏡(激發(fā)355 nm，阻斷濾光片波長512 nm)觀察拍照。Western blot法檢測Beclin-1、LC3 II、Atg-3、Atg-7、p-ERK2蛋白表達(dá)。

1.4.7 3-MA對(duì)石蒜堿誘導(dǎo)胃癌SGC-7901自噬的影響

實(shí)驗(yàn)分為4組，對(duì)照組(含0.1%DMSO的培養(yǎng)基)、石蒜堿組(5 μM)、3-MA(5 μM)組、石蒜堿組(5 μM)+3-MA(5 μM)組，處理24 h后，CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡；Western blot法檢測cleaved caspase-3、LC3 II、p-ERK2蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，抑制率比較采用重復(fù)測量方差分析，其余采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 石蒜堿對(duì)SGC-7901增殖的抑制作用

采用CCK-8方法測定發(fā)現(xiàn)，石蒜堿對(duì)SGC-7901細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用(F=4.247，P<0.05)，呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性。分組與時(shí)間存在交互作用(F=2.782，P<0.05)。其中處理24 h的IC50為 8.89 μM，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇5、2.5、1.25 μM進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(見圖1)。結(jié)構(gòu)完整，熒光著色比較分布均勻。而石蒜堿處理。

圖1 石蒜堿對(duì)SGC-7901增殖的抑制作用Fig.1 The inhibitory effect of lycorine on the proliferation of SGC-7901 cells

2.2 石蒜堿對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響

圖2顯示，Hoechest 33258 染色后，對(duì)照組細(xì)胞組細(xì)胞產(chǎn)生皺縮、形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核呈致密濃染亮藍(lán)色小點(diǎn)。

圖2 石蒜堿對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響(×200)Fig.2 The effect of lycorine on the apoptotic morphology of SGC-7901 cells (×200)

2.3 石蒜堿對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組比較，1.25、2.5、5 μM石蒜堿能明顯增加SGC-7901細(xì)胞凋亡率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見圖3)。

圖3 石蒜堿對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 The effect of lycorine on SGC-7901 cell apoptosis注：與對(duì)照組比較，**P<0.01。Note:Compared with the control group,**P<0.01.

2.4 石蒜堿對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

與對(duì)照組比較，1.25、2.5、5 μM石蒜堿能降低Bcl-2蛋白水平，增加Bax、cleaved caspase-3蛋白水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖4 石蒜堿對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響Fig.4 The effect of lycorine on apoptosis-related proteins in SGC-7901 cells注：與對(duì)照組比較，**P<0.01。Note:Compared with the control group,**P<0.01.

2.5 石蒜堿對(duì)SGC-7901細(xì)胞自噬泡形成的影響

與對(duì)照組比較，1.25、2.5、5 μM石蒜堿處理SGC-7901細(xì)胞后，細(xì)胞周圍分布大量熒光顆粒。

圖5 石蒜堿對(duì)SGC-7901自噬泡形成的影響Fig.5 The effect of lycorine on the formation of SGC-7901 autophagic vesicles

圖6 石蒜堿對(duì)SGC-7901細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白水平的影響Fig.6 The effect of lycorine on autophagy-related protein levels in SGC-7901 cells注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。Note:Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01.

2.6 石蒜堿對(duì)SGC-7901細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白水平的影響

與對(duì)照組比較，1.25、2.5、5 μM石蒜堿能增加Beclin-1、LC3 II蛋白 水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.7 石蒜堿對(duì)SGC-7901細(xì)胞自噬小體的形成的影響

與對(duì)照組比較，1.25、2.5、5 μM石蒜堿能增加自噬小體相關(guān)蛋白Atg-3、Atg-7水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明石蒜堿可以通過自噬小體的形成誘導(dǎo)自噬。見圖7。

圖7 石蒜堿對(duì)SGC-7901細(xì)胞自噬小體的形成的影響Fig.7 The effect of lycorine on the formation of autophagosomes in SGC-7901 cells注：與對(duì)照組比較，**P<0.01。Note:Compared with the control group,**P<0.01.

2.8 石蒜堿對(duì)SGC-7901細(xì)胞ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

與對(duì)照組比較，1.25、2.5、5 μM石蒜堿能增加p-ERK2蛋白水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖8 石蒜堿對(duì)SGC-7901細(xì)胞ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響Fig.8 The effect of Lycorine on ERK signaling pathway related proteins in SGC-7901 cells注：與對(duì)照組比較，**P<0.01。Note:Compared with the control group,**P<0.01.

2.9 3-MA對(duì)石蒜堿誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞自噬的影響

與對(duì)照組比較，石蒜堿組、3-MA+石蒜堿組細(xì)胞活力明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與石蒜堿組比較，3-MA+石蒜堿組細(xì)胞活力明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組比較，石蒜堿組、3-MA+石蒜堿組細(xì)胞凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與石蒜堿組比較，3-MA+石蒜堿組細(xì)胞凋亡率明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組比較，3-MA+石蒜堿組cleaved caspase-3、LC3II、p-ERK2蛋白水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與石蒜堿組比較，3-MA+石蒜堿組cleaved caspase-3、LC3II、p-ERK2蛋白水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；見圖9。

圖9 3-MA對(duì)石蒜堿誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞自噬的影響Fig.9 The effect of 3-MA on the autophagy induced by lycorine in SGC-7901 cells注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與石蒜堿組比較，#P<0.05，##P<0.01。Note:Compared with the control group,**P<0.01;Compared with the lycorine group,#P<0.05,##P<0.01.

3 討論

抗腫瘤藥物在自然界普遍存在，本課題組的研究已經(jīng)證實(shí)石蒜堿能抑制胃癌SGC-7901的增殖。而國內(nèi)外的研究顯示，石蒜堿能抑制各種腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抗腫瘤機(jī)制是通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和抗增殖來介導(dǎo)[9]。本研究通過CCK-8 法分析了石蒜堿對(duì)SGC-7901增殖的影響，結(jié)果表明石蒜堿能顯著抑制SGC-7901細(xì)胞的增殖。應(yīng)用Hoechst 33258染色和流式細(xì)胞儀顯示石蒜堿能有效的促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞凋亡。Western blot檢測顯示石蒜堿能降低Bcl-2蛋白水平，增加Bax蛋白水平，并通過激活cleaved caspase-3，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這也提示石蒜堿能通過線粒體途徑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。

自噬是高度保守的自降解現(xiàn)象，在真核細(xì)胞中廣泛存在。細(xì)胞通過在生理和病理?xiàng)l件下降解自身的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器來自消化[10]。為了驗(yàn)證石蒜堿對(duì)SGC-7901細(xì)胞自噬的影響，采用MDC 染色法檢測人胃癌SGC-7901自噬泡的形成，發(fā)現(xiàn)石蒜堿干預(yù)24h后，細(xì)胞出現(xiàn)酸性的自噬小泡，Western blot檢測結(jié)果表明Beclin-1、LC3 II等自噬相關(guān)蛋白水平明顯增加，提示石蒜堿能誘導(dǎo)SGC-7901自噬。另外石蒜堿處理SGC-7901后，能顯著增加Atg-7和Atg-3的蛋白水平，這些發(fā)現(xiàn)表明石蒜堿能通過自噬小體的形成誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬。

自噬是通過溶酶體降解細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)蛋白的進(jìn)化保守途徑，在許多疾病中起著重要作用，例如清除功能障礙的線粒體和蛋白聚集體、受損的蛋白和細(xì)胞器。自噬在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞存活方面具有雙重作用，在不同的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中即可以促進(jìn)也可以抑制腫瘤的生長和發(fā)展[11]。本研究顯示，石蒜堿能誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡，也能誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞自噬，那么本研究中的自噬和凋亡存在什么聯(lián)系？本研究后續(xù)的研究顯示，當(dāng)SGC-7901細(xì)胞同時(shí)給予自噬抑制劑3-MA和5 μM石蒜堿時(shí)，與單獨(dú)給予5 μM石蒜堿相比，細(xì)胞活力明顯增加，細(xì)胞凋亡率明顯下降，說明抑制SGC-7901細(xì)胞自噬，可減弱石蒜堿對(duì)SGC-7901細(xì)胞的增殖的抑制和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示石蒜堿可以通過增加胃癌SGC-7901細(xì)胞自噬促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

ERK通路參與多種癌癥類型的發(fā)生、發(fā)展和進(jìn)展，被認(rèn)為是重要的治療靶點(diǎn)，能有效的調(diào)控自噬和細(xì)胞凋亡[12]。本研究證實(shí)，石蒜堿可以誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞自噬，3-MA可以下調(diào)LC3II蛋白水平抑制SGC-7901細(xì)胞自噬，并進(jìn)一步減弱石蒜堿對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制作用和細(xì)胞凋亡的影響。為了驗(yàn)證石蒜堿誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞自噬凋亡的機(jī)制，本研究通過Western blot法檢測了ERK信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白水平，結(jié)果顯示石蒜堿能激活ERK，促進(jìn)其磷酸化，說明石蒜堿是通過ERK信號(hào)通路導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬和凋亡。

總之，石蒜堿能通過調(diào)控ERK信號(hào)通路，誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞自噬以及凋亡，是石蒜堿體外發(fā)揮抑制胃癌細(xì)胞增殖效應(yīng)的重要途徑，并為進(jìn)一步闡釋石蒜堿抗腫瘤分子機(jī)制提供了依據(jù)，同時(shí)也揭示了石蒜堿抗腫瘤的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為石蒜堿的臨床應(yīng)用與轉(zhuǎn)化提供參考。