柱前衍生化高效液相色譜法測(cè)定炎寧糖漿中1－脫氧野尻霉素含量

劉琳琳，蔡艷麗，卞艷晶，李正國(guó)

（山東省濟(jì)寧市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 濟(jì)寧 272025）

柱前衍生化高效液相色譜法測(cè)定炎寧糖漿中1－脫氧野尻霉素含量

劉琳琳，蔡艷麗，卞艷晶，李正國(guó)

（山東省濟(jì)寧市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 濟(jì)寧 272025）

目的建立測(cè)定炎寧糖漿中1－脫氧野尻霉素（DNJ）含量的柱前衍生化高效液相色譜（HPLC）法。方法色譜柱為 Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 m)，流動(dòng)相為乙腈－0.1%醋酸溶液（55∶45），流速為1.0 mL／min，柱溫為 25℃，熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)為254 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為322 nm，進(jìn)樣量為10 L。結(jié)果DNJ質(zhì)量濃度在0.104～52 g／mL范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好（r＝0.999 9），其精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均較好，平均回收率為97.66%，RSD＝1.67%(n＝6）。結(jié)論該方法準(zhǔn)確、可靠，可作為炎寧糖漿中DNJ的含量測(cè)定方法。

炎寧糖漿；1－脫氧野尻霉素；柱前衍生化；高效液相色譜法；含量測(cè)定

炎寧糖漿收載于2015年版《中國(guó)藥典（一部）》，由鹿茸草、白花蛇舌草、鴨跖草3味中藥提取制成，具有清熱解毒、消炎止痢功效，主要用于上呼吸道感染、扁桃體炎、尿路感染、急性菌痢、腸炎等的治療[1]1107－1108。其主要成分鴨跖草為鴨跖草科植物鴨跖草 Commelina communis L.的干燥地上部分，藥性寒，味甘、淡，歸肺、胃、小腸經(jīng)，具有清熱瀉火、解毒、利水消腫功效[1]282。1－脫氧野尻霉素（DNJ）是鴨跖草已知的特征成分之一[2]，為α－糖苷酶抑制劑，具有降血糖功效[3－5]。但制劑標(biāo)準(zhǔn)中除性狀、鑒別項(xiàng)外，僅有總黃酮的含量測(cè)定項(xiàng)，專(zhuān)屬性不強(qiáng)。為此，筆者建立了測(cè)定炎寧糖漿中DNJ含量的柱前衍生化高效液相色譜（HPLC）法，為其質(zhì)量控制提供了依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC－10AD型高效液相色譜儀，RF535型熒光檢測(cè)器（日本島津公司）；N2000型雙通道色譜工作站（浙江大學(xué)智能信息工程研究所）；0.45 μm微孔濾膜（上海興亞凈化材料廠）；BSA124S型分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器＜北京＞有限公司）；超聲清洗機(jī)（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；微量移液器（大龍儀器公司）；HH型恒溫水浴鍋（金壇市中大儀器廠）。

1.2 試藥

1－脫氧野尻霉素對(duì)照品（上海士鋒生物科技有限公司，純度＞98.5%，批號(hào)為20150515）；炎寧糖漿（市售，批號(hào)為 150908，150915，150923）；芴甲氧羰酰氯(FMOC－Cl，美國(guó)Sigma公司）；甘氨酸（美國(guó)查特姆公司，純度＞98%）；乙腈（美國(guó)天地色譜試劑有限公司）為色譜純，純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)），其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈－0.1%醋酸水溶液（55∶45，V／V）；流速：1.0 mL／min；柱溫：25℃；熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)：254 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：322 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 樣品衍生化方法[6]

精密吸取10 μL樣品溶液置1.5 mL離心管中，加10 μL硼酸鉀緩沖液（pH＝8.5），再加入 5 mmol／L FMOC－Cl的乙腈溶液20μL，混勻，20℃水浴反應(yīng)20min，再加入 0.1 mol／L的甘氨酸 10 μL，混勻，加 950 μL 0.1%（V／V）的醋酸水溶液，混勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，進(jìn)樣10 μL分析。

2.3 溶液制備

對(duì)照品溶液：稱(chēng)取10.4 mg DNJ對(duì)照品，精密稱(chēng)定，用純凈水定容至100 mL，得對(duì)照品母液。用純凈水將母液稀釋成質(zhì)量濃度為0.104，0.52，3.12，5.2，10.4，31.2，52 μg／mL的系列對(duì)照品溶液。再經(jīng)衍生化處理，即得。

供試品溶液：精密量取本品2 mL，置100 mL容量瓶中，加入15 mL 0.05 mol／L的HCl溶液，超聲10 min，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，再經(jīng)衍生化處理，即得。

空白溶液：精密吸取純凈水10 μL作為空白溶液。再經(jīng)衍生化處理，即得。

2.4 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：精密吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白溶液各10 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，對(duì)照品溶液與供試品溶液在相同保留時(shí)間有相應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，空白溶液則沒(méi)有，表明空白無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線(xiàn)性關(guān)系考察：分別將 0.104，0.52，3.12，5.2，10.4，31.2，52 μg／mL系列對(duì)照品溶液進(jìn)樣分析，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、對(duì)照品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程 Y＝31 602 X＋5 817.5，r＝0.999 9（n＝7）。結(jié)果表明，DNJ質(zhì)量濃度在0.104～52 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：將3.12 μg／mL DNJ對(duì)照品溶液依法連續(xù)進(jìn)樣 5次，測(cè)定峰面積。結(jié)果的 RSD為0.87%（n＝5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批供試品溶液分別于0，2，4，6，8，12 h時(shí)進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積并計(jì)算平均值。結(jié)果的 RSD為0.95%（n＝6），表明DNJ在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品，依法制備6份供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算DNJ的含量及 RSD值。結(jié)果樣品中DNJ的平均含量為30.25 μg／mL，RSD為0.82%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取已知含量的樣品1 mL，共6份，分別加入31.2 μg／mL的DNJ對(duì)照品溶液1 mL，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率及 RSD值。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 DNJ加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.5 樣品含量測(cè)定

取3個(gè)不同批號(hào)的炎寧糖漿，依法制備供試品溶液，并進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算樣品中DNJ的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

衍生化試劑的選擇：參考文獻(xiàn)[6－7]，比較了9－FMOC－Cl與6－氨基喹啉基－N－羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯（AQC）2種衍生化試劑，結(jié)果顯示，采用9－FMOCCl衍生化的衍生物較為穩(wěn)定，且與水解物分離良好。

流動(dòng)相考察：考察了乙腈－0.1%醋酸水（50∶50，55∶45，60∶40）不同流動(dòng)相比例，其中乙腈－0.1%醋酸水（60∶40）分離效果不理想，而乙腈－0.1%醋酸水（50∶50）峰型較差，故選擇流動(dòng)相乙腈－0.1%醋酸水（55∶45）作為洗脫溶劑，分離度良好。

提取方法考察：分別比較了索氏提取、回流提取及超聲提取等提取方法，結(jié)果，采用超聲提取方法時(shí)，操作較簡(jiǎn)便，對(duì)DNJ的提取較完全，故采取超聲提取方法對(duì)樣品進(jìn)行處理。

提取溶劑和時(shí)間考察：試驗(yàn)過(guò)程中考察了不同溶劑（55%乙腈，0.05 mol／L HCl，水）分別超聲提取10 min的提取率，結(jié)果顯示，0.05 mol／L HCl作為提取溶劑時(shí)提取率最高，故選擇其作為最佳提取溶劑。同時(shí)，比較了不同超聲提取時(shí)間（10，20，30 min）對(duì)提取率的影響，發(fā)現(xiàn)隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率提高幅度很小，表明不同超聲時(shí)間對(duì)含量的提取無(wú)明顯影響，故選擇超聲時(shí)間為10 min。

綜上所述，采用柱前衍生化高效液相色譜法測(cè)定炎寧糖漿中DNJ的含量，方法準(zhǔn)確可靠，峰形較好，可用于炎寧糖漿中DNJ的質(zhì)量控制。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.

[2]Kim HS，Kim YH，Hong YS，et al.Alpha－Glucosidase inhibitors from commelina communlis[J].Planta Medica，1999，65（5）：437－439.

[3]梁 明，王 鵬，張會(huì)慧，等.1－脫氧野尻霉素的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（17）：9 222－9 223.

[4]陳玉華，鄒鳳竹，龍 燕，等.蠶桑中1－脫氧野尻霉素藥理藥效的研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2014，25（10）：2 486－2 488.

[5]魏曉蕊.桑葉中1－脫氧野尻霉素的提取純化及其降血糖活性的研究[D].揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2012.

[6]歐陽(yáng)臻，李永輝，徐衛(wèi)東，等.高效液相色譜－熒光檢測(cè)法測(cè)定桑葉中的1－脫氧野尻霉素（DNJ）含量[J].中國(guó)中藥雜志，2005，30（9）：682－685.

[7]謝慧明，吳方睿，楊 毅，等.柱前衍生化高效液相色譜－熒光檢測(cè)法測(cè)定桑葉中的1－脫氧野尻霉素[J].色譜，2008，26（5）：634－636.

Content Determination of 1－Deoxynojirimycin in Yanning Syrup by HPLC with Pre－Column Derivatization

Liu Linlin，Cai Yanli，Bian Yanjing，Li Zhengguo
（Jining Institute for Food and Drug Control，Jining，Shandong，China 272025）

Objective Toestablish a method forthe contentdetermination of 1－deoxynojirimycin in Yanning Syrup by HPLC.Methods The determination was carried out with Kromasil C18column.The mobile phase was acetonitrile－0.1% acetic acid solution（55∶45）.The flow rate was 1.0 mL／min.The column temperature was 25℃.The fluorescence detector was operated at λEX＝254 nm，λEM＝ 322 nm.Results The content of 1－deoxynojirimycin was well linearly related to its peak area in range of 0.104－52 μg／mL（r＝0.999 9）.The RSD of precision，stability and reproducibility tests were all less than 2%.The average recovery of the method was 97.66%，with RSD of 1.67%（n＝6）.Conclusion The method is simple，accurate and stable，and can be used to control the quality of Yanning Syrup.

Yanning Syrup；1－deoxynojirimycin；pre－column derivatization；HPLC；content determination

R284.1；R286.0

A

1006－4931(2016)24－0075－03

劉琳琳，女，碩士研究生，主管藥師，研究方向?yàn)樗幤窓z驗(yàn)，（電子信箱）liulinlin20160516＠163.com；李正國(guó)，男，博士研究生，主任藥師，研究方向?yàn)樗幤窓z驗(yàn)，本文通訊作者，（電子信箱）1661705638＠qq.com。

2016－08－18)