原生質(zhì)體法介導(dǎo)真菌遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展

沈慧敏, 李 超, 高 利, 劉太國, 劉 博, 陳萬權(quán)

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193)

原生質(zhì)體法介導(dǎo)真菌遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展

沈慧敏, 李 超, 高 利*, 劉太國, 劉 博, 陳萬權(quán)

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193)

原生質(zhì)體法介導(dǎo)真菌遺傳轉(zhuǎn)化體系是實(shí)現(xiàn)大規(guī)模隨機(jī)、定點(diǎn)突變和菌種改良的方法之一,為研究真菌致病性和侵染機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。原生質(zhì)體法構(gòu)建轉(zhuǎn)化體系的步驟包括原生質(zhì)體的制備、轉(zhuǎn)化與再生,其中關(guān)鍵是原生質(zhì)體的制備,通常采用酶解法破除細(xì)胞壁獲得原生質(zhì)體,其獲得率直接影響轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化通常借助于聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)、電擊或限制性內(nèi)切酶法完成,其中PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法較傳統(tǒng),技術(shù)較成熟;電擊法操作較簡單;限制性內(nèi)切酶(REMI)介導(dǎo)的整合轉(zhuǎn)化,因其轉(zhuǎn)化效率較高,可產(chǎn)生大量穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子,正被越來越多地應(yīng)用于絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化。

原生質(zhì)體; 制備與再生; PEG介導(dǎo); 電擊; REMI; 轉(zhuǎn)化子

隨著真菌分子生物學(xué)研究的迅速發(fā)展,越來越多的真菌全基因組序列測序成功,真菌生物學(xué)研究進(jìn)入了功能基因組學(xué)時(shí)代,對能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模隨機(jī)和定點(diǎn)突變技術(shù)的需求日益增加。遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是實(shí)現(xiàn)大規(guī)模隨機(jī)和定點(diǎn)突變的重要方法之一,利用該技術(shù)可改變真菌的遺傳物質(zhì),可為深入研究真菌的某些代謝及生理現(xiàn)象提供方法,還可致力于解析真菌的致病機(jī)理。目前,實(shí)現(xiàn)真菌遺傳轉(zhuǎn)化的方法很多,如針對原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化方法有聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、電擊轉(zhuǎn)化和限制性內(nèi)切酶(REMI)介導(dǎo)的基因整合;針對完整細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化有以根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒為載體的轉(zhuǎn)化法、醋酸鋰轉(zhuǎn)化及基因槍法等。不同的轉(zhuǎn)化方法針對的對象不同,轉(zhuǎn)化效率也不同。

原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法以萌發(fā)的孢子、芽管或新生菌絲制備原生質(zhì)體,經(jīng)Ca2+處理使之成為容易吸收外界物質(zhì)的感受態(tài)。構(gòu)建攜帶外源基因和遺傳選擇標(biāo)記的質(zhì)粒,將制備好的原生質(zhì)體懸浮于含質(zhì)粒DNA的溶液中,在聚乙二醇、電擊或限制性內(nèi)切酶的作用下,外源DNA可被受體菌的原生質(zhì)體吸收并整合到其基因組中,再生菌體即可表達(dá)外源基因賦予的新遺傳性狀。轉(zhuǎn)化子因帶有顯性選擇標(biāo)記(如對抗生素的抗性和熒光標(biāo)記),可通過選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行選擇和鑒定。原生質(zhì)體的制備與再生是實(shí)現(xiàn)該方法的基礎(chǔ),也是關(guān)鍵步驟,其活性和再生率直接決定轉(zhuǎn)化能否成功。以下是主要步驟的幾個(gè)方面。

1 原生質(zhì)體的制備與再生

該部分是進(jìn)行轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟,主要包括以下幾個(gè)內(nèi)容:

(1)原始材料的準(zhǔn)備

制備原生質(zhì)體的材料一般為幼嫩菌絲、分生孢子或擔(dān)孢子。菌體的生長時(shí)期、生長溫度和培養(yǎng)時(shí)間均會(huì)影響原生質(zhì)體的制備,應(yīng)避免菌體培養(yǎng)時(shí)間過長或過短,影響原生質(zhì)體的制備和再生。為了制備出較多的原生質(zhì)體,需要優(yōu)化菌體的培養(yǎng)時(shí)間。如在CM液體完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)蘆筍莖枯病菌Phomopsisasparagi的分生孢子3 d后可獲得較多的原生質(zhì)體[1],而培養(yǎng)4 d的黑曲霉Aspergillusniger幼嫩菌絲體更宜用來制備原生質(zhì)體[2]。

(2)溶壁酶系統(tǒng)

真菌原生質(zhì)體通常采用酶解法去除細(xì)胞壁。不同真菌的細(xì)胞壁組成不同,主要包括纖維素、半纖維素、幾丁質(zhì)、葡聚糖及蛋白質(zhì)等。研究中應(yīng)根據(jù)真菌細(xì)胞壁的組成特點(diǎn),選擇合適的細(xì)胞壁降解酶。常用的細(xì)胞壁降解酶有蝸牛酶、崩潰酶及溶壁酶等。蝸牛酶中含有纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、葡糖酸酶、幾丁質(zhì)酶和脂酶等30多種酶,在pH 5.8～7.0有較好的裂解真菌細(xì)胞壁的作用,是制備真菌原生質(zhì)體有效的工具酶之一,尤其適合于降解含葡聚糖較多的真菌,如紅色酵母Phaffiarhodozyma的細(xì)胞壁[3]。崩潰酶是一類含有昆布多糖酶、木聚糖酶及纖維素酶的復(fù)合酶,廣泛應(yīng)用于多種植物病原真菌的原生質(zhì)體制備,該裂解酶尤其適合疫霉Phytophthora的細(xì)胞壁裂解[4]。此外來自哈茨木霉Trichodermaharzianum的溶壁酶具有蛋白酶、幾丁質(zhì)酶及纖維素酶等活性,在子囊菌如禾頂囊殼Gaeumannomycesgraminis的原生質(zhì)體制備中效果較好[5]。稻瘟病菌Magnaporthegrisea產(chǎn)生原生質(zhì)體效率最高的酶是裂解酶和崩潰酶,且當(dāng)酶濃度為10 mg/mL時(shí)產(chǎn)生的原生質(zhì)體數(shù)量最多,酶解2～3 h后即可獲得相當(dāng)數(shù)量的原生質(zhì)體,兩種酶的最適作用溫度分別為30℃和32℃[6];適于裂解小麥紋枯病菌Rhizoctoniacerealis的崩潰酶,最佳反應(yīng)溫度是24℃,最適的酶解時(shí)間為3 h[7];無論是真菌菌絲還是孢子,細(xì)胞壁的成分都比較復(fù)雜,所以在制備原生質(zhì)體過程中通常選取上述酶中的2～3種混合使用,酶的濃度通常在0.5%～5%,酶解時(shí)間一般在2～4 h,酶解的最適溫度為28～32℃。通常在實(shí)際操作中要根據(jù)不同真菌細(xì)胞壁的成分而選擇酶組合形式、酶解時(shí)間和酶解溫度。

(3)滲透壓穩(wěn)定劑

滲透壓穩(wěn)定劑主要起維持質(zhì)膜系統(tǒng)滲透壓的作用,降解細(xì)胞壁的酶類會(huì)破壞膜質(zhì)系統(tǒng)使其難以再生,甚至破裂、失活。當(dāng)剛剛形成的原生質(zhì)體被釋放到酶液中時(shí),酶系統(tǒng)對原生質(zhì)體會(huì)起到傷害作用,如果傷害過大,會(huì)直接影響原生質(zhì)體的再生和轉(zhuǎn)化,此時(shí)需要滲透壓穩(wěn)定劑來維持細(xì)胞質(zhì)膜的滲透壓,對原生質(zhì)體起到保護(hù)作用[8]。因此,滲透壓穩(wěn)定劑種類的選擇至關(guān)重要。不同真菌細(xì)胞所需的滲透壓穩(wěn)定劑不同,如水稻紋枯病菌Rhizoctoniasolani較適滲透壓穩(wěn)定劑為0.6 mol/L MgSO4·7H2O[9];黑曲霉Aspergillusniger較適滲透壓穩(wěn)定劑為1 mol/L山梨醇[2];小麥全蝕病菌Gaeumannomycesgraminis和青霉Penicillium較適滲透壓穩(wěn)定劑為0.6 mol/L NaCl[10]。

(4)再生培養(yǎng)基

原生質(zhì)體的再生和原生質(zhì)體的制備同等重要,需要探索和嘗試合適的再生培養(yǎng)基,如1.0 mol/L甘露醇較適合水稻紋枯病菌R.solani原生質(zhì)體的再生[9];CM培養(yǎng)基和PDB培養(yǎng)基較適合玉米絲軸黑粉菌Sphacelothecareiliana原生質(zhì)體的再生[11];0.6 mol/L蔗糖完全培養(yǎng)基較適合紅曲霉Monascusanka原生質(zhì)體的再生[12]。

2 原生質(zhì)體法構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化體系的原理以及已轉(zhuǎn)化成功的真菌

采用原生質(zhì)體構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化體系時(shí)通常借助于PEG介導(dǎo)、電擊或限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)來完成。將制備好的原生質(zhì)體懸浮后加入已構(gòu)建好的質(zhì)粒載體,然后分別加入一定量的PEG 緩沖液、限制性內(nèi)切酶或者放入電極杯中進(jìn)行電擊,按照一定的操作步驟處理好后再加入到選擇性再生培養(yǎng)基中,直到長出轉(zhuǎn)化子。

2.1 PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法

PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是使用較早較普遍的細(xì)胞融合方法。1978年,Hinnen等[13]首先利用聚乙二醇作為介質(zhì)成功完成了酵母原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化,此后PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法逐漸應(yīng)用于粗糙鏈孢菌Neurosporacrassa和構(gòu)巢曲霉Aspergillusnidulans等[14]。一般認(rèn)為PEG能和Mg2+、Mn2+、Ca2+等二價(jià)陽離子及外源DNA在細(xì)胞表面形成沉淀,從而改變質(zhì)膜的通透性,以利于外源DNA的進(jìn)入。高靜等[15]建立了PEG介導(dǎo)的蘋果腐爛病菌Cytosporamandshurica原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化體系,為深入研究該病菌的致病相關(guān)基因奠定了基礎(chǔ)。寧平等[11]研究了PEG介導(dǎo)的玉米絲軸黑粉菌S.reiliana原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化,其轉(zhuǎn)化效率約10個(gè)轉(zhuǎn)化子/μg DNA,篩選出穩(wěn)定表達(dá)潮霉素B抗性的轉(zhuǎn)化菌株,繼代培養(yǎng)9代后仍有潮霉素抗性。另外,現(xiàn)采用PEG介導(dǎo)的方法已建立了大麥堅(jiān)黑粉菌Ustilagohordei、紅曲霉M.anka、哈茨木霉T.harzianum、尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum及玉米彎孢葉斑病菌Curvularialunata等遺傳轉(zhuǎn)化體系[16-19]。

2.2 電擊轉(zhuǎn)化法

電擊轉(zhuǎn)化法是傳統(tǒng)PEG轉(zhuǎn)化法的基礎(chǔ),其原理是利用直流短電脈沖在原生質(zhì)體膜或細(xì)胞膜上形成可逆的瞬間通道,以利于外源DNA進(jìn)入,質(zhì)膜具有可修復(fù)性,外加電場造成的膜穿孔可在一定時(shí)間內(nèi)自動(dòng)修復(fù)[20]。由于電擊轉(zhuǎn)化步驟簡單,轉(zhuǎn)化效率較高,目前已經(jīng)應(yīng)用于不同物種的完整細(xì)胞和原生質(zhì)體,包括細(xì)菌[21]和真菌[22]。

2.3 限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法

在PEG和Ca2+存在的情況下,限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶可進(jìn)入原生質(zhì)體中,在限制性內(nèi)切酶的作用下,染色體DNA的相應(yīng)位點(diǎn)被切開,接著在DNA連接酶的作用下外源DNA插入到目標(biāo)基因組中,該技術(shù)應(yīng)用于很多真菌致病相關(guān)基因的標(biāo)記與克隆[23]。B?lker等[24]用限制性內(nèi)切酶法轉(zhuǎn)化了玉蜀黍黑粉菌Ustilagomaydis,得到了約1 000個(gè)插入突變體;Sánchez等[25]通過REMI法轉(zhuǎn)化了構(gòu)巢曲霉Aspergillusnidulans,并試圖通過此方法來標(biāo)記參與真菌無性繁殖的新基因;Tanaka等[26]基于REMI法對鏈格孢菌Alternariaalternata進(jìn)行了轉(zhuǎn)化;王秋華等[27]對尖孢鐮刀菌F.oxysporum的REMI轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了優(yōu)化,并對部分轉(zhuǎn)化子的表型進(jìn)行了初步分析;遲歸兵等[28]通過限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)稻瘟病菌Magnaporthegrisea原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化,建立了突變體庫。基于REMI法成功進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的真菌還有鏈格孢Alternariaalternata、玉米大斑病菌Exserohilumturcicum、玉米小斑病菌Cochliobolusheterostrophus、灰蓋鬼傘菌Coprinuscinereus、構(gòu)巢曲霉Aspergillusnidulans、稻瘟病菌Magnaporthegrisea、哈茨木霉T.harzianum、紅曲霉Monascusanka、甘藍(lán)枯萎病菌Fusariumoxysporum、玉米彎孢葉斑病菌C.lunata、葡萄潰瘍病菌Lasiodiplodiatheobromae等[29-41]。

3 轉(zhuǎn)化子篩選

將轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體涂布在含有已篩選濃度的抗生素(常用的抗生素有潮霉素、腐草霉素、遺傳霉素及新霉素等)再生培養(yǎng)基上,經(jīng)3～7 d左右長出菌落,進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的抗生素抗性鑒定[11];將在含抗生素平板上長出來的菌落轉(zhuǎn)接到新的抗生素平板上,等菌落長出后再以同樣的方法繼代培養(yǎng)5代以上,檢測轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性;提取DNA用特定抗生素的引物PCR檢測抗生素插入的片段[20]。

4 展望

利用原生質(zhì)體法構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化體系的關(guān)鍵是原生質(zhì)體的制備與再生,一般采用新生菌絲或孢子來制備原生質(zhì)體。影響真菌原生質(zhì)體制備的因素有很多,如菌齡過長會(huì)使細(xì)胞壁不容易酶解,從而影響原生質(zhì)體的釋放。真菌的細(xì)胞壁組成較復(fù)雜,混合酶液比單一酶液酶解效果要好,在制備原生質(zhì)體時(shí)要根據(jù)不同的真菌細(xì)胞壁成分來選擇合適的酶以及酶液濃度。滲透壓穩(wěn)定劑在酶解時(shí)能夠維持原生質(zhì)體的滲透壓穩(wěn)定,防止酶破壞膜系統(tǒng),使原生質(zhì)體難以再生,所以滲透壓穩(wěn)定劑的種類和濃度的選擇與酶的選擇同樣重要。酶解時(shí)間過短,不能充分制備數(shù)量較多的原生質(zhì)體,酶解時(shí)間過長,會(huì)影響再生。選擇合適的酶解溫度,能使酶更好地發(fā)揮作用。綜上所述,菌齡、酶系統(tǒng)、滲透壓穩(wěn)定劑、酶解時(shí)間及酶解溫度等都會(huì)影響原生質(zhì)體的數(shù)量和質(zhì)量。轉(zhuǎn)化時(shí)的質(zhì)粒中通常含有抗性標(biāo)記和熒光標(biāo)記。以抗性標(biāo)記為選擇系統(tǒng)時(shí),受體真菌對抗生素的敏感性很重要,潮霉素對大多數(shù)真菌具有抑制作用,很多真菌在遺傳轉(zhuǎn)化中都選擇將潮霉素抗性基因連接在載體上,因此可以考慮在研究其他真菌的轉(zhuǎn)化時(shí)構(gòu)建帶潮霉素抗性基因的載體,再在含敏感濃度的潮霉素平板上進(jìn)行篩選。

PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法自從1978年第一次轉(zhuǎn)化酵母成功后,近40年來,隨著技術(shù)不斷成熟,應(yīng)用范圍越來越廣,已在玉米絲軸黑粉菌S.reiliana[11]和紅曲霉M.anka[36]等真菌中實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)化。電擊轉(zhuǎn)化操作較簡便,既可以應(yīng)用于原生質(zhì)體也可用于完整細(xì)胞,不僅適用于絲狀真菌還適用于細(xì)菌和哺乳動(dòng)物。影響電擊轉(zhuǎn)化法的因素有電壓和連接反應(yīng)混合物的鹽濃度等[42]。REMI法轉(zhuǎn)化率較高,轉(zhuǎn)化子較穩(wěn)定[37]。

原生質(zhì)體的制備與再生是進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ),但對于有些真菌來說,其原生質(zhì)體制備過程繁雜,再生較難,轉(zhuǎn)化效率較低,轉(zhuǎn)化子不穩(wěn)定,所以不適合進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化,因此在選擇轉(zhuǎn)化方法時(shí)要先確定原生質(zhì)體的制備和再生是否能夠?qū)崿F(xiàn)。在確定可以使用原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化后,進(jìn)一步進(jìn)行條件優(yōu)化,提高轉(zhuǎn)化效率,不同真菌原生質(zhì)體的制備與再生的優(yōu)化條件要進(jìn)一步開展深入研究。

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(責(zé)任編輯：田 喆)

Research progress in transformation of fungi mediated by protoplasts

Shen Huimin, Li Chao, Gao Li, Liu Taiguo, Liu Bo, Chen Wanquan

(StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectsPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

The use of protoplast-mediated genetic transformation system is one of the means to achieve large-scale randomized and site-specific mutagenesis as well as strain improvement in fungi. It lays a foundation for studying fungal pathogenicity and infection mechanism. The procedure of constructing a protoplast-mediated transformation system involves protoplast preparation, transformation and regeneration. Among them, protoplast preparation is the key step, which is usually obtained by enzyme digestion-based cell wall removal. Protoplast production rate directly affects transformation efficiency. Transformation is usually mediated by polyethylene glycol (PEG), electric shock or restriction endonuclease digestion; PEG-mediated protoplast transformation is a relatively traditional and mature technique. The electric shock method is featured by simple operation. Because of the higher transformation efficiency which can produce a large number of stable transformants, restriction enzyme mediated integration (REMI) method is increasingly used in the genetic transformation of filamentous fungi.

protoplast; preparation and regeneration; PEG-mediated; electrical stimulation; REMI; transformant

2016-03-23

2016-07-11

國家自然科學(xué)基金(31571965)；北京市自然科學(xué)基金(6162022)；北京市科技新星(Z131105000413057)；北京市自然科學(xué)基金北京市科學(xué)技術(shù)研究院聯(lián)合資助項(xiàng)目(L140012)；小麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-03)

Q 78

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.02.004

* 通信作者 E-mail:lgao@ippcaas.cn