熒光PCR技術在從業(yè)人員傷寒痢疾快速篩查中的應用

王好玉，高峰，李偉宏，賈海江，潘愛霞

1.青州市人民醫(yī)院檢驗科，山東青州 262500；2.青州市疾病控制中心檢驗科，山東青州 262500

熒光PCR技術在從業(yè)人員傷寒痢疾快速篩查中的應用

王好玉1，高峰1，李偉宏1，賈海江2，潘愛霞2

1.青州市人民醫(yī)院檢驗科，山東青州 262500；2.青州市疾病控制中心檢驗科，山東青州 262500

目的 探討熒光PCR技術在從業(yè)人員傷寒痢疾快速篩查中的應用效果。方法2015年1月—2016年12月期間，該院與青州市疾控中心聯(lián)合查體，對青州市從業(yè)人員進行傷寒痢疾篩查，以5 900例的肛拭子糞便標本作為研究對象，對5 900例從業(yè)人員的肛拭子糞便樣本分別實施傳統(tǒng)國標方法和熒光PCR技術進行篩查。將其中檢出的陽性樣本進行血清鑒定和生化鑒定。結果 培養(yǎng)確診的沙門氏菌陽性率為0.85%，志賀氏菌陽性率為0.85%；熒光PCR技術檢出的沙門氏菌陽性率為1.19%，志賀氏菌陽性率為10.17%；傳統(tǒng)國標方法檢出的沙門氏菌陽性率為0.34%，志賀氏菌陽性率為0.51%。熒光PCR技術檢查的沙門氏菌陽性率和志賀氏菌陽性率與培養(yǎng)確診的陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；傳統(tǒng)國標方法檢出的沙門氏菌陽性率和志賀氏菌陽性率與培養(yǎng)確診的陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 熒光 PCR 沙門氏菌檢測陽性 5（A）、2（C），陰性 0（B）、5 893（D）；培養(yǎng)確診沙門氏菌檢測陽性 5（A）、0（B）；陰性2（C）、5 893（D）。熒光PCR技術檢查對沙門氏菌檢測結果的靈敏度顯著高于傳統(tǒng)國標方法，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 熒光 PCR 志賀氏菌檢測陽性 4（A）、2（C），陰性 0（B）、5 896（D）；培養(yǎng)確診志賀氏菌檢測陽性 4（A）、0（B）；陰性2（C）、5 896（D）。熒光PCR技術檢查對志賀氏菌檢測結果的靈敏度顯著高于傳統(tǒng)國標方法，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論PCR篩查法檢測技術對健康體檢人員的腸道致病菌進行快速篩查可以使檢驗的時間得以縮短，而且特異度強、靈敏度高，兼具時效性與客觀性，更適合基層實驗室規(guī)范統(tǒng)一地開展健康帶菌檢測工作。

熒光PCR技術；傷寒痢疾；快速篩查

食品從業(yè)人員及公共場所從業(yè)人員攜帶腸道致病菌是威脅公眾健康的一個重要問題，也是造成食品污染和食品中毒的間接因素。因此，對從業(yè)人員傷寒痢疾進行快速篩查是一項十分重要的工作。傳統(tǒng)的從業(yè)人員傷寒痢疾快速篩查采取的是國標方法，這種方法雖然在從業(yè)人員傷寒痢疾篩查中具有一定的效果，但是這種篩查方式所需的時間較長，通常需要5～7 d的時間，并且該篩查方式還存在靈敏度較低的問題。因此，臨床急需一種快速、高效、靈敏度較高的篩查方式。熒光PCR技術的引入和應用為從業(yè)人員傷寒痢疾的快速篩查提供了一條全新的途徑，在從業(yè)人員傷寒痢疾的快速篩查中表現(xiàn)出了較大的應用優(yōu)勢[1]。2015年1月—2016年12該研究對熒光PCR技術在從業(yè)人員傷寒痢疾快速篩查中的應用效果進行了研究，以期為提高從業(yè)人員傷寒痢疾快速篩查水平提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該次研究選取2015年1月—2016年12月青州市從業(yè)人員5 900例的肛拭子糞便標本作為研究對象，男3 500例，女2 400例，年齡 26～52歲，平均年齡為（43.2±3.2）歲。

1.2 研究方法

對5900例從業(yè)人員的肛拭子糞便樣本分別實施傳統(tǒng)國標方法和熒光PCR技術進行篩查。具體如下：①傳統(tǒng)國標方法：參照《食品衛(wèi)生微生物學沙門氏菌檢驗》（GB-T4789.4-2003）和《食品衛(wèi)生微生物學志賀氏菌檢驗》（GB-T4789.5-2003）進行檢測。②PCR技術篩查：參照WS/T454-2014《從業(yè)人員預防性健康檢查沙門菌志賀菌檢驗方法》技術方案用實時熒光PCR試劑盒進行實時熒光PCR檢測。將其中檢出的陽性樣本進行血清鑒定和生化鑒定。

1.3 統(tǒng)計方法

應用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件對研究數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料采用率（%）表示，進行χ2檢驗，檢驗水平α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組篩查方式的陽性率比較

培養(yǎng)確診的沙門氏菌5例，陽性率為0.85%，志賀氏菌5例，陽性率為0.85%；熒光PCR技術檢出的沙門氏菌7例，陽性率為1.19%，志賀氏菌6例，陽性率為10.17%；傳統(tǒng)國標方法檢出的沙門氏菌2例，陽性率為0.34%，志賀氏菌3例，陽性率為0.51%。熒光PCR技術檢查的沙門氏菌陽性率和志賀氏菌陽性率與培養(yǎng)確診的陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；傳統(tǒng)國標方法檢出的沙門氏菌陽性率和志賀氏菌陽性率與培養(yǎng)確診的陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 熒光PCR技術檢查對沙門氏菌檢測結果的準確率

靈敏度=A/(A+B)×100%=10/(10+0)×100%=100%；特異性=D/(C+D)×100%=11 787/(3+11 787)×100%=99.97%。熒光 PCR 沙門氏菌檢測陽性 5（A）、2（C），陰性 0（B）、5 893（D）；培養(yǎng)確診沙門氏菌檢測陽性 5（A）、0（B）；陰性 2（C）、5 893（D）。熒光 PCR技術檢查對沙門氏菌檢測結果的靈敏度顯著高于傳統(tǒng)國標方法，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 熒光PCR技術檢查對志賀氏菌檢測結果的準確率

靈敏度=A/(A+B)×100%=9/(9+0)×100%=100%；特異性=D/(C+D)×100%=11 789/(2+11 789)×100%=99.98%。 熒光 PCR 志賀氏菌檢測陽性 4（A）、2（C），陰性 0（B）、5 896（D）；培養(yǎng)確診志賀氏菌檢測陽性 4（A）、0（B）；陰性2（C）、5 896（D）。熒光 PCR 技術檢查對志賀氏菌檢測結果的靈敏度顯著高于傳統(tǒng)國標方法，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討論

按照我國頒布實施的《中華人民共和國食品衛(wèi)生安全法》《公共場所衛(wèi)生管理條例》中的相關要求來看，對于患有痢疾、傷寒、病毒性肝炎(消化道傳播)、活動性肺結核，化膿性或者滲出性皮膚病以及其他有妨礙公共衛(wèi)生等疾病的患者，在沒有得到良好治愈的情況下，不得從事直接為顧客服務的工作。這一規(guī)定是從疾病防治的角度出發(fā)來考慮的，其實施的主要目的是為了更好地維護公共健康，降低以上各類疾病的傳播。

在以上幾種危害公共健康的疾病之中，傷寒痢疾是一種危害性較大的疾病，具有較強的傳染性，傷寒痢疾無臨床癥狀，因此不易被人們重視，并加以管理，常常由于排菌污染食品而導致傷寒痢疾的傳播和流行，對公眾的健康造成了極大的危害。因此，傷寒痢疾成為了危害公共健康的一個重要因素。鑒于此，對從業(yè)人員傷寒痢疾的快速篩查，對于維護公共健康具有重要的意義。而要想實現(xiàn)對從業(yè)人員傷寒痢疾的快速篩查，就需要一種高效、快速、高靈敏度的篩查方法，這對于確保從業(yè)人員傷寒痢疾的篩查效果十分重要。

一直以來沿用的傳統(tǒng)的從業(yè)人員傷寒痢疾快速篩查，主要采取的是國標方法，這種篩查方法是參照《食品衛(wèi)生微生物學沙門氏菌檢驗》（GB-T4789.4-2003）和《食品衛(wèi)生微生物學志賀氏菌檢驗》（GB-T4789.5-2003）中的相關規(guī)定和要求制定檢測方案進行檢測的。傳統(tǒng)的國標方法一直以來在從業(yè)人員傷寒痢疾篩查中具有一定的效果，因此，長久以來從業(yè)人員傷寒痢疾的篩查一直沿用這種檢測方法。但是在長久的實踐應用中，傳統(tǒng)國標方法在從業(yè)人員傷寒痢疾篩查中的缺點和不足也逐漸凸顯，首先這種檢測方法用時較久，一般來說一次檢測往往需要5～7 d的時間才能夠獲得檢測結果，因此，這種檢測方法無法實現(xiàn)快速篩查。其次傳統(tǒng)國標方法在從業(yè)人員傷寒痢疾的檢測中還存在靈敏度較低的問題。因此，傳統(tǒng)國標方法在從業(yè)人員傷寒痢疾篩查中的應用，并不理想。在這樣的情況之下，臨床急需一種快速、高效、靈敏度較高的從業(yè)人員傷寒痢疾快速篩查方式，來提高從業(yè)人員傷寒痢疾快速篩查的篩查速度、篩查效率和篩查沒靈敏度。

熒光PCR技術的引入和應用為從業(yè)人員傷寒痢疾的快速篩查提供了一條全新的途徑[2]。熒光PCR技術是WS/T454-2014《從業(yè)人員預防性健康檢查沙門菌志賀菌檢驗方法》技術方案以經典培養(yǎng)法為依據(jù)，利用實時熒光PCR法靈敏、快速的優(yōu)點和經典培養(yǎng)方法準確可靠的優(yōu)點相結合，從而探討建立高效、準確、省力的一種全新的從業(yè)人員傷寒痢疾篩查方案。這一檢測方案在從業(yè)人員傷寒痢疾快速篩查中的應用，表現(xiàn)出了極大的應用優(yōu)勢。從該次研究結果來看，該次研究通過對5 900例從業(yè)人員的肛拭子糞便樣本實施篩查，最終檢出了沙門菌5例，陽性率為0.85%和志賀菌5例，陽性率為0.85%。而熒光PCR技術檢出的沙門氏菌7例，陽性率為1.19%，志賀氏菌6例，陽性率為10.17%；傳統(tǒng)國標方法檢出的沙門氏菌2例，陽性率為0.34%，志賀氏菌3例，陽性率為0.51%。熒光PCR技術檢查的沙門氏菌陽性率和志賀氏菌陽性率與培養(yǎng)確診的陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；傳統(tǒng)國標方法檢出的沙門氏菌陽性率和志賀氏菌陽性率與培養(yǎng)確診的陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。這一結果提示出，熒光PCR檢測方法對沙門氏菌和志賀氏菌的檢測準確率更高，與培養(yǎng)確診結果更加符合，在從業(yè)人員傷寒痢疾的快速篩查中具有更高的應用價值。且該次研究結果還表明，熒光PCR檢測在從業(yè)人員傷寒痢疾的快速篩查中，較傳統(tǒng)國標方法具有更高的靈敏度和特異性。由此可見，熒光PCR篩查法在從業(yè)人員傷寒痢疾篩查中具有更加顯著的應用效果，不僅如此，熒光PCR篩查法的引入和應用，還給從業(yè)人員的傷寒痢疾篩查工作帶來了改革與進步。具體表現(xiàn)在以下幾個方面：其一是表現(xiàn)在采樣環(huán)節(jié)的改革與進步，熒光PCR篩查過程中，所配套使用的生科源 “多功能采樣器”，為一體化的專業(yè)設計，該設計集合了采樣環(huán)節(jié)所涉及的采樣、運輸、增菌、取樣多功能需求。多功能采樣器配備了滅菌增菌液，這樣的設計省去了傳統(tǒng)方法篩查過程中的采樣瓶清洗、配液、消毒等環(huán)節(jié)，可直接進行使用。這樣的設計一方面節(jié)省了傳統(tǒng)篩查方法中進行采樣時，需進行人工準備過程中所消耗的大量人力，另一方面這樣的設計也很好地消除了該環(huán)節(jié)潛在的污染風險。不僅如此，多功能采樣器在制造過程中使用的是全塑料組件，全塑料組件具有不破碎、不漏液的優(yōu)點，這樣能夠很好地避免標本在運輸過程意外產生的樣本交叉污染問題。同時，在取樣時無需開啟采樣器瓶蓋，這樣能夠很好地避免標本取樣的操作失誤和標本污染[3]。其二是表現(xiàn)在檢測環(huán)節(jié)的改革與進步，主要表現(xiàn)在篩查結果儀器自動判讀，可積極有效地規(guī)避、消除主觀因素造成的實驗誤差；顯著的縮短了檢驗時間，真正實現(xiàn)從業(yè)人員傷寒痢疾的快速篩查；且熒光PCR篩查能夠實現(xiàn)一人操作，從而顯著減少了工作人員的工作量，提高了檢驗工作效率；檢驗結果所得的數(shù)據(jù)采取電腦管理，因此，檢驗結果數(shù)據(jù)能夠實現(xiàn)原始數(shù)據(jù)追溯[4]。該次研究中，所用的熒光PCR篩查技術，其中的PCR試劑應用的是改良分子信標設計。由于改良分子信標更短，因此其與靶序列結合更緊密，使得擴增條件要求不嚴。因此，應用改良分子信標設計的熒光PCR篩查方法更加適合在基層進行大范圍的應用，為實現(xiàn)基層推廣應用提供了條件。綜合來看，該技術方案為整體技術方法，提供了從采樣到PCR篩查所需要配套的多功能采樣器、PCR試劑盒以及各技術環(huán)節(jié)的配套細節(jié)設計。新技術方案是剛頒布的國家衛(wèi)生標準，填補了這一領域的技術空白，是一個實用、簡便、有效的技術規(guī)范[5]。鑒于此，熒光PCR篩查法不僅具有快速、高效，高靈敏度、高特異度的從業(yè)人員傷寒痢疾篩查效果，同時該篩查方法也更加適合在基層進行推廣應用。

綜上所述，PCR篩查法檢測技術對健康體檢人員的腸道致病菌進行快速篩查可以使檢驗的時間得以縮短，而且特異度強、靈敏度高，兼具時效性與客觀性，更適合基層實驗室規(guī)范統(tǒng)一地開展健康帶菌檢測工作。

[1]韓毅，孫燕萍，周虹.實時熒光定量PCR法與分離培養(yǎng)法檢測食品從業(yè)人員沙門菌和志賀菌的比較研究[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2015，27（2）：132.

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[3]劉紅，楊帆，張笑冰，等.痢疾桿菌全基因組序列及基因組島的分析[J].中國工程科學，2002，4(10)：40.

[4]尹榮煥，尹榮蘭，楊玉英，等.PCR技術檢測熟肉制品中沙門氏菌的研究[J].安徽農業(yè)科學，2006，134（2）：222，226.

[5]劉華偉，郭藹光，馬立農，等.PCR技術在沙門氏菌快速檢測中的應用[J].動物醫(yī)學進展，2004，25（6）：55-58.

R466.13

A

1672-5654（2017）07（a）-0064-03

2017-04-05）

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.19.064

王好玉（1962-），男，山東青州人，本科，副主任檢驗師，研究方向：醫(yī)學檢驗。