人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測實驗室生物安全管理

孫喚，劉蓉，羅美庭

湘潭縣疾病預防控制中心，湖南湘潭 411228

人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測實驗室生物安全管理

孫喚，劉蓉，羅美庭

湘潭縣疾病預防控制中心，湖南湘潭 411228

為規(guī)范人感染H7N9禽流感病毒核酸實驗室檢驗活動，強化生物安全管理，防止內部感染和交叉感染，該文參照《病原微生物實驗室生物安全管理條例》（國務院424號令）等有關規(guī)定，結合實際情況，從檢測室布局到樣品處理分析等多方面闡述人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測生物安全管理要求，以供相關人員參考。

H7N9；核酸檢測；生物安全

H7N9禽流感病毒屬于甲型流感病毒中的一種亞型，可引發(fā)人類急性呼吸道感染，病情進展到后期時可并發(fā)多種嚴重疾病，傳染源尚未確切證實，可能為攜帶H7N9禽流感病毒的禽類（該實驗室從確診病例密切接觸禽類的分泌物和排泄物中檢出多株H7N9陽性病毒），傳播途徑可能是經呼吸道、密切接觸感染禽類的分泌物或排泄物等途徑傳播，或通過接觸病毒污染的環(huán)境傳播至人，不排除有限的非持續(xù)的人傳人[1]。我國自從2013年3月31日在上海和安徽兩地發(fā)現(xiàn)全球首次病例以來，內地共有19個省份累計報告H7N9病例1 000余例，死亡逾400例，病死率達高40%左右[2]。人感染H7N9禽流感危害程度大，重癥患者預后差、病死率高，且病毒可能發(fā)生變異形成人際間的傳播能力，其危害水平將極速增加[3]。在傳染源和傳播途徑等諸多因素不能明確的情況下，對其生物安全管理的若干問題進行初步探討，對強化生物安全，防范實驗室內部感染和交叉感染，具有重要意義。

1 實驗室生物安全管理內容

1.1 危害評估

實驗室開展人感染H7N9禽流感病毒實驗室核酸檢測之前必須組織專業(yè)人員進行危險評估，基本內容應包括：標本中可能的致病生物因子、傳播方式、感染性與致病性、對各種物理化學因子的敏感性、人體劑量反應和危害程度，以及實驗室的功能定位、涉及的人員、具體操作方法和過程等。根據評估結果確定相應的防護級別。

1.2 生物安全管理綜合措施

加強管理，制定并健全與之相適應的生物安全管理制度，應包括：實驗室安保和準入、標準化操作規(guī)程、儀器使用和維護、實驗室人員培訓和考核、樣本采集運輸與保存、實驗室消毒和醫(yī)療廢棄物處理、陽性標本保存和處理、意外事故處理和報告、實驗室人員健康體檢等。

1.3 生物安全設施和防護

配備開展H7N9禽流感病毒核酸檢測的各個功能區(qū)和主要設備，按防護要求進行個體著裝，嚴格按照標準操作規(guī)程從事各類活動。

2 實驗室生物安全級別

①H7N9禽流感病毒暫未錄入《人間傳染的病原微生物名錄》（衛(wèi)生部衛(wèi)教科發(fā)[2006]15號），根據現(xiàn)有情況進行風險評估，疑似病例未經培養(yǎng)的臨床樣本可在二級生物安全實驗室的生物安全柜內分裝、滅活和核酸提取，個人防護措施也應達到相應標準。

②人感染H7N9禽流感病毒的分離培養(yǎng)和動物感染實驗應在生物安全三級實驗室進行，在此不作探討。

3 實驗室布局

人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測實驗室應按《實驗室生物安全通用要求》（GB19489-2004）和《醫(yī)療機構臨床基因擴增管理法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號）等要求設置。

3.1 實驗室主要布局

驗室分可為3個獨立的工作區(qū)域（使用熒光素染色凝膠電泳進行產物檢測則需分為4區(qū)，在此不做討論），即試劑儲存與準備區(qū)、樣品提取區(qū)、基因擴增和分析區(qū)，每區(qū)門口貼警示標識，門可自動閉合，設有一個緩沖間，物品通過傳遞窗按試劑儲存與準備區(qū)、樣品提取區(qū)、基因擴增和分析區(qū)單一流向進行，避免各區(qū)之間交叉污染。

3.2 實驗室主要設備

①試劑儲存與準備區(qū)：-70℃低溫冰箱、超凈工作臺、紫外消毒燈，混勻器。②樣品提取區(qū)：生物安全柜、低溫高速離心機、-70℃低溫冰箱、高壓滅菌器、紫外消毒燈、洗眼裝置、混勻器。③基因擴增和分析區(qū)：全自動實時熒光定量PCR儀、紫外消毒燈。注：各區(qū)配有備用電源，應急照明。

4 標本采集、包裝運輸和保存

4.1 標本采集

H7N9禽流感病毒核酸檢測主要采集患者發(fā)病早期、未服用抗病毒藥物的咽拭子（還可采集深部痰液、呼吸道抽取物和支氣管灌洗液等標本），操作人員必須規(guī)范操作，即要保證樣本質量，還能防止病毒的傳播和擴散。采樣開始前做好各項準備工作，包括個人防護用品穿戴（鞋套、防護服、帽子、N95及以上水平醫(yī)用防護口罩、雙層醫(yī)用乳膠手套、隔離衣、面罩等），防護設施和采樣設備的配備等。采集咽拭子時，操作人員用壓舌板輕壓舌部，同時用專用采樣棉簽準確快速擦拭患者雙側咽扁桃體及咽后壁，將拭子插入裝有含有3 mL采樣液的管中，棄去尾部，旋緊瓶蓋[4]。并對樣品的種類、來源、采集方法和日期等做詳細記錄。樣本采集完成后，將產生的醫(yī)療廢物分類收集于生物廢物袋，帶回實驗室（或在有條件的采樣現(xiàn)場）進行高壓蒸汽消毒處理。

4.2 樣本包裝與運輸

H7N9禽流感病毒核酸檢測的樣品按照B類感染性物質進行包裝和運輸，操作人員應當經過專業(yè)知識和技能操作培訓并考核通過，采用三層包裝系統(tǒng)（由內到外分別為內層容器、中層包裝和外層包裝），包裝和標記過程中操作人員可采用上述樣品采集過程中的防護水平進行個人防護。完善相關運輸申請手續(xù)，專人轉車運送。

5 樣本接收、保存和檢測

5.1 樣本接收、保存

樣本交接相關工作在實驗室清潔區(qū)域完成。再由專業(yè)人員穿戴個人防護裝備后在樣品提取區(qū)的二級生物安全柜內開啟包裝，檢查包裝狀態(tài)（有異常情況應馬上啟動意外事故處理和報告程序），消毒內層容器表面，核對樣本信息，準備實驗室檢測。操作過程注意動作輕柔，防止損壞內層容器，如有容器破損或內容物溢出等異常情況發(fā)生，應馬上啟動意外事故處理和報告程序。如樣品需暫緩檢測，可于2～8℃保存3 d；-20℃保存6個月；-70℃保存12個月。

5.2 樣本檢測和保存

操作人員必須經過專業(yè)知識和技能操作培訓合格后才能上崗，進入實驗室前，須穿戴好個人防護設備，包括隔離衣、防護服、N95及以上水平醫(yī)用防護口罩和雙層醫(yī)用乳膠手套等。各功能區(qū)嚴格區(qū)分，物品、防護裝備專用。試劑準備在試劑儲存與準備區(qū)的超凈工作臺內進行，反應管配制完成后加蓋，通過傳遞窗傳送到樣品提取區(qū)；樣品處理在Ⅱ區(qū)的生物安全柜中進行，操作時動作輕緩，減少氣泡產生，加樣工作結束后將反應管通過傳遞窗送至基因擴增和分析區(qū)進行基因擴增與分析。每次實驗完成后工作臺及各種實驗用品用10%次氯酸鈉（或其他等效消毒劑）擦拭消毒，再開啟紫外燈消毒處理?；顒舆^程中產生的各種廢棄物，如使用過的槍頭、反應管等，高壓蒸汽消毒后再運出實驗室集中處置。操作和處理符合《醫(yī)療廢物管理條例》相關要求。剩余樣本保存在Ⅱ區(qū)的-70℃低溫冰箱，詳細登記相關信息，雙人雙鎖管理。無需留存的標本視同感染性廢棄物高壓蒸汽消毒處理。

6 實驗室安保和準入

制定實驗室安保和準入制度并落實到位，禁止無關人等進入PCR實驗室，培訓學習等非常規(guī)狀況下進入須有帶教老師或實驗室負責人批準，并遵守實驗室相關規(guī)定。凡是進行PCR檢驗相關活動的工作人員必須有體檢健康證明，掌握最新的生物安全防護知識和實驗操作技術，了解實驗潛在風險，并經培訓取得相應的資格證書。在工作區(qū)域進行檢驗相關活動時，要自覺接受生物安全員的管理和監(jiān)督。

7 儀器使用和維護

每次實驗完畢后填寫儀器使用相關記錄并簽名，包括儀器運行狀況，操作內容和環(huán)境溫濕度條件等；制定相關儀器維護流程與周期，定期維護，填寫維護記錄。當儀器出現(xiàn)異常不能自行處理時，報儀器廠家維修處理，維修人員必須按照二級生物安全個人防護水平穿戴，以保證其安全。

8 生物安全事故處理

實驗室要制定行之有效的生物安全事故處理辦法，確保儲存的消毒劑足量有效，當生物安全事故發(fā)生后，當事人應馬上將情況向實驗室生物安全負責人如實匯報，并立刻選擇相應的生物安全事故處理措施，盡量縮小意外事故的影響范圍和嚴重程度。

人類歷史上發(fā)生過許多次重大流行性疾病爆發(fā)，像鼠疫、流行性感冒、霍亂、SARS等等[5]，每次都給人類帶來了巨大的生命和財產損失，因此人們開始探究有效方法，從宏觀調控預防到實驗室檢測研究，試圖多途徑控制各種傳染病。實驗室活動早期，實驗室生物安全并沒有引起足夠的重視，人們普遍忽視實驗室感染問題，指導性文件和技術標準缺乏，實驗室生物安全管理體系不健全，規(guī)章制度執(zhí)行不到位，生物安全意識淡薄。2004年，某國家級病毒病研究機構的一名研究生在從事實驗室活動時被SARS冠狀病毒感染，并出現(xiàn)了第三代感染，造成了9例致病1例死亡的嚴重后果，引發(fā)了人們對生物安全問題高度關注，從此開啟了我國實驗室生物安全管理體系的建立和完善工作。

每個實驗室生物安全管理體系的創(chuàng)建，首先要明確目標，即確保整個實驗及有關活動的中人員與環(huán)境不受實驗對象感染，安全處理具有傳染性的物質和樣品，實驗室人員熟悉和掌握相關安全知識和實踐操作技術。再圍繞目標構建一系列框架使其得以實現(xiàn)，包括機構、人員、資源和體系文件等。

[1]人感染H7N9禽流感診療方案[Z].國家衛(wèi)生計生委辦公廳，2014.

[2]朱聞斐，高榮保,王大燕,等.H7亞型禽流感病毒概述[J].病毒學報,2013（3）:245-249.

[3] 曹彬.人禽流感 H7N9、H5N1、H10N8臨床特征[J].生命科學,2015（5）:549-553.

[4]劉峰.臨床護理實踐指南[M].2011版.北京:人民軍醫(yī)出版社,2011.

[5]牛亞華.歷史上人類與傳染病的斗爭[J].科學之友,2006（1）：30-36.

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A

1672-5654（2017）06（a）-0058-02

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.16.058

2017-03-09）

孫喚（1982-），男，湖南岳陽人，本科，主管檢驗師，研究方向：衛(wèi)生檢驗。