紙片擴(kuò)散法抗菌藥物敏感試驗(yàn)的質(zhì)量控制

鐘偉萍

山東省青島大學(xué)附屬威海市立第二醫(yī)院，山東威海 264200

紙片擴(kuò)散法抗菌藥物敏感試驗(yàn)的質(zhì)量控制

鐘偉萍

山東省青島大學(xué)附屬威海市立第二醫(yī)院，山東威海 264200

目的抗菌藥物敏感試驗(yàn)是臨床抗菌治療的指導(dǎo)性實(shí)驗(yàn)。關(guān)系到抗菌藥物治療成敗。方法多種方法中選WHO推薦使用的利于基層醫(yī)院開展的紙片擴(kuò)散法。結(jié)果日常常規(guī)操作中應(yīng)控制好平板厚度、瓊脂濃度、細(xì)菌接種量、瓊脂種類及多種因素。結(jié)論在嚴(yán)把紙片擴(kuò)散法抗菌藥物敏感實(shí)驗(yàn)的操作過程的同時，有必要做好質(zhì)量控制，確保結(jié)果準(zhǔn)確性，服務(wù)于臨床。

紙片擴(kuò)散法；抗菌藥物敏感試驗(yàn)；質(zhì)量控制

在臨床感染性疾病、菌種的耐藥性、抗生素的合理應(yīng)用等。抗菌藥物敏感試驗(yàn)是實(shí)驗(yàn)室不可缺少的，常用方法有Etest法、稀釋法、Kirby-Bauer法以下簡稱（K-B紙片擴(kuò)散法）以及全自動微生物分析儀等。紙片擴(kuò)散法是WHO推進(jìn)使用的微生物敏感性測定方法[1]，能在抑菌濃度范圍內(nèi)待測菌的生長被抑制，形成透明的抑菌圈。根據(jù)抑菌圈的大小可判斷待測菌對測定藥物的敏感程度[2]。其特點(diǎn)是操作簡單，測定的藥物可隨臨床需要而調(diào)整，易檢測個別特殊耐藥菌株[3]，更重要是擴(kuò)散法有一套完整的質(zhì)量控制，結(jié)果可靠，是微生物常用方法，全自動或半自動儀器分析法是一種微量肉湯稀釋法[4]。該文將平時工作中的質(zhì)量控制要點(diǎn)闡述如下。

1 紙片擴(kuò)散法誤差原因

一次質(zhì)量控制結(jié)果錯誤，常被認(rèn)為是一種統(tǒng)計(jì)上的隨機(jī)變化。

①接種平皿不均勻；②抑菌環(huán)量取記錄直徑有誤；量取工具有誤差；③標(biāo)準(zhǔn)菌株保存、污染、過期等改變；④細(xì)菌接種量，在K-B紙片擴(kuò)散法藥敏實(shí)驗(yàn)菌液量規(guī)范中提出固定接種0.35 mL菌液量[5]；⑤0.5管麥?zhǔn)蠞岫裙芪磽u勻、已過期；⑥孵育溫度、時間、放置、氣體等不合格；⑦M(jìn)H培養(yǎng)基制作、深度、厚度、購入批次批號等有關(guān)；⑧藥敏紙片質(zhì)量改變。立即觀察藥物平板，重復(fù)試驗(yàn)一般能夠解決，如仍失控必須恢復(fù)每日質(zhì)控查找原因。⑨菌液濃度未得到控制；未混勻；⑩發(fā)現(xiàn)問題及時查找原因進(jìn)行校正。

2 質(zhì)控測定次數(shù)

MH瓊脂和藥敏紙片更換批次批號必須用質(zhì)控菌株進(jìn)行測試。檢測標(biāo)本時應(yīng)與質(zhì)控菌株一起檢測可監(jiān)控整個操作過程。當(dāng)與常規(guī)標(biāo)本一起連續(xù)測定質(zhì)控菌株30 d或每種藥物與相應(yīng)的每種細(xì)菌的30個抑菌環(huán)直徑少于3個結(jié)果超出常用抗菌藥物紙片對質(zhì)控菌株的抑菌環(huán)直經(jīng)允許范圍時。達(dá)到以上要求可每周1次檢測。發(fā)現(xiàn)有一個不符合的結(jié)果立即查找原因。發(fā)現(xiàn)質(zhì)控菌株錯誤、含藥紙片種類錯誤或標(biāo)準(zhǔn)菌株被污染等及時糾正，如果不能發(fā)現(xiàn)原因立即改為每日檢測。

3 抑菌環(huán)的質(zhì)控

常用抗菌藥物紙片對質(zhì)控菌株的測定抑菌環(huán)直徑應(yīng)控制在的允許范圍內(nèi)。在連續(xù)20個實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中只能有一個結(jié)果超出對應(yīng)的范圍。任何有一個以上的結(jié)果超出即認(rèn)為是失控，及時糾正。

4 標(biāo)準(zhǔn)菌株

大腸埃希菌ATCC25922；大腸埃希菌ATCC35218（用于β內(nèi)酰胺梅抑制劑復(fù)合制劑）；流感嗜血桿菌ATCC49247、ATCC49766（用于 HTM 培養(yǎng)基）；金黃色葡萄球菌ATCC25923；肺炎克雷伯菌ATCC700603；淋病奈瑟菌ATCC49226（用于GC瓊脂）；銅綠假單胞菌ATCC27853；肺炎鏈球菌（用于 5%羊血 MH瓊脂）ATCC49619。糞腸球菌ATCC29212。

5 質(zhì)控菌株的保存

標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇后的單個菌落接種于相對應(yīng)的平皿上，培養(yǎng)18 h，將菌落用無菌的方法接種于40%甘油肉湯中，-20℃冰箱保存1年，每月用1支，在接種于對應(yīng)的平板，培養(yǎng)出純菌落在4℃冰箱保存1個月。需密封保存。對淋病奈瑟氏菌、嗜血桿菌等溫度比較敏感，要快速冷凍長期儲存，藥敏試驗(yàn)對照用的不超過5次以上傳代。注意對菌株的維護(hù)最少次數(shù)的傳代和儲存-60℃或以下。

6 藥敏紙片的質(zhì)量是做好藥敏試驗(yàn)的關(guān)鍵

①紙片含藥量高低是影響抑菌環(huán)大小的重要因素，用半飽和法制作的藥敏紙片含量一般為10 μg，飽和法藥敏紙片含量為20 μg[6]。pH為中性。藥敏紙片厚度1 mm左右，這樣適宜藥物擴(kuò)散利于細(xì)菌生長。紙片直徑(6.00～6.35 mm)、重量、每片吸水性（20 uL）、酸堿度、金屬離子等與紙片含藥量有關(guān)。冷凍干燥制備。②新購藥敏紙片抑菌圈大小不均。在用前必須檢驗(yàn)每片差度（不大于1～2 mm）和準(zhǔn)確度（實(shí)際藥量與標(biāo)準(zhǔn)藥量是否相符），達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)后方可使用。長時間不用抑菌圈過小可能是抗生素降解，及時更換。③藥敏紙片保存，常規(guī)用量之外的藥敏紙片最好放于-20℃保存。常用的可在2～8℃保存1周。β-內(nèi)酰胺類藥敏紙片應(yīng)冷凍儲存，不超1周。在紙片保存如喹諾酮類藥物注意避光保存。青霉素類、含有β內(nèi)酰胺抑制劑和亞胺培南的紙片加干燥劑保存。④藥敏紙片取出后應(yīng)在室溫平衡至少10 min以上再打開，避免冷凝水影響。完后及時冷凍冷藏。⑤不要使用過期的藥敏紙片。

7 菌懸液濃度標(biāo)準(zhǔn)

用接種環(huán)挑取新鮮菌落懸浮于生理鹽水中混勻，菌液濃度為1.50×108cfu/mL,為0.5管麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn)管，用光度計(jì)625 nm測定吸光度為0.08～0.10，每月更換標(biāo)準(zhǔn)管。

8 培養(yǎng)基

①新購的MH瓊脂或新自制的MH瓊脂均應(yīng)使用標(biāo)準(zhǔn)菌株、質(zhì)控藥敏紙片和標(biāo)準(zhǔn)來測試合格后使用。研究表明:選用國產(chǎn)和進(jìn)口的5種瓊脂，均表現(xiàn)出瓊脂濃度越大，抑菌圈直徑越小[7]。②培養(yǎng)基的制作:聶慶東等[8]實(shí)驗(yàn)室自制MH瓊脂培養(yǎng)基與商品藥敏瓊脂平板比較，不同培養(yǎng)基抑菌環(huán)直徑均符合《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》的允許范圍，其準(zhǔn)確性有質(zhì)量保證；藥敏直徑的差異對耐藥、中介、敏感的折點(diǎn)判定產(chǎn)生影響；藥敏直徑相關(guān)性顯示相關(guān)系數(shù)r>0.95，呈高度正相關(guān)。平板厚度應(yīng)一直為4 mm，無菌試驗(yàn)合格。4℃使用一周，用前放35℃孵育箱30 min,過久或脫水不易使用。③盡可能降低MH培養(yǎng)基中的胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶，可與磺胺類和甲氧芐胺嘧啶核苷有競爭，過量可抵消效應(yīng)，抑菌環(huán)縮小模糊或消失，導(dǎo)致假耐藥現(xiàn)象產(chǎn)生。自制的MH培養(yǎng)基也存在此現(xiàn)象[8]。用甲氧芐胺嘧啶或磺胺甲基異噁唑?qū)S腸球菌ATCC29212、ATCC33186進(jìn)行測試，抑菌環(huán)清晰，直徑≥20 mm，則胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶含量合格。④培養(yǎng)基中含有鈣鎂等離子，起到溶酶作用。影響氨基糖苷類和四環(huán)素對銅綠假單胞菌抗菌活性，含量過高，抑菌環(huán)變小。含量過低抑菌環(huán)變大。在配制過程中應(yīng)用蒸餾水或去離子水，檢測金屬含量。⑤對特殊細(xì)菌應(yīng)用改良培養(yǎng)基或選擇培養(yǎng)基。⑥MH瓊脂的pH7.2～7.4，不宜用目測或試紙比色。pH太低，能減輕氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類藥物的抗菌活性，加強(qiáng)青霉素類藥物的抗菌活性。

9 實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果測量

配置好的菌懸液應(yīng)在15 min內(nèi)接種，使用無菌棉試子，取校正的菌液，在液面上管壁內(nèi)旋轉(zhuǎn)擠出多余的菌液，在培養(yǎng)基表面涂3次，每次旋轉(zhuǎn)平皿60°，在平皿周邊涂2圈，保證均勻涂布。室溫放3～5 min,吸收平板表面水分。各紙片距離＞24mm,與平皿邊緣＞15mm。紙片一旦接觸瓊脂不應(yīng)在移動位置。最好紙片平板應(yīng)在15 min內(nèi)翻轉(zhuǎn)，致35孵育箱中18～24 h，平板最多2個疊起。受熱均勻。結(jié)果用帶表卡尺或精確度大1/10 mm的其他量具。根據(jù)NCCLS標(biāo)準(zhǔn)對量取的抑菌圈直徑作出“敏感”“耐藥”“中介”的判斷。所有患者結(jié)果在報(bào)告前均需要審核,不常見的結(jié)果需要確證以后，確認(rèn)無誤發(fā)放檢驗(yàn)結(jié)果。

10 結(jié)語

紙片擴(kuò)散法抗菌藥物敏感試驗(yàn)必須引起重視，確保藥敏試驗(yàn)準(zhǔn)確，避免誤差，給臨床用藥提供可靠的治療依據(jù)，防止用藥不當(dāng)產(chǎn)生耐藥菌株延誤治療[9]。

[1]譚瑤，趙清.K-B紙片擴(kuò)散法藥物敏感試驗(yàn)[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2010，7(20):2290-2291.

[2]王傳新,王國禮.現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)技術(shù)及質(zhì)量控制[M].濟(jì)南:山東科學(xué)技術(shù)出版社,2004:171.

[3]藍(lán)鍇.高昆山.官旭俊.不同方法檢測粘液型銅綠假單胞菌藥物敏感性結(jié)果準(zhǔn)確性探討[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2012,27(7):544-548.

[4]馬馳.林居純.陳雅莉，等.禽源金黃色葡萄球菌耐藥性檢測[J].中國獸醫(yī)雜志，2010，46（9）:10-12.

[5]余修中,K-B法藥敏實(shí)驗(yàn)中菌液量的規(guī)范[J].四川省衛(wèi)生管理干部學(xué)院學(xué)報(bào),2002,9(21):177-178.

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[8]聶慶東,張秀敏,黃鶴，等.實(shí)驗(yàn)室自制MH瓊脂培養(yǎng)基與商品藥敏瓊脂平板比較分析及意義[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志：電子版，2011，8(5)：9-13.

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Quality Control of Anti-bacterial Drug Sensitive Test of Paper Diffusion Method

ZHONG Wei-ping
Weihai Municipal Second Hospital Affiliated to Qingdao University,Weihai,Shandong Province,264200 China

ObjectiveThe sensitive test of antimicrobial agents is the guiding experiment of clinical antibacterial therapy,which is related to the success or failure of antibacterial drug treatment.MethodsThe paper diffusion method of the primary hospital is recommended by the WHO among the various methods.ResultsThe plate thickness,AGAR concentration,bacterial inoculation,AGAR variety and various factors should be controlled in routine operation.ConclusionIn strict control of the paper diffusion method of antimicrobial susceptibility testing process,it is necessary to grasp the quality control to ensure the accuracy of the results,so as to serve the clinical practice.

Paper diffusion method;Sensitive test of antimicrobial agents;Quality control

R446.1

A

1672-5654（2017）09（b）-0038-02

2017-06-12）

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.26.038

鐘偉萍（1969-），女，山東威海人，本科，主管技師，主要從事臨床檢驗(yàn)工作。