凍融成熟卵母細(xì)胞顯微受精后凍融胚胎移植成功并分娩1例及文獻(xiàn)分析

黃 華 牛向麗 莫 毅 陳自洪 公方強

廣西壯族自治區(qū)計劃生育研究中心(南寧，530021)

凍融成熟卵母細(xì)胞顯微受精后凍融胚胎移植成功并分娩1例及文獻(xiàn)分析

黃 華 牛向麗*莫 毅 陳自洪 公方強

廣西壯族自治區(qū)計劃生育研究中心(南寧，530021)

目前精子冷凍和胚胎冷凍技術(shù)比較成熟，但卵母細(xì)胞冷凍，尤其是玻璃化冷凍仍處于應(yīng)用的初級階段。將卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)、胚胎冷凍技術(shù)結(jié)合運用并獲得成功妊娠更是困難。據(jù)檢索，至今，凍融卵母細(xì)胞顯微授精后凍融胚胎移植成功并分娩的病例仍鮮有報道。本文對本中心1例經(jīng)玻璃化冷凍方法冷凍的成熟卵母細(xì)胞，解凍后行卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)獲得胚胎，再將優(yōu)質(zhì)胚胎行玻璃化冷凍，胚胎解凍移植后獲得臨床妊娠并成功分娩1正常男嬰進(jìn)行資料分析，為卵母細(xì)胞和胚胎多次冷凍后的臨床應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般情況

患者33歲, 婚后9年，未避孕未孕7年于2015年3月6日來本研究中心的生殖中心就診?；颊咝陨钫?，月經(jīng)規(guī)律，基礎(chǔ)性激素檢查：卵泡刺激素(FSH)11.72 mU/ml，黃體生成素(LH)16.28 mU/ml，雌二醇(E2)48 pg/ml，催乳激素(PRL)8.12 ng/ml，睪酮(T)0.59 ng/ml。B超監(jiān)測自行排卵。其丈夫3次行精液常規(guī)分析，兩次離心沉淀鏡下見不動精子0～1條/HP。另一次未見精子，附睪穿刺亦未取得精子。經(jīng)中藥治療數(shù)月后復(fù)查，離心沉淀鏡檢見活精子0～3條/HP，不動精子0～3條/HP。染色體核型分析為46,XY。因男方重度少弱精子癥，擬行卵泡漿內(nèi)單精子注射(ICSI)助孕。采用短效促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a,商品名:醋酸曲普瑞林注射液，成都天臺山制藥有限公司)長方案降調(diào)；用重組人促卵泡激素，F(xiàn)SH(果納芬，默克雪蘭諾公司,德國) 聯(lián)合重組人絨毛膜促性腺激素，hCG(艾澤，默克雪蘭諾公司,德國)促排卵。2015年6月10日經(jīng)陰道B超引導(dǎo)下穿刺獲取卵母細(xì)胞10枚，成熟卵母細(xì)胞(MⅡ)9枚，取卵當(dāng)天男方3次取精經(jīng)離心沉淀均未發(fā)現(xiàn)精子，患者拒絕附睪/睪丸取精。因本生殖中心無可供精的凍存精液, 患者夫婦也無接受供精的準(zhǔn)備。征得同意后, 凍存全部成熟的MⅡ卵母細(xì)胞9枚。

1.2 卵子凍融及復(fù)蘇方法

1.2.1 卵子冷凍 采用玻璃化冷凍冷凍試劑盒(KITAZATO公司，日本)，冷凍液分為平衡液 (ES)和玻璃化溶液 (VS)，使用前于室溫(25℃)平衡30 min。將取卵 -胚胎處理液(G-mops-plus，Vitrolife公司，瑞典)2ml加入3001培養(yǎng)皿中，把已脫顆粒的成熟卵子移入，漂洗去油，在3003培養(yǎng)皿的皿蓋配置G-mops-plus及ES微滴待用，其中G-mops-plus微滴1個，ES液滴3個(ES1、ES2、ES3)，各約20μl，G-mops-plus液滴與ES1、ES2盡量等大且成等邊三角形排列。漂洗去油后的卵子首先移至G-mops-plus液滴。1 min后將G-mops-plus與ES1連線，計時2 min；2 min后在G-mops-plus與ES1連線的中點與ES2再次連線，計時2 min；最后將卵子移至ES3液滴放置5 min。同時在3003皿蓋繼續(xù)配置VS液滴3個，每滴約10μl。5 min后將卵子從ES3中移至VS液滴，依次進(jìn)行漂洗，至最后一個VS液滴停留，準(zhǔn)備裝載，在VS液中的總時間需大于90秒，小于120秒，裝載體積小于2μl，裝載后迅速將載體投入液氮。

1.2.2 卵子解凍 采用玻璃化冷凍解凍試劑盒(日本KITAZATO公司)，解凍使用解凍液(TS)、稀釋液 (DS)和洗液(WS-1/WS-2)。使用前，將TS于37℃平衡30 min，其他溶液于室溫(25℃)平衡30 min。將卵子從液氮中取出，浸入TS中，1 min后將卵子轉(zhuǎn)移至DS表面，3min后，再將卵子依次置于WS-1和WS-2中各5 min，然后將卵子轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1.3 胚胎凍融及移植方法

因為男方成熟活動精子獲取極其困難(有不可預(yù)見性)，所以未同步行女方內(nèi)膜準(zhǔn)備，2015年7月30日在獲得了男方的成熟活動精子后，遂將女方的凍存卵子用特殊方法進(jìn)行解凍復(fù)蘇，并對成熟的卵子進(jìn)行了顯微注射受精：解凍9枚MⅡ卵子，其中7枚存活，行ICSI共6枚MⅡ卵。授精16～18 h后觀察受精情況：2PN 5枚，未受精1枚。第3天卵裂率為100%，最后，按照治療計劃，冷凍一枚D3優(yōu)胚和一枚第7天囊胚。2015年9月底擬自然周期方案行內(nèi)膜準(zhǔn)備，因當(dāng)月卵泡發(fā)育不佳加用尿促性素(HMG)促排卵治療，于排卵后第3天進(jìn)行冷凍胚胎復(fù)蘇并在培養(yǎng)箱培養(yǎng)1天，于第4天行胚胎移植。2015年10月13日行凍融胚胎復(fù)蘇移植1枚，胚胎復(fù)蘇后級別為6細(xì)胞1級。本中心應(yīng)用日本KITAZATO公司玻璃化冷凍復(fù)蘇試劑。具體操作方法見試劑盒說明書。

2 結(jié)果

移植后用黃體酮膠囊150 mg，bid，黃體支持治療至妊娠10周。移植后14 d查血hCG 2081 mU/ml，取得生化妊娠。移植28 d行B超監(jiān)測宮內(nèi)可見17mm×16mm孕囊，內(nèi)見胎芽、卵黃囊及原始心血管搏動。移植42 d行B超監(jiān)測宮內(nèi)可見54mm×50mm×35mm孕囊，內(nèi)見卵黃囊，頭臀長36 mm，胎心搏動好?；颊咴衅跓o特殊情況發(fā)生，2016年6月22日孕39+6周剖宮產(chǎn)1男嬰，體重3200g，身長49cm，Apgar評分10分，外觀無異常。

3 討論

卵母細(xì)胞冷凍保存具有重要的社會價值和現(xiàn)實意義。2013年美國生育年會頒布的指導(dǎo)原則也表明，目前成熟卵子的冷凍已不再局限于實驗研究[1]。中國放開二孩政策以后，國內(nèi)的卵子冷凍應(yīng)用前景更加廣闊。卵子冷凍技術(shù)進(jìn)展較為緩慢，主要是由于人卵母細(xì)胞是體內(nèi)最大的細(xì)胞，對水和冷凍保護(hù)劑的滲透性較差，細(xì)胞內(nèi)的紡錘體、微管、微絲和大量的細(xì)胞質(zhì)對溫度高度敏感，易受到冰晶和冷凍保護(hù)劑的損傷[2]。卵母細(xì)胞內(nèi)含大量水分，加之體表比例大和胞膜滲透性等特性，在低溫冷凍、復(fù)溫過程中容易形成冰晶，導(dǎo)致紡錘體受損造成細(xì)胞致命的損傷[3-4]。卵母細(xì)胞的凍存方法目前主要有程序化慢速冷凍和玻璃化冷凍。玻璃化冷凍技術(shù)從1995年開始用于人卵子的冷凍保存，因其能更好地保持卵子的生理功能，并獲得更良好的妊娠結(jié)局，逐漸被廣泛認(rèn)可[5]。

與新鮮卵母細(xì)胞相比，玻璃化冷凍卵子的受精率、卵裂率和臨床妊娠率無統(tǒng)計學(xué)差異[6]。秦文松等[7]回顧分析在取卵日因男方因素行卵子玻璃化冷凍的6例患者，解凍卵子后行ICSI，6例患者共解凍卵子52枚，復(fù)蘇卵子31枚，復(fù)蘇率59.62%。對31枚卵子行ICSI，受精21枚，受精率67.74%，形成胚胎20枚，卵裂率95.24%，5個移植周期共移植胚胎9枚，臨床妊娠2例，臨床妊娠率40%。耿潔等[8]報道了5 例患者取卵日實施全部冷凍保存的卵子，共復(fù)蘇卵子35枚，存活24枚例，復(fù)蘇率68.57%；24枚MⅡ卵子行ICSI，受精22枚，受精率91.67%；形成19枚胚胎，卵裂率86.36%，獲可用有效胚胎16枚。5個移植周期移植胚胎13枚，臨床妊娠2例，分娩2個健康嬰兒，胚胎種植率15.38%，活產(chǎn)率40%。Cobo[6]、Trokoudes等[9]和Sole等[10]的研究通過用玻璃化冷凍保存的卵子供卵助孕與同期新鮮卵子助孕結(jié)局比較發(fā)現(xiàn)：冷凍卵子助孕獲得的優(yōu)胚率、種植率及妊娠率較新鮮卵子無差異。關(guān)于出生缺陷風(fēng)險，在2009年Noyes等[11]分析了在過去的20多年， 289個玻璃化冷凍卵母細(xì)胞出生嬰兒的資料，發(fā)現(xiàn)與同期自然分娩的嬰兒比較，二者的出生缺陷率之間并無顯著性差異。表明卵子冷凍/解凍后的妊娠以及分娩的子代沒有明顯增加圍產(chǎn)期風(fēng)險。因此，認(rèn)為卵母細(xì)胞玻璃化冷凍是一種相對安全有效的技術(shù)[12]。

2006年，世界首例玻璃化冷凍的“三凍”嬰兒在我國北京大學(xué)第三醫(yī)院[13]出生。該項技術(shù)的成功標(biāo)志著卵子冷凍技術(shù)難關(guān)已獲得成功突破，但至今為止報道例數(shù)不多。2014年倪豐等[14]報道的1 例凍卵凍胚試管嬰兒誕生。2015年徐清華等[15]報道的1例凍卵凍胚試管嬰兒移植成功妊娠。多次冷凍行IVF-ET后獲得妊娠出生健康嬰兒的報道亦表明：隨著冷凍技術(shù)的不斷改良和完善，多次冷凍對卵母細(xì)胞和胚胎的損傷是有限的，卵母細(xì)胞和胚胎復(fù)蘇后仍可具備較好的發(fā)育潛力，特別是如果凍融卵子在行ICSI后能形成優(yōu)胚，則更有可能在多次冷凍后實現(xiàn)妊娠并出生健康嬰兒。自2011年起本生殖中心開始進(jìn)行卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的研究，至今共進(jìn)行了9例行玻璃化冷凍卵母細(xì)胞的復(fù)蘇，復(fù)蘇后行ICSI助孕，有3例獲得妊娠(1例為左輸卵管妊娠，2例活產(chǎn)分娩)，嬰兒隨訪未見異常。本例采用玻璃化冷凍卵子復(fù)蘇率為77.8%，受精率為88.3%，卵裂率為100%，達(dá)到與新鮮卵子一致的效果。本例凍卵、凍胚試管嬰兒成功誕生，為卵母細(xì)胞及胚胎多次冷凍的臨床應(yīng)用提供一定的積累和參考。

[1] Practice Committees of American Society for Reproductive Medicine. Society for Assisted Reproductive Technology. Mature oocyte cryopreservation: a guideline[J]. Fertil Steril, 2013, 99(1):37-43.

[2] 李媛. 人類輔助生殖實驗技術(shù)[M]. 第1版. 北京：科學(xué)出版社, 2008:170-182.

[3] Shaw JM, Oranratnachai A, Trounson AO. Fundamental cryobiology of mammalian oocytes and ovarian tissue [J]. Theriogenology, 2000, 53(1):59-72.

[4] Baka SG, Toth TL, Veeck LL, et al. Evaluat ion of the spindle apparatus of in-vitro matured human oocytes following cryopreservation[J]. Hum Reprod, 1995, 10(7):1816-1820.

[5] Nagy ZP, Chang CC, Shapiro DB, et al．Clinical evaluation of the efficacy of an oocyte donation program using egg cryo-banking[J]．Fertil Steril, 2009, 8, 92(2):520-526．

[6] Cobo A, Diaz C. Clinical application of oocyte vitrification: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials[J]. Fertil Steril, 2011, 96(2):277-285.

[7] 秦文松，劉英，秦輝靈，等. 人卵母細(xì)胞玻璃化冷凍技術(shù)在輔助生殖中的應(yīng)用[J]. 中國性科學(xué)，2015, 2:93-95.

[8] 耿潔，胡玉琴，劉蘭蘭. 卵子玻璃化冷凍在體外受精-胚胎移植取精失敗周期中的應(yīng)用[J]. 實用醫(yī)院臨床雜志，2014, 1:156-157.

[9] Trokoudes KM, Pavlides C, Zhang X.Comparison outcome of fresh and vitrified donoroocytes in an egg-sharing donation program[J]. Fertil Steril， 2011, 95(6):1996-2000.

[10] Sole M, Santalo J, Boada M, et al.How does vitrification affect oocyte viability in oocyte donation cycles? A prospective study to compare outcomes achieved with fresh versus vitrified sibling oocytes[J]. Hum Reprod，2013,28(8):2087-2092.

[11] Noyes N, Porcu E, Borini A. Over 900 oocytecryo preservation babies born with no apparent increase in congenital anomalies[J].Reprod Biomed Online，2009;18(6):769-776.

[12] Zhang L, Yan LY, Zhi X, et al. Female fertility: is it safe to "freeze?"[J]. Chin Med J (Engl), 2015, 128(3):390-397.

[13] 陳貴安, 蔡學(xué)泳, 廉穎, 等. 玻璃化冷凍成熟卵母細(xì)胞經(jīng)解凍精液單精子注射受精并胚胎凍融及移植妊娠成功[J]. 中華婦產(chǎn)科雜志, 2006, 4(41):217-218.

[14] 倪豐, 汪存利, 姜宏, 等. 凍融卵母細(xì)胞顯微授精后凍融胚胎移植成功并分娩一例報道[J]. 生殖醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 23(8):676-678.

[15] 徐清華, 張 敏, 常秀峰, 等. 凍融卵母細(xì)胞顯微受精后凍融胚胎移植成功妊娠一例[J]. 解放軍醫(yī)藥雜志, 2015, 5(27):21-22.

[責(zé)任編輯：王麗娜]

廣西壯族自治區(qū)計劃生育委員會科研項目(桂人口計生研1109，桂人口計生研1102)；廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生和計劃生育委員會科研課題(Z2016374)；廣西自然科學(xué)基金項目(2014GXNSFBA118199)

2016-08-16

2016-12-23

*通信作者： 59075287@qq.com