粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)靈菌紅素的碳源分析、菌種誘變及動(dòng)力學(xué)

榮廣健，張佑紅，陳艷，諶頡，黃萌，周鋒

（1武漢工程大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430073；2武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，綠色化工過(guò)程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430073）

粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)靈菌紅素的碳源分析、菌種誘變及動(dòng)力學(xué)

榮廣健1，張佑紅2，陳艷2，諶頡2，黃萌2，周鋒2

（1武漢工程大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430073；2武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，綠色化工過(guò)程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430073）

使用流式細(xì)胞儀研究了不同碳源對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌ZSG新陳代謝的影響，發(fā)現(xiàn)不同碳源導(dǎo)致ZSG的DNA含量、細(xì)胞內(nèi)部顆粒密度、表面粗糙度和細(xì)胞大小在發(fā)酵過(guò)程中呈現(xiàn)有差異的變化。對(duì)ZSG進(jìn)行復(fù)合誘變篩得一株穩(wěn)定突變菌株ZSG7，在250 ml搖瓶和5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，其靈菌紅素（PG）產(chǎn)量比出發(fā)菌株分別提高了62.5%和269%。對(duì)ZSG7進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化后PG產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了100%。對(duì)ZSG7發(fā)酵進(jìn)行溶氧分段控制模式調(diào)控后PG產(chǎn)量比DO調(diào)控前提高了30.9%。對(duì)ZSG7發(fā)酵進(jìn)行恒定pH調(diào)控后比pH調(diào)控前提高了35.9%。對(duì)ZSG7發(fā)酵進(jìn)行補(bǔ)料組分優(yōu)化后比補(bǔ)料前提高了47.6%?；贚ogistic方程和Luedeking-Piret方程建立了恒定pH7分批發(fā)酵和補(bǔ)料分批發(fā)酵的菌體生長(zhǎng)模型和PG合成模型。擬合模型參數(shù)后，模型可以合理地描述恒定pH7分批發(fā)酵和補(bǔ)料分批發(fā)酵的過(guò)程。

流式細(xì)胞儀；碳源；靈菌紅素；動(dòng)力學(xué)模型；誘變；優(yōu)化；發(fā)酵

引 言

PG是一大類(lèi)具有甲氧基吡咯環(huán)骨架結(jié)構(gòu)的天然色素[1]。PG對(duì)多種癌細(xì)胞具有抑制作用[2-4]，還具有免疫抑制[5]、抗細(xì)菌[6]、抗真菌[7-8]、抗瘧疾[9]、除藻[10]、染色[11]等多種功能。PG對(duì)酸堿性敏感，在堿性條件下不穩(wěn)定容易分解，在酸性條件下可較長(zhǎng)時(shí)間保存[12]。PG是一種可以被粘質(zhì)沙雷氏菌等多個(gè)種屬的微生物合成出來(lái)的次級(jí)代謝產(chǎn)物[13-15]。發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成過(guò)程具有一定的規(guī)律性，構(gòu)建發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型可對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成過(guò)程進(jìn)行深入研究[16]。目前流式細(xì)胞儀在微生物檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[17]，但對(duì)PG發(fā)酵檢測(cè)分析的研究還比較少，同時(shí)關(guān)于PG發(fā)酵最佳pH的研究主要是初始pH，發(fā)酵中恒定pH的研究也比較少。本文首先使用流式細(xì)胞儀對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌利用不同碳源時(shí)的生長(zhǎng)代謝情況進(jìn)行分析，然后通過(guò)菌種誘變、培養(yǎng)基優(yōu)化和在5 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)工藝優(yōu)化來(lái)提高PG產(chǎn)量，最后進(jìn)行發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模擬，為以后PG工業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

粘質(zhì)沙雷氏菌株，由本實(shí)驗(yàn)室自糖化車(chē)間酸性土壤中篩選獲得并保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC NO: M 209195），菌株編號(hào)ZSG[18]。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

主要儀器：賽多利斯生物反應(yīng)器，BIOSTAT A plus，購(gòu)于廣州寶信捷生物應(yīng)用設(shè)備有限公司；振蕩培養(yǎng)箱，SPX-250B-D，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；超凈工作臺(tái)，AIR TECH，蘇凈集團(tuán)安泰公司；高速離心機(jī)，TG18M，臺(tái)式多管低速離心機(jī)，TDZ5-WS，長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，UV-1800，蘇州島津儀器有限公司；流式細(xì)胞儀，F(xiàn)ACS Calibur，美國(guó)BD公司。

1.3 材料與溶液配制

瓊脂粉（強(qiáng)度＞1300 g·cm?2），牛肉浸膏，蛋白胨，酵母粉，魚(yú)粉蛋白胨，胰蛋白胨均為生化試劑BR。

蔗糖，甘油，油酸，可溶性淀粉，尿素，硝酸銨，無(wú)水氯化鈣，無(wú)水氯化鎂，氯化鉀，十二水合磷酸氫二鉀，氫氧化鈉，濃鹽酸，硫酸鈉，二甲亞砜（DMSO），十二烷基磺酸鈉（SDS），吐溫-80均為分析純。

固體培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，瓊脂粉2%，NaCl 0.5%。

種子培養(yǎng)基：蔗糖0.5%，蛋白胨1.5%，NaCl 0.5%，MgCl20.25%，吐溫-80 1.0%。

發(fā)酵培養(yǎng)基：在種子培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上調(diào)整。

PBS緩沖液：0.27 g KH2PO4，1.42 g Na2HPO4，8 g NaCl，0.2 g KCl，加去離子水約800 ml，充分?jǐn)嚢枞芙夂蠹尤霛恹}酸調(diào)節(jié)pH至7.2，定容至1 L，高溫高壓滅菌后室溫保存。

1.4 培養(yǎng)方法

保藏菌種經(jīng)活化后接入裝有種子培養(yǎng)基的 250 ml錐形瓶中，裝液量為50 ml，將錐形瓶置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中29℃、160 r·min?1條件下培養(yǎng)24 h，按 10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，29℃、160 r·min?1下培養(yǎng)。

1.5 菌體干重和PG濃度測(cè)量方法

本實(shí)驗(yàn)采用陳艷等[19]測(cè)量菌體干重和PG濃度的方法進(jìn)行測(cè)量。

1.6 DNA含量分布檢測(cè)

取發(fā)酵液0.5 ml于5 ml流式管中，2000 r·min?1離心5 min，棄上清。用PBS緩沖液清洗菌體，離心棄PBS，重復(fù)兩遍。沉淀中緩慢加入1 ml 70%的冰乙醇，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破膜與固定，樣品保藏于?20℃冰箱中凍存過(guò)夜。分析時(shí)，離心棄上清，PBS溶液清洗兩遍。加入125 μl的試劑A（Trypsin buffer），20～25℃下反應(yīng)10 min，降解細(xì)胞組織碎片，再加入 100 ml試劑 B（Trypsin inhibitor and Rnase buffer），20～25℃下反應(yīng) 10 min，降解細(xì)胞中的RNA，最后再加入125 μl的試劑C（PI染料）進(jìn)行DNA染色，2～8℃避光條件下孵育10 min后即可上 FCM 檢測(cè)。流式檢測(cè)圖譜采用 Cell Quest和Modifit軟件分析。

1.7 菌種誘變與篩選

先將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期的粘質(zhì)沙雷氏菌用體積分?jǐn)?shù)1.0%的硫酸二乙酯處理20 min（終止反應(yīng)為加入 25%的硫代硫酸鈉溶液），然后用紫外線照射20 s，最后稀釋涂平板，在恒溫29℃下培養(yǎng)48 h，挑取單菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，篩選PG產(chǎn)量最高且穩(wěn)定的突變菌株。

1.8 突變菌株發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

采用單因素實(shí)驗(yàn)和 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。

1.9 突變菌株溶氧分段控制模式調(diào)控

培養(yǎng)條件：5 L發(fā)酵罐中裝液量為3 L，培養(yǎng)溫度29℃，不調(diào)pH，發(fā)酵周期為66 h。實(shí)驗(yàn)設(shè)置4組DO分段控制模式（如圖5）：（A）發(fā)酵全程均為轉(zhuǎn)速200 r·min?1，通氣比1 vvm，作為對(duì)照；（B）第0～12 h轉(zhuǎn)速200 r·min?1，通氣比1 vvm，第12～24 h DO為10%，將DO偶聯(lián)轉(zhuǎn)速，系統(tǒng)自動(dòng)將DO恒定，第24 h以后控制DO為30%；（C）第0～12 h DO為10%，第12～24 h DO為30%，第24 h以后DO為60%；（D）第0～12 h DO為30%，第12～24 h DO為60%，第24 h以后DO為90%。在發(fā)酵過(guò)程中，適當(dāng)調(diào)節(jié)通氣量，保證轉(zhuǎn)速處于200～500 r·min?1之間。

1.10 突變菌株恒定pH發(fā)酵調(diào)控

使用突變菌株在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，裝液量3 L，接種量10%，29℃，發(fā)酵周期66 h，DO為前面最優(yōu)條件。發(fā)酵設(shè)置5組變量：不調(diào)pH（作為對(duì)照），恒定pH5，恒定pH6，恒定pH7，恒定pH8。pH使用pH探頭實(shí)時(shí)監(jiān)控，由發(fā)酵系統(tǒng)軟件通過(guò)發(fā)酵系統(tǒng)主機(jī)的蠕動(dòng)泵使用1 mol·L?1鹽酸溶液和 1 mol·L?1氫氧化鈉溶液自動(dòng)調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH，從而實(shí)現(xiàn)恒定pH。

1.11 突變菌株補(bǔ)料調(diào)控

在最佳恒定pH下進(jìn)行補(bǔ)料培養(yǎng)，設(shè)置3種補(bǔ)料組分：（a）0.5%油酸、0.5%蛋白胨和0.5%吐溫-80；（b）1%蛋白胨和0.5%吐溫-80；（c）1%油酸和0.5%吐溫-80。流加方式為使用發(fā)酵系統(tǒng)自帶的蠕動(dòng)泵蠕動(dòng)流加。

1.12 發(fā)酵過(guò)程動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)處理

在發(fā)酵過(guò)程中定時(shí)取樣，測(cè)定樣品的菌體干重、PG含量，采用Origin 8.0軟件對(duì)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)進(jìn)行求解。

2 結(jié)果與分析

2.1 使用流式細(xì)胞儀分析不同碳源對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)代謝調(diào)控的影響

本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了4組實(shí)驗(yàn)，比較不同物質(zhì)作碳源時(shí) ZSG的生長(zhǎng)代謝情況。發(fā)酵培養(yǎng)基配方：碳源0.5%，蛋白胨1.5%，NaCl 0.5%，MgCl20.25%，吐溫-80 1.0%，4組碳源分別為蔗糖、葡萄糖、牛肉膏、甘油。圖1是ZSG利用不同碳源時(shí)的菌體生長(zhǎng)和PG合成曲線。使用流式細(xì)胞儀對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌利用不同碳源時(shí)的生長(zhǎng)代謝進(jìn)行檢測(cè)分析，其細(xì)胞熒光（FL2-A）信號(hào)以及側(cè)向散射光（SSC）信號(hào)、前向散射光（FSC）信號(hào)分布如圖2（a）、（b）、（c）所示。FL2-A信號(hào)反映了細(xì)胞中DNA相對(duì)含量，信號(hào)強(qiáng)度越大，說(shuō)明DNA含量越高。SSC信號(hào)反映了顆粒性質(zhì)和細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)。細(xì)菌表面有細(xì)胞壁，表面比較光滑而粗糙度較小，當(dāng)細(xì)菌長(zhǎng)有纖毛時(shí)，細(xì)菌表面粗糙度顯著變大。細(xì)菌內(nèi)部顆粒和表面纖毛共同影響著SSC信號(hào)，推測(cè)表面纖毛起的作用比細(xì)菌內(nèi)部顆粒大。FSC信號(hào)表示相對(duì)細(xì)胞大小。

圖1 碳源對(duì)菌體干重和PG產(chǎn)量影響Fig.1 Effect of carbon source on DCW and PG production

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Test results of flow cytometry

第0 h時(shí)，發(fā)酵開(kāi)始，菌種被加入發(fā)酵罐，開(kāi)始適應(yīng)新環(huán)境，4組均處于遲滯期；FL2-A信號(hào)大多位于0～100道，極少量為100～200道，細(xì)胞中DNA含量比較低；絕大部分SSC信號(hào)處于0～50道，細(xì)胞顆粒還很少，纖毛還沒(méi)有長(zhǎng)出；不同碳源下細(xì)胞大小有所不同，但大部分FSC信號(hào)處于25～50道之間。

第4 h時(shí)，蔗糖組、葡萄糖組、甘油組均進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；蔗糖組和牛肉膏組FL2-A信號(hào)圖形都比較扁平，F(xiàn)L2-A信號(hào)迅速增長(zhǎng)，表明DNA積累很快，甘油組FL2-A信號(hào)有少許增強(qiáng)，表明細(xì)胞中DNA含量不是很高，DNA復(fù)制不是很快，葡萄糖組幾乎沒(méi)有變化，可能是由于葡萄糖濃度過(guò)大反饋抑制了細(xì)胞中DNA合成；蔗糖組和牛肉膏組SSC信號(hào)幾乎未變化，說(shuō)明此時(shí)細(xì)胞內(nèi)部顆粒密度比較低，纖毛還沒(méi)有長(zhǎng)出，葡萄糖組和甘油組中處于0～50道上的 SSC信號(hào)細(xì)胞比例明顯縮小，有一部分SSC信號(hào)移動(dòng)到50～300道上，可能是由于細(xì)胞分裂和DNA復(fù)制比較慢，細(xì)胞中滯留一些顆粒；牛肉膏組細(xì)胞大小發(fā)生明顯變化，F(xiàn)SC信號(hào)圖變得扁平，波峰幾乎消失，大部分細(xì)胞DNA含量高而細(xì)胞還未分裂，故而細(xì)胞體積偏大。

第8 h時(shí)，4組均進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；蔗糖組和牛肉膏組FL2-A信號(hào)開(kāi)始降低，細(xì)胞中DNA含量明顯減少，大部分細(xì)胞是剛分裂出來(lái)的，葡萄糖組FL2-A信號(hào)則是從低道數(shù)向高道數(shù)移動(dòng)，說(shuō)明細(xì)胞中DNA含量緩慢增加，甘油組FL2-A信號(hào)圖形向低道數(shù)小范圍移動(dòng)，表明DNA含量小范圍下降；蔗糖組、葡萄糖組和甘油組SSC信號(hào)增加，細(xì)胞內(nèi)部顆粒增加，纖毛開(kāi)始長(zhǎng)出，牛肉膏組SSC信號(hào)雖然向高道數(shù)移動(dòng)，但是高道數(shù)SSC信號(hào)較少，推測(cè)纖毛還沒(méi)長(zhǎng)出；牛肉膏組FSC信號(hào)逐漸集中到25～50道之間，但是變化較小，表明細(xì)胞體積逐漸回復(fù)到原來(lái)大小。

第12 h時(shí)，蔗糖組PG開(kāi)始合成，而葡萄糖組、牛肉膏組和甘油組只有微量合成；蔗糖組FL2-A信號(hào)增強(qiáng)，DNA相對(duì)含量增加，葡萄糖組和甘油組FL2-A信號(hào)降低，表明細(xì)胞完成分裂，細(xì)胞中DNA含量比較低，牛肉膏組FL2-A信號(hào)變化不大；蔗糖組SSC信號(hào)從第12～36 h緩慢增強(qiáng)，這期間細(xì)胞從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期進(jìn)入到穩(wěn)定期，隨著細(xì)胞數(shù)目的增多，細(xì)胞分裂減慢至逐漸停止，個(gè)體為生存逐漸積累顆粒物質(zhì)，增加纖毛來(lái)加強(qiáng)細(xì)菌群體交流；甘油組SSC信號(hào)變化在第12～36 h與蔗糖組相似，只是甘油組SSC信號(hào)要稍強(qiáng)，這期間甘油組仍然處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且甘油組中細(xì)胞分裂比較緩慢；葡萄糖組SSC信號(hào)從第12～30 h緩慢降低，說(shuō)明隨著細(xì)胞分裂細(xì)胞內(nèi)部顆粒和表面纖毛有些許減少。

第24 h時(shí)，蔗糖組和牛肉膏組已進(jìn)入穩(wěn)定期，葡萄糖組和甘油組仍處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，4組都在合成 PG，但蔗糖組產(chǎn)量最大，葡萄糖組其次，甘油組再次，牛肉膏組最?。徽崽墙M大部分FL2-A信號(hào)處于低道數(shù)上，這是因?yàn)榇蟛糠旨?xì)胞為剛剛分裂出來(lái)的細(xì)胞，新細(xì)胞中DNA含量比較低，牛肉膏組FL2-A信號(hào)圖形幾乎沒(méi)有變化，葡萄糖組FL2-A信號(hào)從第24～30 h重復(fù)了從第8～12 h的熒光動(dòng)向，表明這期間細(xì)胞又經(jīng)歷了一次細(xì)胞分裂，但是時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng)，甘油組FL2-A信號(hào)增強(qiáng)，DNA含量細(xì)微增加；牛肉膏組FSC信號(hào)基本沒(méi)有變化。

第30 h時(shí)，葡萄糖組和甘油組仍處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，4組合成PG的速度下降，但產(chǎn)量次序不變；蔗糖組FL2-A信號(hào)降低，DNA含量細(xì)微減少，甘油組FL2-A信號(hào)仍在增加；牛肉膏組SSC信號(hào)開(kāi)始增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)部顆粒開(kāi)始積累，纖毛開(kāi)始生長(zhǎng)。

第 36 h時(shí)，葡萄糖組和甘油組開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期，蔗糖組和甘油組仍在慢速合成 PG，葡萄糖組和牛肉膏組停止合成 PG，但產(chǎn)量仍次序不變；蔗糖組出現(xiàn)一些較高FL2-A信號(hào)，可能是蔗糖組細(xì)胞適應(yīng)穩(wěn)定期后二次生長(zhǎng)，葡萄糖組FL2-A信號(hào)進(jìn)一步降低，甘油組FL2-A信號(hào)則向25～75道集中，DNA含量范圍縮小，細(xì)胞趨于保持現(xiàn)有狀態(tài)；葡萄糖組和牛肉膏組SSC信號(hào)進(jìn)一步增強(qiáng)，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)部顆粒積累不少，纖毛長(zhǎng)出很多。

第48 h時(shí)，蔗糖組和甘油組已停止合成PG；牛肉膏組出現(xiàn)一些較強(qiáng)的FL2-A信號(hào)，可能是細(xì)胞在穩(wěn)定期后進(jìn)行二次生長(zhǎng)，蔗糖組高道數(shù)FL2-A信號(hào)減少，說(shuō)明二次生長(zhǎng)減緩，葡萄糖組FL2-A信號(hào)向25～75道集中，DNA含量范圍縮小，細(xì)胞趨于保持現(xiàn)有狀態(tài)；4組SSC信號(hào)明顯降低，細(xì)胞內(nèi)部顆粒和表面纖毛減少。

綜上所述，菌體干重大小依次為牛肉膏組＞蔗糖組＞甘油組＞葡萄糖組，PG產(chǎn)量大小依次為蔗糖組＞葡萄糖組＞甘油組＞牛肉膏組，使用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)菌個(gè)體分析發(fā)現(xiàn)粘質(zhì)沙雷氏菌利用不同碳源時(shí)其DNA含量、細(xì)胞顆粒密度、表面粗糙度和細(xì)胞大小呈現(xiàn)不同變化。牛肉膏組細(xì)胞中DNA含量變化比較快，細(xì)胞顆粒密度增加和纖毛生長(zhǎng)比較遲緩，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)細(xì)胞體積偏大，細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖很快，推測(cè)由于牛肉膏中包含碳氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子等，營(yíng)養(yǎng)豐富，牛肉膏組細(xì)胞繁殖過(guò)快，抑制了與生長(zhǎng)繁殖無(wú)關(guān)的次級(jí)代謝如纖毛合成和PG合成，結(jié)果菌體干重最大，PG產(chǎn)量極低。PG合成是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期啟動(dòng)的，牛肉膏組PG產(chǎn)量太少可能與PG前體的合成在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期被抑制有關(guān)。葡萄糖組菌體干重最小，PG產(chǎn)量也不高，可能是由于葡萄糖是比較容易利用的碳源，其分解產(chǎn)物阻遏細(xì)菌利用其他碳源，進(jìn)而細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖比較慢，同時(shí)PG合成緩慢，產(chǎn)量不高。甘油組菌體干重和PG產(chǎn)量均排第三，分析發(fā)現(xiàn)甘油組細(xì)胞中DNA含量、細(xì)胞顆粒密度、表面粗糙度和細(xì)胞大小等變化緩慢，細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖也較慢，PG產(chǎn)量最終比較低。蔗糖組菌體干重僅次于牛肉膏組，但PG產(chǎn)量最高，通過(guò)流式細(xì)胞儀分析，可以發(fā)現(xiàn)蔗糖組細(xì)胞中DNA含量、細(xì)胞顆粒密度、表面粗糙度和細(xì)胞大小等變化比較協(xié)調(diào)，蔗糖是二糖，沒(méi)有葡萄糖代謝阻遏效應(yīng)，又沒(méi)有牛肉膏那么多營(yíng)養(yǎng)成分，細(xì)胞利用蔗糖效率高，生長(zhǎng)繁殖比較快，但沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)大于分裂現(xiàn)象，也沒(méi)有抑制次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成，所以PG產(chǎn)量很高。在這4種碳源中，未誘變的野生型粘質(zhì)沙雷氏菌 ZSG使用蔗糖作碳源時(shí)菌體量和PG產(chǎn)量都比較高，說(shuō)明蔗糖是這 4種碳源中最合適的。但是野生型粘質(zhì)沙雷氏菌ZSG的PG產(chǎn)量還是太低，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)將對(duì)ZSG進(jìn)行菌種誘變，從根本上提高PG產(chǎn)量。

2.2 菌株誘變及篩選

經(jīng)菌種誘變篩得一株 PG搖瓶產(chǎn)量達(dá)到 0.104 g·L?1的菌株 ZSG7，比出發(fā)菌株的 0.064 g·L?1提高了62.5%，其菌體干重0.93 g·L?1比原始菌株的0.73 g·L?1提高了27.4%。經(jīng)過(guò)10代發(fā)酵培養(yǎng)其PG產(chǎn)量基本不變，說(shuō)明遺傳穩(wěn)定性良好，如表1。在5 L發(fā)酵罐中按相同條件（29℃，200 r·min?1，2 vvm）進(jìn)行培養(yǎng)比較，誘變后ZSG7的最大菌體干重為0.84 g·L?1，與原始菌株的0.92 g·L?1相近，如圖3（a），其PG最高產(chǎn)量為0.1723 g·L?1，比原始菌株的0.0467 g·L?1提高了269%，誘變后PG產(chǎn)量提高很大，如圖3（b）。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。突變株ZSG7使用油酸作為碳源和KCl作為無(wú)機(jī)鹽，其菌體干重和PG產(chǎn)量明顯高于用蔗糖作為碳源和MgCl2作為無(wú)機(jī)鹽時(shí)，即菌株最佳碳源和最佳無(wú)機(jī)鹽發(fā)生改變。由單因素實(shí)驗(yàn)確定最佳碳源是油酸，最佳氮源是蛋白胨，最佳無(wú)機(jī)鹽是 KCl，最佳表面活性劑是吐溫-80。

表1 突變株傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Table 1 Mutant strain ZSG7 generation stability

圖3 原始菌株和突變菌株ZSG7在5 L反應(yīng)器中發(fā)酵結(jié)果比較Fig.3 Comparison of fermentation results in 5 L reactor between original strain and mutant strain ZSG7

圖4 單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果Fig.4 Optimization results of single factor experiments

以菌體干重和PG產(chǎn)量為指標(biāo)，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)油酸、蛋白胨、KCl和吐溫-80進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析如表2、表3和表4。

表2 培養(yǎng)基優(yōu)化的培養(yǎng)基成分和水平Table 2 Medium components and levels of medium optimization

表3 優(yōu)化培養(yǎng)基L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal results of optimization medium

表4 方差分析Table 4 ANOVA

由表3可知：由極差R可得，各因子對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響為B(蛋白胨) ＞A(油酸)＞C (KCl) ＞D (吐溫-80)，以菌體干重為指標(biāo)時(shí)，A3B3C2D1為最佳培養(yǎng)基配方，菌體干重達(dá)到 1.5639 g·L?1；由極差 R′可得，各因子對(duì)PG產(chǎn)量的影響為B (蛋白胨) ＞ A(蔗糖)＞C (KCl) ＞D(吐溫-80) ，以PG產(chǎn)量為指標(biāo)時(shí)，最優(yōu)培養(yǎng)基配方為 A2B3C1D2，PG產(chǎn)量最高為0.2079 g·L?1。

由表4可知，F(xiàn)B＞3.110＞FA＞FC＞FD，表示B因素影響顯著，而A因素、C因素、D因素都不具有顯著影響。綜合考慮極差分析和方差分析，并且經(jīng)過(guò)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得出Serratia marcescens ZSG7產(chǎn)PG培養(yǎng)基最優(yōu)配方為：油酸1.0%，蛋白胨1.5%，無(wú)水氯化鉀0.25%，吐溫-80 1.0%，NaCl 0.5%。在250 ml搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)基優(yōu)化后ZSG7菌體干重（1.19 g·L?1）比優(yōu)化前（0.93 g·L?1）提高了28%，而PG產(chǎn)量（0.2079 g·L?1）則比優(yōu)化前（0.104 g·L?1）提高了100%。

2.4 溶氧分段控制模式對(duì)PG產(chǎn)量的影響

圖5是4組模式的溶氧變化。DO實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6和表5所示，菌體干重為D組＞C組＞B組＞A組（對(duì)照組），PG產(chǎn)量為C組＞B組＞A組（對(duì)照組）＞D組。粘質(zhì)沙雷氏菌合成PG是一個(gè)耗氧的過(guò)程，但并不是DO越大PG產(chǎn)量越高，其中D組每段控制模式的DO均大于C組的，但是PG產(chǎn)量卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于C組，C組PG產(chǎn)量比對(duì)照組提高了30.9%。顯然C組控制模式（第0～12 h DO為10%，第12～24 h DO為30%，第24 h以后DO為60%）為粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵產(chǎn)PG的最佳分段DO控制模式。

圖5 溶氧調(diào)控變化Fig.5 Variation of controlling DO

表5 溶氧分段控制下的發(fā)酵結(jié)果比較Table 5 Comparison of fermentation results by step controlling DO

圖6 溶氧對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響Fig.6 Effect of DO on fermentation

2.5 恒定pH對(duì)PG產(chǎn)量的影響

由圖7可知，當(dāng)不調(diào)pH時(shí)，發(fā)酵液pH會(huì)隨著菌體繁殖發(fā)生變化：在0～4 h，pH基本保持在初始值4.9左右；在4～30 h，發(fā)酵液pH快速上升；第11 h時(shí)，pH為6；第23 h時(shí)，pH為7；第30 h時(shí)，pH為7.5，此時(shí)pH快速上升結(jié)束，以后pH上升極為緩慢，發(fā)酵結(jié)束時(shí)pH才到8.1。這表明該菌生長(zhǎng)繁殖和生產(chǎn)PG是一個(gè)pH變大的過(guò)程。

圖7 粘質(zhì)沙雷氏菌ZSG7發(fā)酵過(guò)程中pH曲線Fig.7 Curve of pH in fermentation process of Serratia marcescens ZSG7

設(shè)恒定pH5、6、7、8和不調(diào)pH（對(duì)照組）時(shí)的菌體生長(zhǎng)速度分別為V5、V6、V7、V8和Vf。由圖8（a）可知，當(dāng)菌體大量繁殖時(shí)，V7＞V6＞V5＞V8。不調(diào)pH時(shí)，在0～4 h，pH基本保持在4.9左右，在4～23 h，pH從4.9快速上升到7，這段時(shí)間菌體大量繁殖改變了發(fā)酵液pH，同時(shí)pH變化也給菌體生長(zhǎng)速度帶來(lái)了影響。由圖8（a）和表6可知，恒定pH6和7時(shí)的最大菌體干重非常接近，明顯高于恒定pH5時(shí)與不調(diào)pH時(shí)，恒定pH8時(shí)V8最小，最大菌體干重也是最小，這表明在恒定pH8時(shí)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖受到了影響。綜合考慮最大菌體干重和菌體生長(zhǎng)速度，菌體生長(zhǎng)繁殖的最適恒定pH是pH7。

圖8 恒定pH對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響Fig.8 Effect of pH on fermentation

設(shè)恒定pH5、6、7、8和不調(diào)pH時(shí)的PG生產(chǎn)速度分別為?5、?6、?7、?8和?f，PG最大產(chǎn)量分別為M5、M6、M7、M8和Mf。由圖8（b）可知，在第12～24 h時(shí)為?7＞?6＞?5＞?8，而在第24～42 h時(shí)為?7＞?6＞?8＞?5，其中恒定pH5發(fā)酵在第24 h以后就不再產(chǎn) PG。最終 PG產(chǎn)量大小依次為M7＞M6＞M8＞M5，如表6。?5與M5低于恒定pH6和7條件下的，這說(shuō)明由于發(fā)酵液（恒定pH5）酸性太高，有關(guān)PG合成的基因和酶受到了抑制，結(jié)果PG生產(chǎn)能力受到嚴(yán)重影響，產(chǎn)量大大降低。而 ?8與M8同樣很低，這說(shuō)明由于在恒定pH8時(shí)細(xì)菌活性比較弱，同時(shí)PG在恒定pH8條件下不穩(wěn)定，容易分解，大量PG在剛剛生產(chǎn)出來(lái)時(shí)就被恒定堿性環(huán)境所分解了。M6比Mf高出11.1%。而不調(diào)pH時(shí)的PG產(chǎn)量在發(fā)酵第12～34 h是高于pH6條件下的，這是因?yàn)椴徽{(diào)pH時(shí)的發(fā)酵液pH在第11～23 h從pH6逐漸上升到pH7，粘質(zhì)沙雷氏菌活性升高，產(chǎn)PG的速度加快，但是隨著發(fā)酵液pH在第23 h后超過(guò)7并繼續(xù)上升，由于PG在堿性條件下容易分解以及粘質(zhì)沙雷氏菌活性因發(fā)酵環(huán)境堿性增強(qiáng)而下降，導(dǎo)致從第23 h開(kāi)始PG生產(chǎn)速度不斷下降，結(jié)果PG最高僅為0.2813 g·L?1。當(dāng)pH為7時(shí)，PG產(chǎn)生速度最快，產(chǎn)量最高，達(dá)到0.3822 g·L?1，比不調(diào)pH高出35.9%。因此，PG生產(chǎn)的最適恒定pH是pH7。

表6 恒定pH下的發(fā)酵結(jié)果比較Table 6 Comparison of fermentation results in constant pH

2.6 補(bǔ)料調(diào)控對(duì)PG產(chǎn)量的影響

在發(fā)酵第42 h時(shí)PG合成基本停止，因此補(bǔ)料起始點(diǎn)定為第42 h，持續(xù)12 h。補(bǔ)料發(fā)酵和分批發(fā)酵均是在pH恒定在7時(shí)進(jìn)行。如圖9所示，3種補(bǔ)料組分與不補(bǔ)料時(shí)相比，菌體干重和PG產(chǎn)量都得到了提升。

由表7可知，不同補(bǔ)料組分下菌體干重和PG產(chǎn)量不同。與不補(bǔ)料的對(duì)照組相比，組分a、b、c的菌體干重分別提高了46.7%、29.4%和23.6%，而其PG產(chǎn)量分別提高了47.6%、33.6%和21.2%。補(bǔ)料組分a可以得到最高的菌體干重和PG產(chǎn)量，因此，采用補(bǔ)料組分a，在第42 h時(shí)補(bǔ)料，補(bǔ)充0.5%油酸、0.5%蛋白胨和 0.5%吐溫-80。如圖 9所示，當(dāng)發(fā)酵78 h后PG含量下降，說(shuō)明PG的分解大于生產(chǎn)，應(yīng)該中止發(fā)酵，因此發(fā)酵周期定為78 h。

圖9 不同補(bǔ)料組分對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響Fig.9 Effect of different fed-batch components on fermentation

表7 補(bǔ)料控制下產(chǎn)PG的發(fā)酵過(guò)程參數(shù)比較Table 7 Comparison of parameters with PG production under fed-batch control

2.7 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型及模擬

2.7.1 菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型及模擬 菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型常用Monod及Logistic方程進(jìn)行構(gòu)建[20]。由圖8和圖9可以看出，菌體生長(zhǎng)是一條S形曲線，本文采用Logistic方程模擬菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型

其中，μm為最大比生長(zhǎng)速率，Xm為最大菌體干重。以t=0，X=X0（X0為初始菌體干重）為條件，將Logistic方程式（1）進(jìn)行積分，可得

對(duì)于補(bǔ)料發(fā)酵，當(dāng)菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后開(kāi)始補(bǔ)料，可以設(shè)定補(bǔ)料前穩(wěn)定期菌體干重為Xm1，則有

將圖8（a）中恒定pH7下的分批發(fā)酵的菌體干重?cái)?shù)據(jù)代入式（2），非線性擬合可得Logistic方程參數(shù)，即X0=0.05 g·L?1，Xm=1.418 g·L?1，μm=0.415 h?1，R2=0.9916，說(shuō)明兩者擬合效果非常好，如圖10（a）。其菌體干重X隨時(shí)間t變化的函數(shù)為

如圖 9（a），補(bǔ)料分批發(fā)酵的菌體生長(zhǎng)曲線為雙S形，需要分段進(jìn)行參數(shù)擬合，第1段S形曲線用式（2）進(jìn)行擬合，參數(shù)為X0=0.05 g·L?1，Xm=1.426 g·L?1，μm=0.403 h?1，R2=0.9831，第2段S形曲線用式（3）進(jìn)行擬合，參數(shù)為 Xm1=1.426 g·L?1，X0=1.57×10?10g·L?1，Xm=0.701 g·L?1，μm=0.448 h?1，R2=0.9815，說(shuō)明擬合效果非常好，如圖10（b）。其菌體干重X隨時(shí)間t變化的函數(shù)為

2.7.2 產(chǎn)物動(dòng)力學(xué)模型及模擬 PG合成起始于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期，與菌體生長(zhǎng)有部分偶聯(lián)，可以使用Luedeking-Piret方程[21]對(duì)其進(jìn)行擬合

當(dāng)a≠0、b=0時(shí)為生長(zhǎng)偶聯(lián)型；a=0、b≠0時(shí)為非生長(zhǎng)偶聯(lián)型；a≠0、b≠0時(shí)為部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型。將式（1）和式（2）代入式（7）后積分可得

圖10 菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的模擬Fig.10 Simulation of cell growth kinetics

圖11 PG生產(chǎn)動(dòng)力學(xué)的模擬Fig.11 Simulation of PG production kinetics

將圖8（b）中恒定pH7下的分批發(fā)酵的PG數(shù)據(jù)和 X0、Xm、μm代入式（8），非線性擬合可得Luedeking-Piret方程參數(shù)為a=0.05，b=0.00832，這證明PG合成是部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型，R2=0.9577，說(shuō)明擬合效果非常好，如圖11（a）。其PG濃度隨時(shí)間t變化的函數(shù)為

補(bǔ)料分批發(fā)酵全程的 X0=0.05 g·L?1，Xm=Xm1+0.707 g·L?1=2.127 g·L?1，μm=0.448 h?1，與圖9（b）中補(bǔ)料發(fā)酵PG數(shù)據(jù)一起代入式（8）進(jìn)行非線性擬合，得a=0.4，b=0.00419，這也證明PG合成是部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型，R2=0.9934，說(shuō)明擬合效果非常好，如圖11（b）。其PG濃度隨時(shí)間t變化的函數(shù)為

3 結(jié) 論

使用流式細(xì)胞儀研究了不同碳源對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌生長(zhǎng)代謝的影響，發(fā)現(xiàn)粘質(zhì)沙雷氏菌利用不同碳源時(shí)其DNA含量、細(xì)胞顆粒密度、表面粗糙度和細(xì)胞大小呈現(xiàn)有差異的變化。未誘變的野生菌ZSG以蔗糖為碳源時(shí)PG產(chǎn)量最高，菌體干重比較高，DNA含量、細(xì)胞顆粒密度、表面粗糙度和細(xì)胞大小等變化比較協(xié)調(diào)，沒(méi)有葡萄糖代謝阻遏效應(yīng)，沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)大于分裂現(xiàn)象，也沒(méi)有抑制次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成。

將野生菌ZSG進(jìn)行誘變，得到一株穩(wěn)定突變菌株ZSG7，在250 ml搖瓶和5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵PG產(chǎn)量分別為0.104 g·L?1和0.1723 g·L?1，與出發(fā)菌株相比分別提高了62.5%和269%。突變菌株的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基是油酸 1.0%，蛋白胨 1.5%，KCl 0.25%，吐溫-80 1.0%，NaCl 0.5%。培養(yǎng)基優(yōu)化后PG搖瓶產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了100%。ZSG7發(fā)酵中最佳溶氧分段控制模式是第0～12 h DO為10%，第12～24 h DO為30%，第24 h以后DO為60%，其PG產(chǎn)量是0.2813 g·L?1，比DO調(diào)控前提高了30.9%。ZSG7發(fā)酵中最佳恒定pH是pH7，其PG產(chǎn)量是0.3822 g·L?1，比pH調(diào)控前提高了35.9%。在ZSG7發(fā)酵中補(bǔ)料0.5%油酸、0.5%蛋白胨和0.5%吐溫-80后PG達(dá)到0.5643 g·L?1，比補(bǔ)料前提高了47.6%。

使用Logistic方程和Luedeking-Piret方程分別對(duì)在恒定pH7下的分批發(fā)酵和補(bǔ)料發(fā)酵的菌體生長(zhǎng)和PG合成進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)分析，用Origin 8.0軟件擬合出了動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)，較好地表現(xiàn)了菌株 ZSG7恒定pH7分批發(fā)酵和補(bǔ)料分批發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)特征。

符 號(hào) 說(shuō) 明

a,b——與菌體生長(zhǎng)相關(guān)的產(chǎn)物合成常數(shù)

M5,M6, M7,M8,Mf——恒定pH5、6、7、8和不調(diào)pH時(shí)的PG最大產(chǎn)量，g·L?1

t——發(fā)酵時(shí)間, h

V5,V6,V7, V8,Vf——恒定pH5、6、7、8和不調(diào)pH時(shí)的菌體生長(zhǎng)速度，g·L?1·h?1

?5,?6,?7, ?8,?f——恒定pH5、6、7、8和不調(diào)pH時(shí)的PG生產(chǎn)速度，g·L?1·h?1

X——菌體干重, g·L?1

Xm——最大菌體干重, g·L?1

Xm1——補(bǔ)料前穩(wěn)定期的最大菌體干重,g·L?1

X0——起始菌體干重, g·L?1

μm——最大比生長(zhǎng)速率, h?1

下角標(biāo)

m——最大

0——發(fā)酵起始

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Carbon source analysis, mutagenesis and kinetics of Serratia marcescens producing prodigiosin

RONG Guangjian1, ZHANG Youhong2, CHEN Yan2, CHEN Jie2, HUANG Meng2, ZHOU Feng2
(1School of Chemistry Environmental Engineering, Wuhan Institute of Technology, Wuhan 430073, Hubei, China;2School of Chemical Engineering and Pharmacy, Wuhan Institute of Technology, Key Laboratory for Green Chemical Process of Ministry of Education, Wuhan 430073, Hubei, China)

The DNA contents, the internal grain densities, the surface roughness and the cell sizes of Serratia marcescens ZSG cells were detected to have different changes by the flow cytometry when ZSG cells were cultivated in the medium with the different carbon sources. Through mutagenizing compoundly ZSG cells, a stable mutant strain ZSG7 was gained, of which the prodigiosin (PG) production in the 250 ml conical flask and in 5 L fermentor were increased by 62.5% and 269% compared with the the original strain yields, respectively. PG production of fermentation with the optimal culture medium in the 250 ml conical flask was increased by 100% compared with the unoptimized. After dissolved oxygen (DO) was optimized by step controlling, the PG production was increased by 30.9% compared with the DO-unoptimized. After constant pH was optimized, the PG production was increased by 35.9% compared with the pH-unoptimized. After the fed-batch components were optimized, the PG production was increased by 47.6% compared with the batch fermentation with constant pH7. The kinetic models about bacteria growth and PG formation of the batch fermentation with constant pH7 and the fed-batch fermentation were built based on the Logistic equation and Luedeking-Piret equation. With the fittingmodel parameters, the models could provide reasonable description for the processes of the batch fermentation with constant pH7 and the fed-batch fermentation.

flow cytometry; carbon source; prodigiosin; kinetic modeling; mutagenesis; optimization; fermentation

Prof. ZHANG Youhong, youhong@aliyun.com

Q 815；TQ 920.6

：A

：0438—1157（2017）01—0244—12

10.11949/j.issn.0438-1157.20160505

2016-04-19收到初稿，2016-10-10收到修改稿。

聯(lián)系人：張佑紅。

：榮廣健（1989—），男，碩士研究生。

湖北省科技廳省重點(diǎn)自然科學(xué)基金（2013CFA101）。

Received date: 2016-04-19.

Foundation item: supported by Hubei Key Natural Science Foundation, China (2013CFA101).