氣相色譜質(zhì)譜法測定醬香型白酒中揮發(fā)性酚類物質(zhì)

李俊，杜楠，袁旭，龐宏宇，郭曉關(guān)，張藝驥

（1.貴州省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗測試中心,農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室（貴陽），貴州貴陽550004；2.貴州省仁懷市黔韻酒業(yè)有限公司，貴州仁懷564500)

氣相色譜質(zhì)譜法測定醬香型白酒中揮發(fā)性酚類物質(zhì)

李俊1，杜楠1，袁旭1，龐宏宇1，郭曉關(guān)1，張藝驥2

（1.貴州省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗測試中心,農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室（貴陽），貴州貴陽550004；2.貴州省仁懷市黔韻酒業(yè)有限公司，貴州仁懷564500)

建立了白酒中揮發(fā)性酚類物質(zhì)的氣相色譜-質(zhì)譜檢測方法。準確量取25.0m L酒樣，利用C18固相萃取柱吸附洗脫后，采用氣相色譜-質(zhì)譜儀定量測定。結(jié)果表明，樣品回收率為80.2%～92.8%，相對標準偏差（RSD,n=7）為3.4%～7.8%；方法在0.02～10.00μg/mL濃度范圍內(nèi)具有很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2≥0.99，檢出限為1.4～4.4μg/L，定量限為4.8～14.8μg/L；該方法具有操作簡單、快速、準確、靈敏的特點，適用于白酒樣品中揮發(fā)性酚的分析檢測。

白酒；固相萃??；揮發(fā)性酚類；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀

白酒是中國傳統(tǒng)的蒸餾酒，為世界六大蒸餾酒之一。醬香型白酒以高粱為主料，小麥制曲，通過獨有的傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)，在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、2,3-二氫苯并呋喃等酚類物質(zhì)[1-3]。酚類化合物的存在，賦予了醬香型白酒的風格和口感，在白酒風味中起著重要作用。有報道認為：4-乙基苯酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚，在酒中的總質(zhì)量濃度小于400μg/L時，它們?yōu)榫频娘L味貢獻了辛香、煙氣和革香韻，當其總質(zhì)量濃度大于620μg/L時，會使酒的酚類特征過于明顯，使酒產(chǎn)生腥異味，掩蓋酒的香味[4-8]。因此對酒中揮發(fā)性酚的檢測就顯得特別重要。

目前對白酒中揮發(fā)酚的檢測方法主要是各種樣品前處理過程結(jié)合氣相色譜、液相色譜檢測。尋思穎等[9]利用CH2Cl2液液萃取，高效液相色譜熒光檢測器法檢測分析白酒中10種揮發(fā)性酚類化合物。朱燕等[10]利用浸入式固相微萃取(DI-SPME)與氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用分析白酒中7種游離揮發(fā)性酚類化合物。Domin guez等[11]利用固相萃取（SPE）結(jié)合氣相色譜（GC-FID）分析了雪利酒中揮發(fā)性酚類化合物。筆者在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，利于固相萃取C18（SPE）柱對酒樣進行吸附，CH2Cl2洗脫定容后，采用氣相色譜質(zhì)譜儀，選擇性離子掃描模式，外標法定量分析。該方法具有簡單、快速、準確、靈敏的特點，適用于白酒樣品中揮發(fā)性酚的分析檢測。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

樣品：實驗使用白酒于銷售市場購買，共9個白酒樣。

表1 9種揮發(fā)性酚類成分保留時間、選擇性掃描離子量

試劑：三氯甲烷（色譜純，美國天地）；愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、2,3-二氫苯并呋喃、對乙基苯酚、苯酚、2-甲酚、對甲苯酚、間甲苯酚（德國DR）。

儀器設(shè)備：氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（Trace GC Ultra-DSQ MS，美國賽默飛世爾）；固相萃取C18柱（1000mg/6m L，美國沃特世）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

依次用水、乙醇5m L活化C18固相萃取柱，準確吸取25.0mL酒樣，加入25.0m L蒸餾水混勻后，以5m L/m in的速度連續(xù)上樣到C18柱，再用氮氣將C18固相萃取柱吹2 m in，完成樣酒在C18柱上的富集，最后用5m L三氯甲烷∶甲苯（v∶v=90∶10）洗脫柱子，收集濾液定容為5m L，供GC-MS分析。

1.2.2 氣質(zhì)色譜聯(lián)用儀條件

色譜柱：DB-FFAP石英毛細柱(50 m×0.250 mm，0.25μm)；升溫程序：100℃保持1.0m in，以6.0℃/m in升溫到200.0℃保持5.0 m in，再以20.0℃/m in升溫到210.0℃保持10.0m in；載氣(He)流速1.0m L/m in；進樣口溫度(230.0℃)；進樣量1.0μL；傳輸線溫度(230℃)；離子源溫度(230℃)；電子轟擊(EI)離子源；電子能量（70 eV）；選擇模式掃描（SIM）定量，掃描離子及定量離子見表1，SIM色譜圖見圖1。

圖1 9種揮發(fā)性酚類成分SIM色譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取方法比較

尋思穎等[9]利用CH2Cl2液液萃取方法對白酒中的酚類物質(zhì)進行了提取和濃縮，結(jié)果表明，有很好的回收率和檢出限，但有機試劑的使用量有60m L；董睿等[12]用利用頂空-固相微萃取的方法對酒樣中的酚類物質(zhì)進行吸附提取，方法具有簡便、快速等特點，但該方法的檢測重現(xiàn)性較差，不適應(yīng)白酒中酚類物質(zhì)的定量分析。本研究研究對象為揮發(fā)酚類化合物，分子結(jié)構(gòu)都具有苯環(huán)，性質(zhì)比較接近，同時需凈化的樣品量較大，分析C18固相萃取柱凈化的原理和過程，實驗選擇使用C18柱富集洗脫凈化樣品。調(diào)整洗脫液的極性，洗脫液極性的強弱決定了樣品的凈化效果，目的是要使用最小量的洗脫液將酚類物質(zhì)洗脫出來。分別以正己烷、乙酸乙酯、三氯甲烷、甲苯、三氯甲烷∶甲苯（v∶v=9∶1）作為洗脫液洗脫添加樣品，同時考慮樣品添加回收率及凈化效果，實驗結(jié)果表明，采用三氯甲烷∶甲苯（v∶v=9∶1）凈化效果最好，當洗脫劑用量為5m L時，樣品添加回收率均在90%以上,因此選用5m L三氯甲烷∶甲苯（v∶v=9∶1）溶劑為洗脫液。

2.2 質(zhì)譜定性定量

用10μg/m L質(zhì)量濃度的酚類混合標準溶液進行50～160質(zhì)量數(shù)全掃描，利用NIT 2011標準庫檢索，確定每個酚類物質(zhì)的保留時間和特征離子碎片，選擇豐度相對較高、質(zhì)荷比較大離子作為質(zhì)譜條件中選擇性離子，質(zhì)譜條件見表1。在相同的條件下進行樣品測定，如果檢出的色譜峰的保留時間與標準品相一致，并且在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中，所選擇的離子均出現(xiàn)，而且所選的離子豐度比與標準品的離子豐度比相一致[13]（相對豐度＞50%，允許±20%偏差；相對豐度＞20%～50%，允許± 25%偏差；相對豐度＞10%～20%，允許±30%偏差；相對豐度≤10%，允許±50%偏差），則可定性判斷樣品中存在這種酚類物質(zhì)。采用峰面積質(zhì)量濃度標準曲線法定量分析。

2.3 方法線性范圍

配制濃度為10.0μg/m L濃度的混合標準溶液，再逐級稀釋配制成梯度濃度標準溶液。標準溶液質(zhì)量濃度為0.02μg/m L、0.20μg/m L、1.00μg/m L、2.00μg/m L、5.00μg/m L、10.00μg/m L。以化合物峰面積為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標，計算得到各酚類物質(zhì)的回歸曲線方程和相關(guān)系數(shù)R2（見表2）。結(jié)果表明，各成分在上述條件下分析檢測時，相關(guān)系數(shù)R2≥0.99，濃度在0.02～10.00μg/m L范圍內(nèi)具有很好的線性關(guān)系。

表2 9種揮發(fā)性酚類成分工作標準曲線

2.4 方法檢出限、精密度和回收率

利用無水乙醇和水配制成不含揮發(fā)性酚類酒精度為50%vol的白酒代酒樣，稱取25m L的代酒樣品添加3個濃度水平(50μg/L、200μg/L、1000μg/L)的混合標樣，每個濃度水平重復7次。利用上述方法進行添加回收率試驗，平均回收率（R）和相對標準偏差（RSD，n=7）結(jié)果見表3。利用0.01μg/m L添加濃度水平為依據(jù)，特征離子質(zhì)量色譜峰性噪比RSN=3計算檢出限，RSN=10計算方法定量限。結(jié)果表明，各成分平均回收率為80.2%～92.8%，RSD為3.4%～7.8%，方法檢出限為1.4～4.4μg/L，定量限為4.8～14.8μg/L。

2.5 實際樣品分析

利用上述建立方法對9個不同白酒樣進行揮發(fā)性酚類檢測分析，每個白酒樣品平行檢測3次，對檢出值計算相對標準偏差（RSD,n=3）,結(jié)果見表4，實際樣品檢測相對標準偏差（RSD,n=3）小于6.25%，結(jié)果表明，建立的固相萃取結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜對白酒中揮發(fā)性酚類的分析方法，達到了定性定量分析的要求，同時該方法設(shè)計簡單，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可對批量樣品進行檢測與分析。

分析檢測結(jié)果可知，醬香型白酒中的揮發(fā)性酚類的含量在72.69～375.41μg/100m L，大于100μg/100m L的酒樣有7個，大于200μg/100m L的酒樣有4個，醬香型白酒中揮發(fā)性酚類物質(zhì)的含量較高，其中含量較高的2種組分為苯酚和間甲苯酚。

3 結(jié)果與討論

本實驗采用了固相萃取柱對樣品進行富集洗脫后結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜法測定白酒中揮發(fā)性酚類物質(zhì)。各成分在上述條件下分析檢測時，濃度在0.02～10.00μg/m L范圍內(nèi)具有很好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2≥0.99。在50μg/L、200μg/L、1000μg/L 3個添加水平下，回收率為80.2%～92.8%，相對標準偏差為3.4%～7.8%；方法檢出限為1.4～4.4μg/L，定量限為4.8～14.8μg/L。實驗結(jié)果表明方法具有簡單、快速、準確、靈敏的特點，適用于白酒中揮發(fā)性酚類物質(zhì)的檢測分析。

表3 方法檢出限、精密度和回收率

表4 醬香型白酒中揮發(fā)性酚的含量(μg/100mL)

[1]莊名揚.醬香型白酒中微量成分的生理活性[J].釀酒,2006(6)：109-110.

[2]栗偉.醬香型白酒的“春花秋實”[J].釀酒科技,2012(8)：119-120.

[3]楊國華,邱樹毅,黃永光.醬香白酒生產(chǎn)中產(chǎn)香微生物研究[J].中國釀造,2011(4)：24-27.

[4]輕工業(yè)部食品發(fā)酵研究所發(fā)酵室.氣相色譜法分析白酒的揮發(fā)性酚元化合物[J].食品與發(fā)酵工業(yè),1980(6)：10-15.

[5]崔云前,曹小紅,王春玲,等.發(fā)酵行業(yè)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚研究進展[J].中國釀造,2009(4):14-17.

[6]崔云前,曹小紅,魯梅芳,等.上面發(fā)酵小麥啤酒4-乙烯基愈創(chuàng)木酚含量的研究[J].食品研究與開發(fā),2010(2)：33-37.

[7]Caboni P,Sarais G,Cabras M,et al.Determination of 4-ethylphenol and 4-ethylguaiacol in wines by LC-MS-MS and HPLC-DAD-fluorescence[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2007,55：7288-7293.

[8]Vanbeneden N,Gils F,Delvaux F,et al.Variability in the release of free and bound hydroxycinnamic acids from diverse malted barley(Hordeum vulgare L.)cultivars during wort production[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007,55(26)：11002-11010.

[9]尋思穎,董睿,彭黔榮,等.高效液相色譜法測定醬香型白酒中揮發(fā)性酚類物質(zhì)[J].食品科學,2012,33(24)：239-243.

[10]朱燕,范來文,徐巖.應(yīng)用DI-SPME和GC-MS分析白酒中游離酚類化合物[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2010,36(10)：138-143.

[11]Dominguez C,Guillen D A,Baroso C G,et al.Determination of volatile phenols in fino sherry wines[J].Analytica Chimica Acta,2002,458(1)：95-102.

[12]董睿,楊敏,彭黔榮,等.飲料酒中揮發(fā)性酚類物質(zhì)分析方法研究進展[J].中國釀造,2011(3)：9-13.

[13]European Commission.Commission Decision of 12August 2002 implementing Council Directive96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results:2002/657/EC[A].European Commission,2002.

Determination of Volatile Phenols in Jiangxiang Baijiu by GC-MS

LI Jun1,DU Nan1,YUAN Xu1,PANG Hongyu1,GUO Xiaoguan1and ZHANG Yiji2
(1.Laboratory of Agricultural Products Quality&Safety Risk Assessment,Guizhou Provincial Quality Supervision and Testing Center for Agricultural Products,Guiyang,Guizhou 550004;2.Qianyun Distillery Co.Ltd.,Renhuai,Guizhou 564500,China)

The method to determine volatile phenols in Jiangxiang Baijiu by GC-MS has been developed.25.0m L liquor sample measured accurately,after elution w ith C18solid phase extraction column,quantitative detection was performed by GC-MS.The experimental results showed that,the average recovery was 80.2%to 92.8%,and RSD was 3.4%to 7.8%(n=7).The determination displayed a good linearity within the concentration range from 0.02 to 10.00μg/m L with the correlation coefficient R2higher than 0.99.The detection limit was 1.4 to 4.4μg/L,and the limits of quantitation was 4.8 to 14.8μg/L.This method was simple,sensitive and accurate,suitable for the analysis of volatile phenols in Jiangxiang Baijiu.

Baijiu;SPE;volatile phenols;gas chromatography-mass spectrometry

TS262.3；TS261.7；TS261.4

A

1001-9286(2017)01-0098-04

10.13746/j.njkj.2016312

2016-10-21

李?。?982-），男，高級實驗師，主要從事食品安全及儀器分析工作，E-mail：JUNL82@163.com。

郭曉關(guān)（1982-），女，農(nóng)藝師，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管工作，E-mail：23533805@qq.com。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-11-08；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20161108.1006.003.html。