蛋白水解物苦味形成、評價及功能活性的研究進(jìn)展

應(yīng) 欣 張連慧 陳衛(wèi)華(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所，北京 0093) (營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點實驗室；老年營養(yǎng)食品研究北京市工程實驗室，中糧營養(yǎng)健康研究院，北京 009)

蛋白水解物苦味形成、評價及功能活性的研究進(jìn)展

應(yīng) 欣1,2張連慧2陳衛(wèi)華1
(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所1，北京 100193) (營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點實驗室；老年營養(yǎng)食品研究北京市工程實驗室，中糧營養(yǎng)健康研究院2，北京 102209)

蛋白水解物具有良好的功能特性和健康益處，但水解物的苦味制約了其在食品工業(yè)的應(yīng)用。本文論述了蛋白水解物苦味形成的機(jī)理，重點探討了針對蛋白水解物苦味評價的研究方法進(jìn)展，并對蛋白水解物中苦味肽的生物活性進(jìn)行了綜述。本文還簡介了計算機(jī)模擬技術(shù)和肽數(shù)據(jù)庫在苦味肽研究領(lǐng)域的應(yīng)用，這一技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)苦味肽的研究能夠在分子水平更深入的理解苦味肽結(jié)構(gòu)和苦味的關(guān)系。隨著對苦味肽的深入認(rèn)識，蛋白水解物這一功能性配料將展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景。

蛋白水解物 苦味肽 苦味評價 生物活性肽

蛋白質(zhì)經(jīng)過酶解后可以改善蛋白的功能特性，同時還能產(chǎn)生一系列具有生物活性的肽段，這些生物活性肽一直是國內(nèi)外研究的熱點。很多研究都報道了來源于食物蛋白水解產(chǎn)物的生物活性肽的健康益處，如抑菌特性、血壓降低(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性)、抗血栓、抗氧化等[1]。蛋白水解物也由于其功能和健康益處的優(yōu)勢，可作為食品原料應(yīng)用于營養(yǎng)配方食品、臨床營養(yǎng)品、保健品、速溶飲品等食品中，然而在酶解過程中很多蛋白水解物都會產(chǎn)生明顯的苦味，直接影響了其應(yīng)用在食品中的風(fēng)味，也使蛋白水解物在食品工業(yè)的應(yīng)用受到了一定的限制。

本文主要論述了蛋白質(zhì)水解物苦味形成的機(jī)理，簡介了針對蛋白水解物苦味評價的方法，并對水解物中苦味肽的生物活性的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以期對蛋白水解物的深入研究和推廣應(yīng)用提供借鑒。

1 苦味形成的機(jī)理

天然食物蛋白質(zhì)(如乳蛋白、大豆蛋白等)中疏水性的氨基酸殘基排列在蛋白質(zhì)分子的內(nèi)部，和味蕾不接觸，因而感覺不到苦味，隨著蛋白質(zhì)水解的進(jìn)行，肽鏈中疏水性氨基酸殘基逐漸暴露，和味蕾相接觸，使人能夠感知到苦味，水解進(jìn)程繼續(xù)，疏水氨基酸殘基暴露增多，苦味強(qiáng)度增大。當(dāng)增大到一定程度時，苦味肽被水解成分子質(zhì)量很小的肽或者游離氨基酸，其結(jié)構(gòu)無法滿足形成苦味的條件，苦味會進(jìn)一步下降[2]。

多數(shù)研究表明肽的苦味和其疏水性關(guān)系密切，肽的疏水性使肽能夠在口腔中與苦味受體的活性部位結(jié)合，從而產(chǎn)生苦味[3]。1979年提出的Q值法則，認(rèn)為苦味與肽平均疏水性相關(guān)，可以采用氨基酸側(cè)鏈從乙醇溶液移至水中時其平均自由能的改變量作為度量值[4]；當(dāng)肽Q值大于1 400 cal/mol時有苦味，而當(dāng)肽Q值小于1 300 cal/mol則不苦，而且氨基酸序列對苦味沒有任何作用。很多食物蛋白(如酪蛋白、卵白蛋白、大豆蛋白和玉米蛋白)水解物的苦味肽都證明了Ney的理論。隨著研究的深入，Q值法則的局限性也逐漸突出，比如忽略了氨基酸殘基的空間位置對苦味的重要作用[5]。研究者也發(fā)現(xiàn)側(cè)鏈的疏水性和側(cè)鏈?zhǔn)杷鶊F(tuán)的碳原子數(shù)目相較于總疏水性而言對苦味的影響更大。側(cè)鏈的疏水基團(tuán)提供了苦味受體的結(jié)合部位，而另一個結(jié)合部位則是分子質(zhì)量大一些的堿性基團(tuán)。為了提供這些特性，苦味肽往往在C端有疏水氨基酸，而在N端有堿性氨基酸。一般來說，苦味肽都是由少于8個氨基酸組成的，而且隨著氨基酸數(shù)目的增多，苦味增加。由8個或更多氨基酸組成的肽在苦味強(qiáng)度上差別不大，而且相較于螺旋構(gòu)象，它們更容易形成球形的構(gòu)象[3,6-7]。

除了開展肽結(jié)構(gòu)與苦味的實驗研究以外，近20年來，研究者們也試圖開發(fā)數(shù)學(xué)模型來預(yù)測肽的苦味，并且評估肽段一級結(jié)構(gòu)對其苦味的影響。這些研究主要采用定量構(gòu)效關(guān)系(quantitative structure-activity relationships,QSAR)的方法，在食物蛋白質(zhì)和肽領(lǐng)域這一方法主要用來進(jìn)行建模和預(yù)測，已研究的功能特性包括苦味、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性、抗血栓、抑菌、免疫調(diào)節(jié)等。日本在苦味肽領(lǐng)域做了大量的研究，合成了數(shù)百個肽段來構(gòu)建結(jié)構(gòu)和苦味的關(guān)系。Asao等[8]在1987年測試了93種氨基酸、肽及其衍生物的苦味閾值，并采用疏水性描述子和空間排列的參數(shù)來建立定量構(gòu)效關(guān)系的模型，他們發(fā)現(xiàn)多肽主鏈的總長度是重要的描述因子。之后的很多研究者采用了Asao測定的48個二肽的苦味閾值數(shù)據(jù)來構(gòu)建定量構(gòu)效關(guān)系的模型，試圖應(yīng)用新的氨基酸物理化學(xué)的描述子來進(jìn)行QSAR的數(shù)據(jù)分析。Yin等[9]總結(jié)了2010年之前構(gòu)建的針對二肽與苦味的28個QSAR的模型，并與他們構(gòu)建的新模型進(jìn)行了比較，新模型采用E1-E5的氨基酸變量(包括疏水性、空間特性或側(cè)鏈分子大小、氨基酸形成α-螺旋的傾向性、組成和凈電荷)來構(gòu)建，其模型成功的預(yù)測了48個二肽的苦味(R2=0.97)。QSAR研究多集中在二肽上，針對三肽及以上的相對較少。Kim等[10]構(gòu)建了一個由224個2～14肽以及5個氨基酸構(gòu)成的數(shù)據(jù)庫，采用氨基酸的3個z值(疏水性、分子質(zhì)量和電荷性質(zhì))和3個因素(總疏水性、殘基數(shù)目和分子質(zhì)量)作為x變量，而苦味閾值作為y變量。構(gòu)建后模型表明肽鏈C端的疏水氨基酸和N端的堿性氨基酸和苦味值高度相關(guān)，這一結(jié)果與之前多肽結(jié)構(gòu)與苦味的實驗結(jié)果一致。Somaieh等[11]在這一數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了3個不同的定量構(gòu)效關(guān)系模型，包括多元線性回歸、支持向量機(jī)和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，對多肽的苦味進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明這3個模型都能夠成功預(yù)測多肽的苦味值，相較于線性的算法，非線性的方法預(yù)測誤差更小，所選擇的結(jié)構(gòu)描述子能夠區(qū)分苦味和非苦味多肽。

2 苦味評價技術(shù)在蛋白水解物中的應(yīng)用

蛋白水解物苦味評價技術(shù)呈現(xiàn)出從定性到定量、主觀到客觀、低通量到高通量、傳統(tǒng)到現(xiàn)代化的發(fā)展趨勢。目前蛋白水解物的苦味評價主要采用體內(nèi)評價和體外評價2類。

體內(nèi)評價主要指的是傳統(tǒng)的人群感官評價，通過健康的受試者直接品嘗蛋白水解物的味道來進(jìn)行，大多數(shù)研究者在評價蛋白水解物的風(fēng)味時仍然采用這一方法[12-13]。感官評價的弊端在于其不適合大量、快速的篩選樣品，而且一些肽在純化分離的過程中會用到有毒試劑，不適合進(jìn)行人群感官評價。

在蛋白水解物體系目前用到的體外苦味評價主要包括電子舌和鈣成像技術(shù)2種方法。電子舌是食品藥品味覺檢測的有效手段，它采用一系列的傳感器耦合化學(xué)計量法的處理單元從而模仿人的味覺系統(tǒng)，傳感器作為舌頭，而軟件和統(tǒng)計學(xué)算法作為大腦構(gòu)建數(shù)據(jù)庫并進(jìn)一步進(jìn)行味覺分析和識別[14]。電子舌具有檢測分析速度快、重復(fù)性好、數(shù)據(jù)電子化等優(yōu)勢。電子舌在之前的研究中主要用來對純物質(zhì)的溶液進(jìn)行分析，但最近幾年采用電子舌用于食品這一復(fù)雜體系的研究開始增多，而用于蛋白水解物苦味的研究剛剛起步。Newman等[15]研究了電子舌對標(biāo)準(zhǔn)苦味物質(zhì)咖啡因和一系列乳清蛋白和酪蛋白水解物的響應(yīng)，并與經(jīng)過培訓(xùn)后的感官小組的結(jié)果進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)感官評價和電子舌評價在咖啡因的分析上有較強(qiáng)的相關(guān)性(R2為0.98)，對乳蛋白水解物也有較好的相關(guān)性(R2為0.94～0.99)。在這個研究中也發(fā)現(xiàn)在評價相對苦味較弱的樣品時電子舌比感官評價小組可信度更高。在此基礎(chǔ)上Newman等[16]還結(jié)合蛋白酶解物的物理化學(xué)特性(水解度、體積排阻色譜獲得多肽分子質(zhì)量、反相高效液相色譜獲得相對疏水性)應(yīng)用偏最小二乘法構(gòu)建了預(yù)測模型，結(jié)果表明運(yùn)用電子舌響應(yīng)值結(jié)合體積排阻色譜和反相高效液相色譜獲得的模型具有預(yù)測乳蛋白水解物苦味的能力。此外，電子舌也應(yīng)用在含有酪蛋白酸鈉的模式飲料中來對能夠遮蔽或降低苦味的甜味劑和香精進(jìn)行篩選，結(jié)果表明電子舌能夠有效測定由于不同甜味劑導(dǎo)致的酪蛋白酸鈉的苦味降低情況，但無法評價模式飲料中香精的情況[17]?；菅硬ǖ萚18]利用電子舌對大豆分離蛋白在風(fēng)味蛋白酶處理后不同酶解時間的大豆肽溶液進(jìn)行了區(qū)分和苦味評價，采用判別因子分析法(DFS)能夠?qū)Σ煌附鈺r間的大豆肽溶液進(jìn)行定性的區(qū)分，研究者也采用偏最小二乘法(PLS)和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(RBF)對電子舌傳感器的響應(yīng)信號和人工感官評價得分構(gòu)建偏定量預(yù)測模型，大豆肽溶液苦味預(yù)測結(jié)果與實際感官評價吻合。

鈣成像技術(shù)應(yīng)用于苦味評價主要基于苦味信號機(jī)理的發(fā)現(xiàn)。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)26種人的苦味受體，這些苦味受體(T2Rs)屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，而G蛋白信號傳導(dǎo)通路在苦味感知中起到重要的作用[19-20]。當(dāng)苦味物質(zhì)與味覺細(xì)胞膜上的苦味受體相互作用時，由G蛋白介導(dǎo)的傳導(dǎo)通路會導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度的升高，使細(xì)胞膜去極化，產(chǎn)生動作電位。因此，可以基于這一原理，利用鈣離子熒光指示劑與細(xì)胞內(nèi)鈣離子結(jié)合，當(dāng)給予相應(yīng)的激發(fā)光時結(jié)合的指示劑會發(fā)出特定的熒光，從而可以通過檢測熒光強(qiáng)度來判斷細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的實時變化[21]。Maehashi等[7]采用人胚胎腎細(xì)胞表達(dá)人苦味受體hTAS2R1,hTAS2R4,hTAS2R14,hTAS2R16,研究人苦味受體是否能識別合成多肽和酪蛋白水解物的苦味，實驗結(jié)果表明hTAS2R1表達(dá)的細(xì)胞能夠被合成的苦味肽(Gly-Phe和Gly-Leu)激活，而不苦的二肽Gly-Gly則不能激活所有的受體表達(dá)的細(xì)胞。鈣成像技術(shù)目前剛剛開始作為一種基于細(xì)胞的高通量篩選方法應(yīng)用在藥品的苦味遮蔽上，在蛋白水解物這種復(fù)雜體系的應(yīng)用相對較少，主要原因在于鈣細(xì)胞成像技術(shù)步驟相對復(fù)雜，質(zhì)粒構(gòu)建、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和選擇低光褪色染料上都有難度。

3 苦味肽生物活性與苦味的相關(guān)性研究

蛋白水解物的不良風(fēng)味會影響其作為功能性食品配料的應(yīng)用，研究者們也通過酶法、包埋、選擇性吸附等一系列方法試圖脫除蛋白水解物的苦味。然而越來越多的研究表明苦味肽中的一些疏水氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸)是必需氨基酸，具有較高的營養(yǎng)價值，而且一些苦味肽同時具有生物活性。Cheison等[22]采用乳清分離蛋白為原料進(jìn)行水解，水解后發(fā)現(xiàn)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性與乳清蛋白水解物的苦味有關(guān)。其他一些研究者也報道了乳清蛋白來源的多肽既具有苦味也有降血壓的活性。Liu等[12]從商品化的乳清蛋白水解物中鑒定出4種影響其苦味的多肽，分別是YGLF、IPAVF、LLF和YPFPGPIPN，而這4種苦味肽之前已有文獻(xiàn)報道了促進(jìn)健康的生物活性。多肽YGLF，YPFPGPIPN和LLF已經(jīng)證明是具有降血壓活性的多肽，而且在自發(fā)性高血壓大鼠模型中會降低大鼠的血壓[23-27]。IPAVF在人體消化道內(nèi)會轉(zhuǎn)化為IPA，而IPA在自發(fā)性高血壓大鼠模型中也具有降血壓活性[28]。Pins等[29]發(fā)現(xiàn)美國戴維斯柯食品國際公司生產(chǎn)的一種具有苦味的乳清蛋白水解物在臨床實驗中能夠降低血壓正常高值和高血壓人群的收縮壓和舒張壓。除了乳清蛋白水解物之外，Cheung等[30]發(fā)現(xiàn)在利用蝦加工的副產(chǎn)物生產(chǎn)的水解物中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性與其苦味呈正相關(guān)，Sato等[31]發(fā)現(xiàn)裙帶菜(一種棕色的海藻)的水解物具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性，而且有不同程度的苦味。

由于一些已報道的苦味肽具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的抑制活性，這使得研究者們開始探尋苦味強(qiáng)弱與生物活性是否具有一定的關(guān)聯(lián)。合成肽段來供感官評價和活性測定可以提供特定肽序列苦味和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性的信息，但是合成所有肽段來進(jìn)行測試并不實際，以二肽為例就會需要合成400個，因此研究者們采用定量構(gòu)效關(guān)系模型來將多肽的苦味和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性相關(guān)聯(lián)。但從目前定量構(gòu)效關(guān)系的結(jié)果來看存在一些矛盾的結(jié)論。Wu等[32]運(yùn)用QSAR預(yù)測了53個二肽和55個三肽的苦味和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性，發(fā)現(xiàn)兩者沒有顯著的相關(guān)性(P≥0.05)。而Pripp等[33]則用實驗值和QSAR預(yù)測值說明了苦味和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性具有強(qiáng)烈的正相關(guān)，而這一相關(guān)性主要由于多肽的疏水性在苦味和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性中都起著重要的作用。在3～6個氨基酸長度的多肽中這一相關(guān)性相對較弱，說明在長鏈多肽中能夠發(fā)現(xiàn)既有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性又苦味值較低的多肽。Tan等[34]也報道了類似的結(jié)果，在二肽中能發(fā)現(xiàn)正相關(guān)性，而3～6肽中則沒有發(fā)現(xiàn)多肽苦味與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性的關(guān)系。

既然苦味肽具有生物活性，將苦味肽經(jīng)過酶解脫除是否會對生物活性造成降低或者損失呢？李萍[35]運(yùn)用風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶復(fù)合酶解得到的脫苦大豆肽和采用黑曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶得到的脫苦大豆肽不僅都能達(dá)到良好的脫苦效果，而且脫苦前后小鼠抗疲勞生理功能無顯著性差異。Cheung等[36]采用外切肽酶對乳清蛋白水解物進(jìn)行脫苦處理，外切肽酶處理后的水解物苦味值顯著下降，同時還具有體外的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性，進(jìn)一步將脫苦后的水解物在自發(fā)型高血壓大鼠模型進(jìn)行測試發(fā)現(xiàn)在大鼠口服后的最初8 h，外切肽酶處理的乳清蛋白水解物(100 mg/kg體重)與卡托普利(10 mg/kg體重)在降低收縮壓的效果一樣，而且這一效果可以持續(xù)24 h。

4 肽數(shù)據(jù)庫在蛋白水解物苦味研究中的應(yīng)用

近年來研究者們也提出運(yùn)用生物信息學(xué)的工具來研究肽和肽類似物的苦味，已經(jīng)有一些數(shù)據(jù)庫可以找到肽特性的信息，包括低分子質(zhì)量物質(zhì)的數(shù)據(jù)庫PubChem和BitterDB，以及肽的數(shù)據(jù)庫BIOPEP和EROP-Moscow[37]。BitterDB數(shù)據(jù)庫收集了超過550種苦味物質(zhì)的信息，包括它們的分子結(jié)構(gòu)、參考文獻(xiàn)、苦味級別等[38]，EROP-Moscow則包含了84個具有味覺特性的風(fēng)味肽，其中苦味肽占比最多[39]。Iwaniak等[40]在BIOPEP已有的生物活性肽數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上又?jǐn)U充了肽和氨基酸味覺的數(shù)據(jù)庫，這個數(shù)據(jù)庫收錄了347個多肽和10個氨基酸的信息，包括氨基酸序列、味覺(酸、甜、苦、咸、鮮)、分子大小、生物活性等。利用BIOBEP數(shù)據(jù)庫還可分析出某一蛋白序列中是否含有苦味肽，以及選擇特定的酶來得到苦味肽段。Pooja等[41]利用BIOPEP的數(shù)據(jù)庫預(yù)測了對米糠蛋白酶解后潛在的具有二肽基肽酶Ⅳ抑制活性的多肽，并通過數(shù)據(jù)庫分析出這些具有二肽基肽酶Ⅳ抑制活性的多肽大多數(shù)為苦味肽。

5 結(jié)論

蛋白水解物由于呈現(xiàn)苦味影響了其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用，之前對苦味肽的研究主要采用感官評價結(jié)合多步分離和質(zhì)譜鑒定來確定苦味肽的序列組成，隨著跨學(xué)科的交融，更多新的技術(shù)和方法可以應(yīng)用在這一領(lǐng)域，包括采用電子舌進(jìn)行感官評價，鈣成像技術(shù)進(jìn)行高通量篩選可能的苦味肽，QSAR預(yù)測苦味肽并提供結(jié)構(gòu)和功能的信息，運(yùn)用肽和氨基酸感官的數(shù)據(jù)庫判斷某一蛋白作為苦味肽前體的可能等。雖然這些新技術(shù)和方法在苦味肽領(lǐng)域的研究剛剛開始，但相信隨著研究的深入會進(jìn)一步加深我們對苦味肽結(jié)構(gòu)與功能的認(rèn)識，結(jié)合苦味脫除的方法的提升，蛋白水解物這一功能性配料將展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景。

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Research Advances in Bitterness Formation,Evaluation and Function Ftudies of Protein Hydrolysates

Ying Xin1,2Zhang Lianhui2Chen Weihua1
(Institute of Food Science and Technology,Chinese Academy of Agricultural Science1,Beijing 100193) (COFCO Nutrition and Health Research Institute2,Beijing 102209)

Protein hydrolysates have good functionalities and health benefits;however their bitterness limits their utilization in food industry.Herein,the paper discusses the mechanism of bitter peptides formation in protein hydrolysates,focused on the discussion of the development of bitterness evaluation methods and the bioactivity of bitter peptides.This article also reviews recent application of peptide database andinsilicoprediction in protein hydrolysate could provide a better understanding at the molecular level of the peptide structure-bitterness relationship.With the in-depth understanding of bitter peptides,protein hydrolysates as functional food ingredients could have a broad application prospect.

protein hydrolysates,bitter peptides,bitterness evaluation,bioactive peptides

TS209

A

1003-0174(2017)12-0141-06

2017-01-20

應(yīng)欣，女，1986年出生，工程師，農(nóng)產(chǎn)品加工利用

陳衛(wèi)華，男，1977年出生，研究員，食品質(zhì)量與安全