棉花含糖量測試方法的研究進展

■高艷霞 宋開梅 黃石生 沈游 肖遠淑

〔新疆大學，新疆烏魯木齊830046〕

棉花含糖量測試方法的研究進展

■高艷霞 宋開梅 黃石生 沈游 肖遠淑

〔新疆大學，新疆烏魯木齊830046〕

為了研究測定棉花含糖量的最佳方法，本文通過分析3大類棉糖檢測的方法原理和15種應用，得出了未來測定棉花含糖量的測試方法也將朝著快速、準確且低成本的趨勢發(fā)展。

一、DNS法

（一）原理

DNS法即3，5-二硝基水楊酸比色法的英文簡稱，其檢測原理是根據(jù)3，5-二硝-3-氨基-5-硝基水楊酸，在一定濃度范圍內(nèi)，還原糖的量和反應液的顏色呈正比，通過分光光度計測定溶液的吸光度值可以定量測定還原糖的含量[1-3]

其法突出的優(yōu)點是不使用腐蝕作用的濃硫酸，而DNS法測定結(jié)果的影響因素有很多，如吸收光譜、顯色劑用量、顯色劑時間等[2，4]。

（二）應用

1.農(nóng)業(yè)方面。

陳曉旋等人[1]研究了DNS法測定棉花總糖含量的影響因素。棉花中的總糖包括還原糖和非還原糖，但是DNS法只能與還原糖進行顯色反應，所以測試總糖時需將非還原性多糖酸化降解成還原糖。

余志堅等人[5]做了DNS法檢測食用菌多糖含量條件優(yōu)化研究。食用菌在液體培養(yǎng)及土壤栽培等生長過程中，還會添加其他糖類作為碳源。試驗以葡萄糖為顯色底物，研究了麥芽糖、乳糖、蔗糖對多糖含量測定的影響，結(jié)果表明麥芽糖對DNS法檢測多糖含量結(jié)果干擾最大。

2.食品方面。

彥繁鶴等人[6]采用DNS法測定甲酸預處理甘蔗渣過程中還原糖含量，對影響DNS法的因素進行了比較研究。甘蔗渣在利用過程中必須去除木質(zhì)素，在采用甲酸處理甘蔗渣過程中，纖維素和半纖維素會產(chǎn)生部分降解生成還原糖。

劉玥等人[7]建立了DNS法測定調(diào)味品中色素D－氨基葡萄糖含量的方法，利用3，5-二硝基水楊酸與還原糖反應生成棕褐色氨基化合物，還原糖的含量在一定范圍內(nèi)與棕褐色物質(zhì)顏色深淺成正比，由此可得出調(diào)味品中色素D－氨基葡萄糖含量。

3.藥品方面。

張秀宏等人[8]通過DNS法測定益腎康膠囊中多糖的含量來確定藥品是否合格。其采用DNS比色法測定還原糖供試液和總糖供試液中單糖的質(zhì)量，計算時用總糖試液減去還原糖供試液的單糖含量，最終算出的每粒含多糖以無水葡萄糖計，藥品合格標準不得少于25 mg。

熊藝花等人[9]通過DNS法對三七總多糖含量的測定。三七中的還原糖可以用水提醇沉法沉淀出來，其還原糖含量需要先對三七多糖溶液用DNS顯色后測定其吸光度。三七中多糖含量為總糖含量減去還原糖含量。

二、高效液相色譜法

（一）原理

高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）的基本原理是各組分在固定相和流動相中的吸附能力存在差異，當溶于流動相中的各組分流經(jīng)固定相時，各組分在兩相之間進行反復多次吸附與分配，由于各組分在兩相間的分配系數(shù)不同，因此，各組分就會先后流出色譜柱，結(jié)合柱后檢測器加以檢測，從而實現(xiàn)各組分被分離檢測的目的。

（二）應用

1.植物方面。

趙海浪等人[10]通過高效液相色譜（HPLC）分離棉花中各類糖分，采用示差折光檢測器（RID）對水萃取溶液中的糖進行測定。實驗采用固定相為極性的氨極柱做為液相色離柱，采用乙腈-水流動相，考察其在不同乙腈-水和不同配比下的6種糖分分離情況。乙腈-水（86∶14，V/V）時，6種糖分得到有效分離。

張玉瓊等人[11]建立了高效液相色譜法（HPLC）用于分離和測定小麥中的水楊酸（SA）、赤霉素（GA3）、脫落酸（ABA）、玉米素（ZT）和吲哚乙酸（IAA）5種植物內(nèi)源激素。實驗對激素分離條件進行優(yōu)化，從pH、洗脫液梯度和檢測波長的切換等方面，對小麥中的GA3、SA、ABA、IAA、ZT進行分離和測定。

伍善廣等人[12]建立了柱前衍生化高效液相色譜法測定金錢菇多糖中單糖組分的方法。金錢菇多糖采用超聲波輔助法提取金錢菇多糖酸水解后的單糖組分經(jīng)PMP衍生化，以常用的紫外檢測器和C18柱分析了多糖的單糖組成。

2.食品方面。

李琦等人[13]利用高效液相色譜法測定發(fā)酵乳中葡萄糖、乳糖、半乳糖的含量。由于發(fā)酵乳中的半乳糖和葡萄糖互為手性同分異構(gòu)體，HPLC法對其分離檢測增添了難度，實驗采用離子交換樹脂柱Aminex HPX 87，可將單糖很好地分離，使用該法測定使各組分達到較好的分離，利用Carrez法處理樣品簡便、快速，方法的回收率和精密度較高，重現(xiàn)性較好，結(jié)果穩(wěn)定。

逯平杰等人[14]建立了高效液相色譜（HPLC）示差折光檢測法測定甘蔗節(jié)間糖含量的方法，以往測定甘蔗節(jié)間糖含量主要采用一般的化學方法，本實驗采用碳水化合物分析專用柱Agilent Zorbax carbohydrate柱以乙腈-水不同比例的流動相測定甘蔗提取液和糖混合標準品中各種糖成分的分離和含量情況，建立了一種簡便、快速和準確可靠的，能同時測定果糖、蔗糖、葡萄糖含量的高效液相色譜法。

3.藥品方面。

彭東明等人[15]建立了立鹽酸舍曲林順式光學異構(gòu)體簡單、快速的高效液相色譜拆分方法。實驗采用KR100-5CHI-TBB手性柱拆分的方法來分析鹽酸舍曲林中的光學異構(gòu)體，研究流動相的組成、流速對分離的影響和pH值對峰形的影響，在所建立的色譜條件下，鹽酸舍曲林與其順式光學異構(gòu)體達到基線分離。

郝蕾蕾等人[16]建立了PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）柱前衍生化HPLC法測定黃河灘棗多糖的單糖組成的方法。實驗將大棗多糖水解液用NaOH溶液中和（pH約為7.0）后直接進行PMP衍生化，由于單糖衍生物比PMP殘留試劑出峰所用時間長，因此省去了其衍生化產(chǎn)物及多糖水解樣品的干燥過程，衍生化后的溶液用氯仿萃取后即可直接進樣分析，對測定結(jié)果不產(chǎn)生影響，此方法簡化了操作步驟。

三、蒽酮法

（一）原理

蒽酮法是目前常用的糖定量測定方法，其原理是糖在濃硫酸作用下，經(jīng)脫水反應生成的糠醛或羥甲基糠醛與蒽酮反應，生成藍綠色化合物，在一定的范圍內(nèi)，顏色深淺與糖的含量成正比[17]。

（二）應用

1.植物方面。

郭玉華等人[18]采用正交試驗，對棉成熟纖維中水溶性總糖的最佳提取條件進行了選擇。提取成熟棉纖維中水溶性總糖采用水煮法[19]，并用蒽酮比色法測定其含量。找出了成熟棉纖維中水溶性總糖的最佳提取條件，對蒽酮比色法測定總糖含量的最佳條件進行了選擇，繪制出了標準曲線，并測定了不同品級、不同產(chǎn)地成熟棉纖維中水溶性總糖含量。

杜洪志等人[20]采用蒽酮-硫酸比色法、正交試驗法對土茯苓中總多糖提取工藝進行優(yōu)化。通過對蒽酮-硫酸比色法的顯色條件進行系統(tǒng)優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，2010版《中國藥典》收載的顯色方法并非為最佳的顯色條件，因藥材及成分不同，顯色條件差異較大，故試驗中要根據(jù)具體的藥材進行顯色條件的優(yōu)化。不同提取方法對土茯苓中總多糖的含量有較大影響，采用回流提取時，總多糖的含量較高。

2.食品方面。

位杰等人[21]采用單因素試驗設計考察了蒽酮試劑質(zhì)量濃度、蒽酮試劑用量、顯色反應時間、冷卻時間對蒽酮法測定紅棗可溶性糖含量的影響。研究表明，直接利用硫酸與水發(fā)生水合反應時釋放的熱量，使反應體系自行升溫，即可達到充分顯色。從方法的簡易程度比較，蒽酮法測定紅棗可溶性糖室溫顯色省去了外加熱一項，更為簡便，提高了測定速度，對取樣較多、測定任務較大的科研而言，這是一種較好的方法。

王佩芬等人[22]建立了蒽酮-硫酸比色法測定南瓜籽多糖含量。實驗以蒸餾水加蒽酮—硫酸溶液做空白參比，確定了最大吸收波長、蒽酮濃度、硫酸濃度、加熱時間、吸光度讀取時間。

3.藥品方面。

吳亞軍等人[23]建立了蒽酮-硫酸法測定六味地黃生物制劑中多糖含量的方法。本文采用L9（34）正交設計法優(yōu)選最佳顯色條件，結(jié)果表明：蒽酮-硫酸溶液用量和蒽酮-硫酸溶液濃度對顯色影響較大，水解時間和冷卻時間次之。

張曉靜[24]建立了硫酸-蒽酮法測定半夏多糖的含量的方法。因為使用苯酚需要對苯酚試劑蒸餾后方可使用，污染較大，所以，本實驗采用了污染較小的蒽酮硫酸法。在做回收實驗時，由于樣品是多糖，多糖不溶于乙醇，對照品是葡萄糖，而葡萄糖可以溶解于乙醇，為此，葡萄糖應在醇沉之后加入少量。此外，分析結(jié)果存在一定的誤差。

四、結(jié)論

DNS法靈敏、穩(wěn)定、操作簡便，測定結(jié)果準確，重復性好，但是必須繪制參比糖樣的標準曲線，存在操作復雜、用時較長、快捷便利性不夠、對于企業(yè)試驗人員要求較高等問題。HPLC法分析速度快、分辨率高、重復性好，在定量測定時極具優(yōu)勢，但對實驗設備要求較高，需要高效液相色譜儀。蒽酮法靈敏度高、準確度高、簡單易行，但此法干擾因素較多，如蒽酮試劑質(zhì)量濃度、蒽酮試劑用量、顯色反應時間、冷卻時間以及外源加熱與否都影響其顯色，操作條件控制不好易引起誤差。

隨著檢測技術(shù)和手段地不斷推陳出新，棉花含糖量的測試方法也將朝著便利、快速、準確且低成本的方向發(fā)展。另外，利用數(shù)學模型或者一些統(tǒng)計方法也是一種有效的辦法，但是采用何種模型來分析并且建模過程也是需要大量反復驗證。為了適應棉糖測試的快速、準確，筆者通過用國家標準GB/T 16258—2008《棉纖維含糖試驗方法定量法》中的D-果糖標準溶液的工作曲線轉(zhuǎn)換為測色配色儀中的色度參數(shù)（a*、b*、C*、h、L）數(shù)值，這樣就減少了定量法繁瑣的實驗步驟，而且通過數(shù)值表達含糖量更加明晰。

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大學生創(chuàng)新項目（XJU-SRT-16074）