響應(yīng)面法優(yōu)化泰妙菌素生產(chǎn)菌株原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基

孫金剛，楊 智，牛 春，張 萍

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司，寧夏銀川 750101)

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響應(yīng)面法優(yōu)化泰妙菌素生產(chǎn)菌株原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基

孫金剛，楊 智，牛 春，張 萍*

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司，寧夏銀川 750101)

[目的]采用響應(yīng)面法對泰妙菌素生產(chǎn)菌株原生質(zhì)體的再生培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。[方法]利用Minitab統(tǒng)計軟件，采用中心復(fù)合響應(yīng)面設(shè)計對泰妙菌素生產(chǎn)菌株原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基的瓊脂濃度和蔗糖濃度進(jìn)行了優(yōu)化。[結(jié)果]泰妙菌素生產(chǎn)菌株原生質(zhì)體的再生培養(yǎng)基優(yōu)化為馬鈴薯20.00%(浸提液)+葡萄糖2.00%+蔗糖2.70%+瓊脂1.56%，pH=6.5。優(yōu)化后的再生培養(yǎng)基的單菌落復(fù)蘇率由0.7‰提高到3.5‰。[結(jié)論]該研究可為泰妙菌素的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

響應(yīng)面法；泰妙菌素；原生質(zhì)體；再生培養(yǎng)基

延胡索酸泰妙菌素是新型獸用抗生素，抗菌譜廣，對支原體、金黃色葡萄球菌、螺旋體等病原體具有抑制作用[1-5]，主要用于防治豬支原體肺炎和雞慢性呼吸道疾病[2]。該藥物是截短側(cè)耳素的衍生物[6-7]。截短側(cè)耳素由擔(dān)子菌綱傘菌目斜蓋傘屬真菌產(chǎn)生，由于遺傳背景資料少，目前常采用誘變育種的方式進(jìn)行菌種選育研究[2, 8]。原生質(zhì)體是誘變育種的良好材料，之前已經(jīng)建立泰妙菌素生產(chǎn)菌株原生質(zhì)體的制備方法，但再生率偏低。筆者采用響應(yīng)面法對泰妙菌素生產(chǎn)菌株原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，以期為泰妙菌素的研發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種。泰妙菌素生產(chǎn)菌(Clitopilusprunulus)，批號TMII14-28，由寧夏泰瑞制藥股份有限公司菌種研究室保藏。

1.1.2 儀器與設(shè)備。LDZX-75KBS立式蒸汽壓力滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)、YT-CJ-2N雙人雙面凈化工作臺(北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司)、HZQ-F280全溫振蕩培養(yǎng)箱(太倉市華美生化儀器廠)、PSX智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱(寧波萊?？萍加邢薰?。

1.1.3 培養(yǎng)基。種瓶培養(yǎng)基為馬鈴薯20%(浸提液)、葡萄糖2%，pH=6.5。初始原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基為馬鈴薯20%(浸提液)、葡萄糖2%、瓊脂2%，pH=6.5。

1.2 方法

1.2.1 原生質(zhì)體的制備。取培養(yǎng)3 d的種子液20 mL，3 000 r/min下離心10 min后收集菌絲。將過濾除菌的酶液20 mL加入到上述菌絲中，25 ℃條件下酶解3.0～3.5 h，每隔0.5 h振蕩混勻1次。最后,用G2砂芯漏斗過濾，收集濾液。用緩沖液將濾液稀釋10倍后，每個培養(yǎng)皿均勻涂布200 μL。

1.2.2 原生質(zhì)體計數(shù)。原生質(zhì)體采用血球計數(shù)板計數(shù)。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗。在前期單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定蔗糖、瓊脂為關(guān)鍵因素。以蔗糖濃度、瓊脂濃度和葡萄糖濃度為自變量，以復(fù)蘇的單菌落數(shù)量為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計。響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平

2 結(jié)果與分析

響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2。 對表2中復(fù)蘇的單菌落數(shù)量進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次回歸方程：Y=-2.45+1.88×A+0.92×B+5.34×C-0.78×AB+0.23AC+10.23BC-0.12×A2+1.89×B2-18.45×C2。二次多項式模型中復(fù)蘇的單菌落數(shù)量與蔗糖濃度、瓊脂濃度和葡萄糖濃度具有極顯著相關(guān)(P<0.01)，擬合檢驗非常顯著。其中，蔗糖濃度對復(fù)蘇的單菌落數(shù)量有極顯著影響(P<0.001)，瓊脂濃度對復(fù)蘇的單菌落數(shù)量有極顯著影響(P<0.001)，其校正決定系數(shù)為0.878 5，說明此模型擬合度良好。

利用Minitab統(tǒng)計軟件，采用中心復(fù)合響應(yīng)面設(shè)計制定試驗方案，對原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基的瓊脂濃度和蔗糖濃度進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果見表3。方差分析表明，R2=0.999 96，從圖1可以看出，復(fù)蘇的單菌落數(shù)量隨著蔗糖濃度的增加而降低，而復(fù)蘇的單菌落數(shù)量隨著瓊脂濃度的增加呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)蔗糖濃度為1.5%時復(fù)蘇的單菌落數(shù)量達(dá)到最大，說明蔗糖濃度與瓊脂濃度對復(fù)蘇的單菌落數(shù)量影響顯著，與前期單因素試驗結(jié)果相一致。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

表明該二次回歸方程模型與試驗結(jié)果的符合度達(dá)99.99%，說明二次回歸方程與模型有很高的可信度。

由圖2可知，預(yù)測的最優(yōu)瓊脂濃度與蔗糖濃度分別為1.56%和2.70%。根據(jù)優(yōu)化后的配方進(jìn)行回歸模型試驗驗證，結(jié)果表明優(yōu)化后的再生培養(yǎng)基單菌落復(fù)蘇率由0.7‰提高到3.5‰，提高了5倍。

3 討論與結(jié)論

在再生培養(yǎng)基中添加一定濃度的蔗糖可以提高泰妙菌素生產(chǎn)菌株的原生質(zhì)體再生率，其原因可能是添加蔗糖有助于原生質(zhì)體維持滲透平衡，防止細(xì)胞死亡。瓊脂濃度會影響營養(yǎng)物質(zhì)的利用速率，通過優(yōu)化再生培養(yǎng)基的瓊脂濃度也能夠提高再生率[9-10]。

表3 原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基中瓊脂濃度和蔗糖濃度的優(yōu)化

圖1 響應(yīng)面試驗結(jié)果 Table 1 The results of response surface test

筆者采用響應(yīng)面法對泰妙菌素生產(chǎn)菌株原生質(zhì)體的再生培養(yǎng)基中的瓊脂濃度和蔗糖濃度進(jìn)行了優(yōu)化，確定泰妙原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基為馬鈴薯20.00%(浸提液)+葡萄糖

圖2 響應(yīng)面優(yōu)化器預(yù)測 Table 2 The prediction of response surface test

2.00%+蔗糖2.70%+瓊脂1.56%，pH=6.5。優(yōu)化后的再生培養(yǎng)基單菌落復(fù)蘇率由0.7‰提高到3.5‰，提高了5倍。

[1] 王學(xué)紅,梁劍平,趙曉彬,等.高產(chǎn)截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌高通量篩選方法的建立[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2013，33(10):1590-1594.

[2] 黃賀賢,曾振靈,黃顯會.截短側(cè)耳素類抗生素——泰妙菌素的研究進(jìn)展[J].中國獸藥雜志，2010，44(6):42-45.

[3] KAVANAGH F,HERVEY A,ROBBINS W J.Antibiotic substances from basidiomycetes:Ⅷ.Pleurotusmultilus(Fr.) Sacc.andPleurotuspasseckerianusPilat[J].Proc Natl Acad Sci USA,1951,37(9):570-574.

[4] LABER G.Activity of various compounds against a pathogenic strain ofTr-

eponemahyodysenteriae[J].Zentralbl Bakteriol Orig A，1976，236(1):127-130.

[5] DAUM R S，KAR S，KIRKPATRICK P.Fresh from the pipeline:Retapamulin[J].Nat Rev Drug Discov，2007，6(11):865-866.

[6] 楊冠洲 ,尚若鋒.截短側(cè)耳素類化合物的研究進(jìn)展[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，46(8):1527-1532.

[7] 湯有志,遠(yuǎn)立國,劉雅紅.截短側(cè)耳素類抗生素的研究進(jìn)展[J].中國獸醫(yī)雜志，2012，48(5):65-68.

[8] 冉茜.基于響應(yīng)面方法優(yōu)化截短側(cè)耳素發(fā)酵產(chǎn)量[D].重慶：西南大學(xué)，2009.

[9] 劉衛(wèi)東,蘇浩,虞星炬.培養(yǎng)基瓊脂濃度及抗生素對3種海洋微藻生長的影響[J].生物技術(shù)，2006，16(6):75-77.

[10] 梅傳生,張金渝,湯日圣,等.瓊脂濃度對水稻愈傷組織植株再生率和內(nèi)源激素含量的影響[J].中國水稻科學(xué)，1993，7(3):148-152.

Optimization of Protoplast Regeneration Medium for the Producing Bacteria of Tiamulin by Using Response Surface Methodology

SUN Jin-gang, YANG Zhi, NIU Chun, ZHANG Ping*

(Ningxia Tairui Pharmaceutical Co., Ltd., Yinchuan, Ningxia 750101)

[Objective] To optimize the regeneration medium of protoplast for the producing bacteria of tiamulin by using response surface methodology. [Method] The concentrations of agar and sucrose in the regeneration medium of protoplast for the producing bacteria of tiamulin were optimized by using central composite response surface design and Minitab software. [Result] The regeneration medium of protoplast for the producing bacteria of tiamulin was optimized as 20.00% potato extract +2.00% glucose + 2.70% sucrose + 1.56% agar, pH=6.5. The regeneration rate of recovered colony increased from 0.7‰ to 3.5‰. [Conclusion] The research can lay the foundation for the development and research of tiamulin.

Response surface methodology; Tiamulin; Protoplast; Regeneration medium

孫金剛(1988- )，男，寧夏德隆人，從事菌種選育研究。 *通訊作者，高級工程師，從事菌種及微生物發(fā)酵研究。

2016-10-26

S859.79+6

A

0517-6611(2016)36-0149-02