膠體金免疫層析技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用

楊杰，李迎秋

（齊魯工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，濟(jì)南 250353）

膠體金免疫層析技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用

楊杰，李迎秋*

（齊魯工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，濟(jì)南 250353）

膠體金免疫層析技術(shù)是以免疫層析技術(shù)、膠體金標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的一種新型免疫學(xué)技術(shù)，具有精確、快速、特異、高效、便捷等特點(diǎn)，較適用于基層和現(xiàn)場快速檢測。文章主要論述了膠體金免疫層析技術(shù)的特點(diǎn)、基本原理和方法，并詳細(xì)介紹了該技術(shù)在藥物殘留、病原微生物、生物毒素方面的應(yīng)用現(xiàn)狀，結(jié)合該技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)對以后的發(fā)展方向進(jìn)行了展望。

膠體金免疫層析；原理；應(yīng)用

膠體金免疫層析技術(shù)（Colloidal-Gold Immunochromatography Assay，GICA）是20世紀(jì)末發(fā)展起來的一種新型體外診斷技術(shù)［1］，顯色物是膠體金，載體是硝酸纖維膜，在層析過程中就可以達(dá)到檢測的目的［2］。膠體金免疫層析技術(shù)的穩(wěn)定性強(qiáng)、體積小、方便快捷、敏感特異、不需要輔助儀器和試劑且操作人員不用進(jìn)行技術(shù)培訓(xùn)，方便于廣大基層檢驗(yàn)人員，檢測結(jié)果判斷清楚直觀，用時(shí)短，可對大批量樣品進(jìn)行現(xiàn)場檢測和大面積普查等，具有很大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應(yīng)用前景，并開始逐步應(yīng)用于食品安全的快速檢測。

1 膠體金免疫層析技術(shù)概述

1.1 概述

膠體金是在還原劑如硼氫化鈉、檸檬酸三鈉、鞣酸等的作用下，通過氯金酸（HAuCl4）聚合成為大小一定的金顆粒，在靜電作用下形成一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金［3］。這些顆粒具有較高的電子密度和較強(qiáng)的蛋白質(zhì)吸附性能，聚集成一定密度后就會(huì)形成能用肉眼觀察的粉紅色斑點(diǎn)，可用作指示劑［4］，用于定性或者半定量的檢測中。膠體金易于存儲(chǔ)、制備且價(jià)格比較低廉，應(yīng)用范圍廣，可以檢測多種物質(zhì)，同時(shí)具有高度的靈敏性和特異性，對細(xì)胞組織的非特異性吸附作用較小，檢測速度快，可靠性很高［5］。

1.2 原理

硝酸纖維素膜是一種條狀纖維層析材料，可以作為固相載體，在干燥的硝酸纖維素膜上分別噴涂抗原或抗體（T線，檢測線）和相應(yīng)的二抗（C線，控制線），形成兩條固定的隱形線。待檢樣品加在試紙條一端，樣品溶液在微孔膜的毛細(xì)作用下在層析條上發(fā)生泳動(dòng)。因T線中含有抗原或抗體，帶有游離膠體金顆粒的待測液進(jìn)入T線，與樣本中的待檢物發(fā)生高特異性、高親和性的結(jié)合反應(yīng)，免疫復(fù)合物的形成富集或被困在一個(gè)特定區(qū)域的層析試紙條（檢測線）［6］，這些標(biāo)記物（膠體金顆粒）在配位體上大量地聚集，可得到直觀的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象（顏色），而游離的標(biāo)記物則會(huì)越過檢測帶，當(dāng)待測液到達(dá)C線后，由于C線中含有抗待測液中的抗體或抗原，因此又會(huì)發(fā)生特異性結(jié)合使之顯色，以此來達(dá)到檢測目標(biāo)物質(zhì)和質(zhì)量控制的目的［7］。膠體金免疫層析可用于定性的快速免疫檢測方法中。

1.3 膠體金免疫層析的方法

膠體金免疫層析目前檢測的主要方法有間接法、夾心法、競爭法以及捕獲法。

1.3.1 間接法

間接法是用免疫金來標(biāo)記二抗，而沒有標(biāo)記的特異性抗體與已知抗原結(jié)合，并固定在T線上［8］，間接法常用來檢測血清樣本中的病毒如梅毒診斷試劑盒。

1.3.2 夾心法

1.3.2.1 雙抗體夾心法

用免疫金標(biāo)記針對待測抗原某一表位的單抗，針對另一表位的單抗包被在T線上，常被用來檢測病原微生物性的大分子抗原［9］，如檢測HCG的早孕檢測試紙條。

1.3.2.2 雙抗原夾心法

用免疫金標(biāo)記已知抗原，另一已知抗原包被于T線上，常用來檢測血清樣品中特異性抗體，檢測的是總抗體［10］，如乙型肝炎病毒表面抗體診斷試劑盒。

1.3.3 競爭法

將膠體金抗體與相對應(yīng)的抗原結(jié)合，固定在T線上，若僅有C線顯色即為陽性結(jié)果，若C線和T線都顯色即為陰性結(jié)果，與前兩種方法原理是相反的，常用來檢測小分子的抗原，如嗎啡、農(nóng)藥殘留、濫用藥物的檢測等［11］。

1.3.4 捕獲法

用于檢測感染人體后病原微生物抗體，因?yàn)檫@些病原微生物寄生在細(xì)胞內(nèi)，很難直接檢測到其特異性抗原［12］，如風(fēng)疹病毒、艾滋病毒等，還能檢測較難采集標(biāo)本的病原體。

2 膠體金免疫層析技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用

近幾年食品安全問題層出不窮，不僅對我國食品行業(yè)的發(fā)展造成了嚴(yán)重打擊，而且給我國經(jīng)濟(jì)造成了巨大的損失。近幾年相關(guān)行業(yè)加快了食品檢測技術(shù)的研究，可以利用更先進(jìn)的檢測技術(shù)對食品進(jìn)行有效、快速的檢測，膠體金層析技術(shù)具有檢測速度快、成本較低、適合基層人員檢測以及低交叉反應(yīng)性的優(yōu)點(diǎn)，這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于食品安全檢測分析中，可以更好地促進(jìn)食品檢測技術(shù)的發(fā)展。

2.1 藥物殘留的檢測

目前農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)的快速發(fā)展，帶來的問題也日益嚴(yán)重，如農(nóng)業(yè)中的農(nóng)藥殘留、養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中獸藥的濫用以及向食品中添加非法物質(zhì)（如瘦肉精、三聚氰胺以及β-激動(dòng)劑等）。這些藥物殘留不僅能增強(qiáng)細(xì)菌耐藥性，而且還能通過食物鏈和環(huán)境因素對人體健康造成間接的影響［13］，現(xiàn)已成為困擾世界衛(wèi)生的難題。雖然檢測藥物殘留的方法很多，但是多數(shù)檢測方法操作較繁瑣、儀器昂貴、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，還受基層應(yīng)用的限制，但用膠體金免疫層析技術(shù)檢測藥物殘留，可以充分發(fā)揮其特性，膠體金試劑和樣品量非常小，樣品的大小可低至1～2μL；檢測結(jié)果的確定不需要酶標(biāo)儀、熒光顯微鏡等昂貴的儀器，且所需時(shí)間短，更適合基層人員檢測和現(xiàn)場測試，此外，免疫膠體金的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可長時(shí)間保存［14］。近年來，膠體金免疫層析技術(shù)在藥物殘留快速檢測中的應(yīng)用也越來越廣泛。

農(nóng)藥和獸藥的種類很多，利用膠體金免疫層析技術(shù)可以制備針對某一種藥物的試紙條，檢測較為方便、快速。劉瑩［15］將有機(jī)磷農(nóng)藥與大分子物質(zhì)偶聯(lián)，制備了膠體金，并研制了有機(jī)磷金標(biāo)抗體探針，同時(shí)對試紙條各個(gè)部分做了實(shí)驗(yàn)探究，得出最佳體系配方，結(jié)果表明研制的試紙條能對9種有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行檢測，且最低檢測限可達(dá)0.25 mg／kg。膠體金免疫技術(shù)檢測的范圍較廣，靈敏度較高。李向梅等［16］研制出能同時(shí)檢測牛奶中慶大霉素和13種喹諾酮類殘留的膠體金免疫層析法。采用直接競爭法研制出相應(yīng)的膠體金快速檢測試紙條，結(jié)果顯示無交叉反應(yīng)。該試紙條的檢測限均為20 ng／m L，5 min內(nèi)完成了整個(gè)檢測過程，用時(shí)較短，檢測精準(zhǔn)且直觀。李超輝［17］通過正交試驗(yàn)，確定了針對克倫特羅膠體金免疫層析試紙條的最佳生產(chǎn)工藝條件，且該試紙條定量檢測線性范圍為0.1～1.5 ng／g，最低靈敏度達(dá)到0.19 ng／g，與傳統(tǒng)ELISA方法相比較，可顯示這兩種方法有很好的相關(guān)性。膠體金免疫層析技術(shù)檢測藥物殘留具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，可達(dá)ng～pg檢測范圍，可同時(shí)檢測多種藥物殘留，用膠體金免疫層析法檢測食品中藥物殘留越來越受到人們的青睞。

2.2 食品中病原微生物的檢測

食品安全問題中，首要問題是微生物污染。病原微生物引起的食品安全問題越來越嚴(yán)重，主要包括大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等，這些腸道微生物致病菌的存在會(huì)對人體健康造成嚴(yán)重的傷害。我們急需一種準(zhǔn)確、快速、方便檢測微生物的方法，以降低中毒時(shí)間的發(fā)生率。目前檢測病原微生物的主要方法有傳統(tǒng)法、生化鑒定法［18］、PCR法［19］和電化學(xué)法［20］，傳統(tǒng)法對細(xì)菌的分離、培養(yǎng)及生化鑒定時(shí)間比較長且不易檢出潛在的致病菌，對環(huán)境及主觀因素影響較大［21］，操作繁瑣。生化鑒定法要求很高的技術(shù)水平和資金投入，需要昂貴的儀器，PCR需要借助瓊脂糖凝膠電泳檢測，操作人員會(huì)受到危險(xiǎn)染料和紫外光的危害，這些都制約了在現(xiàn)場的快速檢測的應(yīng)用。

膠體金免疫層析技術(shù)不需要昂貴儀器，不用接觸到危險(xiǎn)品，并且操作簡便快速，現(xiàn)已研發(fā)出針對沙門氏菌、大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌等病原微生物的試紙條，快速、攜帶方便。夏詩琪等［22］制備了膠體金和沙門氏菌單克隆抗體，且研制了專門用來檢測沙門氏菌的膠體金免疫層析試紙條，這種試紙條能對食品中5種典型的沙門氏菌進(jìn)行高效快速的檢測，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。布日額等［23］制備了膠體金并標(biāo)記了鼠抗致病性金黃色葡萄球菌（S.aureus）IgG，研制出針對牛乳中S.aureus的膠體金試紙條，該試紙條對S.aureus具有很高的特異性，且與其他菌種無交叉反應(yīng)；具有穩(wěn)定、快速、特異、靈敏、操作簡單等特點(diǎn)，適合于S.aureus的現(xiàn)場快速檢測，膠體金免疫層析技術(shù)在病原微生物檢測中的作用將會(huì)越來越突出。

2.3 生物毒素的檢測

真菌毒素是比較常見且毒性很高的一種生物毒素，真菌毒素的污染范圍較廣，種類較多，且易和食品中的有機(jī)化合物結(jié)合［24］，對消費(fèi)者的健康造成很大的危害。目前國內(nèi)食品受毒素污染問題嚴(yán)重，造成這種現(xiàn)象的重要原因是缺少一種靈敏、快速、高效的檢測方法［25］。因此，食品質(zhì)量和安全監(jiān)督以及現(xiàn)場快速檢測食品中真菌毒素的建立具有重要的意義。膠體金免疫層析技術(shù)具有快速、敏感、單樣品檢測、適合廣大基層檢驗(yàn)人員以及可以現(xiàn)場快速檢測等眾多優(yōu)點(diǎn)，比較適合對真菌毒素污染的食品的現(xiàn)場快速檢測。

真菌毒素中主要的毒素有：黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2毒素等。黃曲霉毒素（Aflatoxins，AFs）是一種真菌代謝產(chǎn)物，黃曲霉毒素有很多種類，其中，黃曲霉毒素B1（AFB1）的毒性最強(qiáng)［26］，楊英等［27］先使用側(cè)流免疫層析技術(shù)，建立了檢測蓮子中黃曲霉毒素B1的膠體金試紙條，該試紙條的靈敏度可達(dá)2.5 ng／m L，且該膠體金試紙條的假陽性和假陰性率為0，該法適用于大批量蓮子中AFB1的現(xiàn)場快速檢測。赭曲霉毒素（Ochratoxins）會(huì)對動(dòng)物和人的肝臟和腎臟造成侵害。赭曲霉毒素有A，B，C和其他7種化學(xué)結(jié)構(gòu)類似物，其中赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）對動(dòng)物和人類影響較大、分布最廣，且產(chǎn)毒量最高，毒性也最大。扶勝等［28］用膠體金免疫層析技術(shù)對谷物和飼料中赭曲霉毒素A進(jìn)行了快速檢測，結(jié)果得出該試紙條對飼料樣品的檢測限為100 ng／m L，對谷物類樣品的檢測限為5 ng／m L，且假陰性率為0，假陽性率小于5%。該試紙條有較好的特異性，使用方便簡單，適合現(xiàn)場快速檢測。賈寅等［29］建立了小麥、稻谷和玉米中玉米赤霉烯酮的膠體金免疫層析快速定量檢測法，檢出限為5μg／kg，定量限為12μg／kg時(shí)，結(jié)果符合有關(guān)規(guī)定。膠體金免疫層析操作簡單，可以用肉眼直接觀察，結(jié)果能長期保存，便于普及和推廣。

3 膠體金免疫層析技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)及其展望

膠體金免疫層析技術(shù)具有成本低、結(jié)果準(zhǔn)確且清晰、不需要特殊設(shè)備且攜帶方便等優(yōu)點(diǎn)，這些優(yōu)點(diǎn)都是其他免疫學(xué)所無法比擬的。但是在實(shí)際研究和應(yīng)用中膠體金免疫技術(shù)仍有一些不足之處：首先，操作時(shí)的清潔度、顆粒本身的特性都會(huì)對結(jié)果造成影響，檢測的可重復(fù)性程度低；其次，被測樣品成分復(fù)雜、種類繁多，都會(huì)影響膠體金顆粒與蛋白的吸附和抗原抗體之間的反應(yīng)，試驗(yàn)結(jié)果不能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化存儲(chǔ)，會(huì)造成高假陽性、假陰性幾率。

以后的研究趨勢可以集中在以下幾點(diǎn)：（1）多元檢測?？梢允褂脝我荒さ臋z測線上包被多種檢測線以及多個(gè)或多種層析膜復(fù)合使用的形式，可以降低檢測的難度，大大節(jié)約了檢測時(shí)間和成本，對于多個(gè)指標(biāo)的檢測有重大的使用價(jià)值［30］。（2）擴(kuò)大檢測范圍，提高靈敏度。特異性抗原抗體的反應(yīng)信號(hào)的擴(kuò)增，膠體金的顯色效果的增大，生物素親和素系統(tǒng)與一些電化學(xué)設(shè)備和生物傳感器相結(jié)合等方法來擴(kuò)大檢測范圍［31］。通過生物素親和素系統(tǒng)和免疫金銀染色法加強(qiáng)銀染實(shí)驗(yàn)或者在膜上進(jìn)行修飾來提高靈敏度。（3）實(shí)現(xiàn)定量或半定量檢測。定性檢測只有陽性和陰性兩種結(jié)果，半定量檢測時(shí)，在膜上相隔一定距離包被幾條平行的抗體帶，層析后對顯色條的數(shù)量進(jìn)行觀察，從而將待測物含量確定于某一范圍內(nèi)［32］。在抗體包被量和加樣量精確控制的前提下，通過定量分析顯色時(shí)間的長短，或者通過結(jié)合反射光密度計(jì)測定光密度的強(qiáng)度得到具體的數(shù)字，從而計(jì)算定量，這將是免疫膠體金技術(shù)未來主要的發(fā)展方向。

科技在不斷地向前發(fā)展，膠體金免疫層析技術(shù)有著巨大的發(fā)展?jié)摿?，相信隨著相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展，這項(xiàng)技術(shù)能夠在食品檢測領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用。

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Application of Colloidal-Gold lmmunochromatography Assay（GlCA）in Food Safety Testing

YANG Jie，LI Ying-qiu*
（College of Food Science and Engineering，Qilu University of Technology，Ji＇nan 250353，China）

As a kind of novel immunological technique，Colloidal-Gold Immunochromatography Assay（GICA）combines immunochromatography with immunogold labeling technique and it is suitable for the primary and on-site rapid testing with the characteristics of accurate，rapid，specific，efficient and convenient.Mainly discuss the characteristics，basic principles and methods of GICA technology，and its application status in drug residues，pathogenic microorganisms and biotoxins.Combined with the advantages and disadvantages of GICA，its development prospects are expected.

GICA；principle；application

TS201.1

A

10.3969／j.issn.1000-9973.2017.10.037

1000-9973（2017）10-0171-05

2017－04－19 *通訊作者

山東省高?？茖W(xué)與技術(shù)發(fā)展規(guī)劃（J13LE02）

楊杰（1990－），女，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。