液態(tài)奶乳果糖的研究與應(yīng)用

田瑤，韓奇鵬，陳宇光，張佩華，王加啟，張仁富

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院畜禽遺傳改良湖南省重點實驗室，長沙410128；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100094；3.湘西自治州畜牧工作站，湖南吉首416000）

液態(tài)奶乳果糖的研究與應(yīng)用

田瑤1，韓奇鵬1，陳宇光1，張佩華1，王加啟2，張仁富3

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院畜禽遺傳改良湖南省重點實驗室，長沙410128；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100094；3.湘西自治州畜牧工作站，湖南吉首416000）

針對乳果糖的概念、結(jié)構(gòu)、檢測方法及其在不同加工工藝下含量變化規(guī)律的研究和乳品質(zhì)質(zhì)量評定中的應(yīng)用等方面進(jìn)行論述，為探尋與生產(chǎn)實際相結(jié)合的乳果糖檢測新方法體系提供理論參考。

液態(tài)奶；乳果糖；熱處理；

0 引言

很多國家（德國和奧地利等）對延長新鮮液態(tài)乳的貨架期越來越重視[1-3]?，F(xiàn)在延長新鮮液態(tài)乳貨架期（extended shelf life，ESL）一般采用巴氏滅菌、超高溫瞬時(ultra-high-temperature，UHT)滅菌、保持滅菌等加工工藝進(jìn)行熱處理[4-5]，進(jìn)而殺死新鮮液態(tài)乳中的腐敗菌和病原微生物等，但同時會引起一系列的化學(xué)反應(yīng)、某些營養(yǎng)成分的變化及產(chǎn)生新的物質(zhì)等[6-7]，從而造成新鮮液態(tài)乳營養(yǎng)品質(zhì)的下降。所以評價液態(tài)乳在熱加工處理中的受熱強度對監(jiān)測產(chǎn)品質(zhì)量、規(guī)范生產(chǎn)規(guī)程和保護(hù)消費者合法權(quán)益有著十分重要的意義[8]。目前新鮮液態(tài)奶熱處理工藝評定的重要指標(biāo)之一的乳果糖（4-0-β-galactopyranosyl-D-fructo-fura?nose，Lactulose）備受世界關(guān)注。本文主要針對乳果糖結(jié)構(gòu)特點、檢測方法和不同熱處理下的變化規(guī)律及在評價體系中的應(yīng)用進(jìn)行探討。

1 液態(tài)奶乳果糖的概念與結(jié)構(gòu)

20世紀(jì)50年代Adachi首次發(fā)現(xiàn)，在加熱牛奶過程中，酪蛋游離氨基集團(tuán)催化乳糖（Lactose）堿基異構(gòu)化生成的一種合成雙糖叫乳果糖[9-10]，又被稱為乳酮糖（Lactulax；Constilac；Duphalac）、半乳糖苷果糖、1-4-β-半乳糖苷果糖，其可通過β-D半乳糖苷酶水解生成含一分子果糖和一分子半乳糖，反應(yīng)式如圖1[11]。隨后Andrews研究發(fā)現(xiàn)Amadori重排反應(yīng)和LA轉(zhuǎn)運是乳果糖形成的主要條件。1960年Richards和Chan?drasekhara在55℃貯存21 d的脫脂乳粉中檢測到乳果糖[12]。當(dāng)然，乳糖異構(gòu)還會新生成一些其它物質(zhì)，如氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)生成糠氨酸及賴氨酸和丙氨酸交聯(lián)產(chǎn)生的賴丙氨酸等[13-15]。

2 液態(tài)奶乳果糖的檢測方法

眾所周知目前有很多適合檢測新鮮液態(tài)乳中乳果糖質(zhì)量濃度的方法[16-21]。乳果糖主要檢測方法有：生物傳感器法[22]、氣相色譜法（gas chromatography，GC）[23]、安培電流計法、離子交換色譜法[24]、MTT顯色法、微分pH計法[25]、及普及性和穩(wěn)定性較強的HPLC[26-28]和酶解法（測定產(chǎn)生果糖量計算生乳中乳果糖的質(zhì)量濃度）[29]及比高效液相色譜法(highperfor?mance liquid chromatography，HPLC)更加簡單、快捷及成本較低的彌漫反射傅里葉變換紅外光譜學(xué)檢測法[30-31]等。目前我國農(nóng)業(yè)行業(yè)使用的是乳果糖酶解法的檢測方法（標(biāo)準(zhǔn)NY/T 939-2005），而國際上則應(yīng)用的是ISO發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)：《Milk-determination of Lactu?lose Content-Enzymatic Method》（ISO 11285-2004）[29]和《Heat-treated Milk-determination of Lactulose Con?tent-method Using High-performance-liquid Chroma?tography》（ISO 11868-1997）[32]。此外，Renzo Marsili等[33]應(yīng)用陽離子蒸發(fā)光散射檢測器及采用內(nèi)標(biāo)法精確地檢測了乳果糖。Simon C.Fleming等[34]通過陰離子脈沖安培檢測器檢測了乳果糖的質(zhì)量濃度等。

2.1 酶法

酶法根據(jù)酶促反應(yīng)原理，添加酶量和培養(yǎng)溫度不同可分為ISO標(biāo)準(zhǔn)酶法和快速酶法。有研究表明，添加酶量越大、培養(yǎng)溫度越高，乳果糖完全水解所需的時間越短[35]；溫度較低會影響β-半乳糖苷酶的水解作用（最適溫度為43～53℃，其中來源曲霉的最適溫度為55℃）；黃萌萌等（2007）參考上述研究結(jié)果和ISO標(biāo)準(zhǔn)酶法（β-半乳糖苷酶水解乳果糖的培養(yǎng)溫度為40℃）[29]，對ISO標(biāo)準(zhǔn)酶法中水解乳果糖的步驟進(jìn)行改進(jìn)，提出了快速測定牛乳乳果糖的方法，稱為快速酶法（5.00 mL樣品中加入300 Uβ-半乳糖苷酶懸浮液，50℃培養(yǎng)1 h）[36]?？焖倜阜蓽?zhǔn)確測定巴氏殺菌乳和生鮮牛乳的乳果糖質(zhì)量濃度，并可用做區(qū)分UHT滅菌乳和巴氏殺菌乳的指標(biāo)[37]。

但酶法對檢測用器皿清潔度和環(huán)境微生物含量要求很高；且培養(yǎng)時間決定了檢測周期，若大批測量需要較短的培養(yǎng)時間；同時，牛乳中微生物生長所需的最適溫度一般為20～45℃，但酶法采用的培養(yǎng)溫度都會高于此溫度。所以酶法檢測的關(guān)鍵是器皿和環(huán)境的清潔、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間及酶的添加濃度。

2.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）主要應(yīng)用蒸發(fā)光散射檢測器和碳水化合物分析柱進(jìn)行定量分析乳果糖質(zhì)量濃度。此法可有效分離乳糖和乳果糖，并具有快速準(zhǔn)確的特點[38-39]。高效液相色譜法可采用4種不同的色譜柱分析底乳糖酸乳和滅菌乳中乳果糖的質(zhì)量濃度，其中陽離子交換樹脂柱、氨基鍵合硅膠柱和氨基鍵合柱可有效分離乳糖（檢測限為3.8 mg/L）和乳果糖（檢測限2.5 mg/L）[40-41]。此外，先將樣品浸泡在乙醇中，待樣品沉淀后，再采用HPLC測定濾液中乳糖質(zhì)量濃度的外標(biāo)法（檢測限為0.013 mg/L，回收率為97.92%）也可測定牛乳中乳果糖質(zhì)量濃度。HPLC比酶法成本較低、更易掌握、快速準(zhǔn)確和操作簡單等特點[42-43]。

高效液相色譜法雖然可以直接檢測乳果糖質(zhì)量濃度，但實際檢測過程中還存在很多問題，如蛋白質(zhì)的去除（先離心分離，再超濾膜過濾，或用試劑沉降蛋白）、去除脂肪（離心可去除）、區(qū)分乳糖和乳果糖（選擇合適的色譜柱及合適的流動相種類和配比）。

2.3 氣相色譜法

氣相色譜法可精確測量乳果糖及其他糖類。此法需先水解多糖，多糖變單糖后，采用衍生試劑將單糖衍生成易于氣化的物質(zhì)，再利用氣相色譜分離、定量。氣相色譜靈敏度高于HPLC，且易于分離乳果糖和其他碳水化物。研究發(fā)現(xiàn)，脫脂乳中乳果糖檢測限是50 mg/L或更低[37]。

氣相色譜法的檢測限可滿足眾多產(chǎn)品的檢測。此法關(guān)鍵技術(shù)是采取怎樣的制備方法，使碳水化合物合理的衍生，從而提高檢測的準(zhǔn)確度和靈敏度。

2.4 離子色譜電化學(xué)方法（HPAEC-PAD）

離子色譜電化學(xué)方法是脈沖安培將測器和離子交換柱的結(jié)合，可定量分析乳果糖的質(zhì)量濃度。此法在強堿性淋洗液中離子化，然后利用陰離子交換柱分離，再利用金電極脈沖安培檢測器進(jìn)行檢測。離子色譜電化學(xué)方法可同時檢測乳果糖（檢測限0.02 mg/L）和乳糖質(zhì)量濃度（檢測限0.012 mg/L），實現(xiàn)了快速、準(zhǔn)確的檢測無乳糖酸乳、原料乳和巴氏殺菌乳中乳果糖質(zhì)量濃度[44-45]。

3 液態(tài)奶乳果糖含量變化規(guī)律的研究與應(yīng)用

乳果糖的水平含量不但可以衡量新牛奶熱處理效應(yīng)，而且可以區(qū)分牛奶殺菌方法的類型[9]。但目前鮮有研究乳果糖質(zhì)量濃度隨熱處理程度變化的具體情況，主要是將其作為區(qū)分巴氏殺菌乳、超高溫瞬時處理（UHT滅菌乳采用的溫度一般在135～145℃，高的可達(dá)150℃[46]）和滅菌奶的鑒別指標(biāo)[47]。還有歐盟（EU）國際奶業(yè)聯(lián)合會（IDF）將乳果糖作為鑒別UHT滅菌乳或UHT滅菌乳中復(fù)原乳的指標(biāo)之一[48-51]。此外，有研究表明，乳果糖（lactulose，LCT）質(zhì)量濃度可用來辨別直接超高溫瞬時處理（UHT direct heating method，UHT-DM）和間接超高溫瞬時處理（UHT indirect heating method，UHT-IM）奶[52-53]。

3.1 鮮液態(tài)乳乳果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化規(guī)律

據(jù)報道，生鮮乳經(jīng)75℃/15 s熱處理，乳果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.9 mg/100 g蛋白質(zhì)[11]。

3.2 UHT滅菌乳乳果糖質(zhì)量濃度變化規(guī)律

目前采用UHT滅菌熱處理鮮奶的研究較多，但并未闡明乳果糖質(zhì)量濃度與處理溫度和時間的關(guān)系。UHT滅菌乳質(zhì)量濃度整體變化在50～106.5 mg/L，間接UHT滅菌乳（150℃）中乳果糖質(zhì)量濃度為226.8～1065.1 mg/L，直接UHT滅菌乳（140℃）中乳果糖質(zhì)量濃度為120～427.50 mg/L。張景亮等[54]發(fā)現(xiàn)滅菌奶的乳果糖質(zhì)量濃度高于600 mg/L。黃萌萌等[55]針對商業(yè)UHT滅菌乳（19℃±2℃）貯存期間（2個月）乳果糖變化規(guī)律做了相應(yīng)的研究。結(jié)果顯示，在貨架前期UHT滅菌乳中乳果糖質(zhì)量濃度相對穩(wěn)定，隨著貯存時間的延長，其質(zhì)量濃度逐漸增高，這可能與其生產(chǎn)工藝有關(guān)。

3.3 巴氏殺菌乳乳乳果糖含量變化規(guī)律的研究與應(yīng)用

巴氏殺菌乳中的乳果糖質(zhì)量濃度（范圍分布2.7～32.1 mg/L之間）低于高溫巴氏殺菌乳的乳果糖質(zhì)量濃度（范圍為6.7～58 mg/L）[56]，而Olano等[57]得出，巴氏殺菌工藝在低溫長時使鮮乳產(chǎn)生的乳果糖含量較少（63℃加熱30 min，乳果糖含量為5.2 mg/L）。由于巴氏殺菌乳的生產(chǎn)工藝不同，導(dǎo)致乳果糖含量存在差異。Pellegrino等[58]和Feinberg等[59]研究發(fā)現(xiàn)，巴氏殺菌乳中乳果糖隨加工溫度和時間的增加而增高，但具體變化規(guī)律尚不清楚。

3.4 復(fù)原乳乳果糖質(zhì)量濃度變化規(guī)律

全脂乳粉或/和煉乳與水配比形成的原料乳被稱作“復(fù)原乳”或“原料乳”（reconstituted milk），其由于加工過程中濃縮和干燥階段的處理強度較低及干燥過程中熱處理溫度比超高滅菌等工藝較溫和，所以生成的乳果糖含量較少[58]。有研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)原乳中乳果糖質(zhì)量濃度在23.0～78.5 mg/L或24.2～48.8 mg/L之間[60]，由于檢測方法的不同，復(fù)原乳中乳果糖質(zhì)量濃度存在差異。目前乳果糖作為測定UHT滅菌乳中復(fù)原乳質(zhì)量濃度的指標(biāo)之一，但UHT滅菌乳和巴氏殺菌乳中乳果糖質(zhì)量濃度與復(fù)原乳質(zhì)量濃度的關(guān)系尚無研究。

3.5 其他因素對乳果糖質(zhì)量濃度變化規(guī)律的影響

除加工工藝影響乳果糖質(zhì)量濃度外，還有pH值、貯存條件和添加劑（磷酸鹽和檸檬酸鹽）[61]等。有研究顯示，當(dāng)牛乳中pH值范圍為6.7～6.8之間時，乳果糖質(zhì)量濃度的變化較小，而低于6.7時，乳果糖質(zhì)量濃度降低，高于6.8時，乳果糖質(zhì)量濃度增加[62]。貯存溫度與時間同樣影響乳果糖質(zhì)量濃度，UHT滅菌乳貯存時間在6個月以上，乳果糖質(zhì)量濃度不變，但保持法滅菌乳則40 d乳果糖質(zhì)量濃度持續(xù)增加[9]，且直接滅菌乳比間接滅菌乳較穩(wěn)定[63]。還有研究發(fā)現(xiàn)，UHT滅菌乳在22℃和30℃貯存90 d，乳果糖質(zhì)量濃度分別為（20±4）mg/L和（95±10）mg/L[60]；持續(xù)滅菌法只有在35℃下，每貯存60 d，乳果糖質(zhì)量濃度增加126 mg/L；而酶法在25℃和35℃下乳果糖質(zhì)量濃度均有所增加。

4 結(jié)束語

乳果糖是UHT滅菌乳、復(fù)原乳和巴氏殺菌乳等不同加工工藝下乳糖異構(gòu)化的產(chǎn)物，是評定奶品質(zhì)量及衡量牛奶熱處理損傷程度和區(qū)分加工工藝的重要指標(biāo)之一。隨著科技的不斷發(fā)展與進(jìn)步，為快速、準(zhǔn)確、簡便、高效的探尋不同加工工藝下乳果糖質(zhì)量濃度與處理時間及溫度的變化關(guān)系成為可能，從而為建立液態(tài)乳標(biāo)準(zhǔn)新體系打下基礎(chǔ)。但由于成本、技術(shù)等問題乳果糖的測定方法尚未能投入實際生產(chǎn)中去，所以探尋適合生產(chǎn)實際使用的乳果糖檢測方法有著實際生產(chǎn)意義。

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Research and application of lactulose in liquid milk

TANG Yao1,HAN Qipeng1,CHEN Yuguang1,ZHANG Peihua1,WANG Jiaqi2,ZHANG Renfu3
(1.Hunan Provincial Key Laboratory for Genetic Improvement of Domestic Animal,College of Animal Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128，China;2.State Key laboratory of Animal Nutrition,Insti?tute of Animal Science,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Ministry of Agiculture Milk and Dairy Quality Super?vision and Inspection Evaluation Center(Beijing),Beijing 100094,China;3.Animal Husbandry Station of Xiangxi Au?tonomous Prefecture,Jishou 416000，China)

This paper mainly focuses on the discussion of the concept and testing method and structure of lactulose,and its concentration un?der different processing technology to research of change rule,and application of the quality evaluation of dairy products,etc.In order to pro?vide a theoretical reference for combined with production practice the detection system of lactulose concentration.

liquid milk;lactulose;heat treatment;

TS252.1

：B

：1001-2230（2017）06-0030-05

2016-09-27

田瑤（1992-），女，碩士，從事牛奶質(zhì)量評價及檢測方法研究。

陳宇光