抗菌肽在抗流感病毒和免疫調(diào)節(jié)中的作用機(jī)制研究進(jìn)展

張守平 ， 王麗榮 ， 夏小靜 ， 王三虎 ， 胡建和

(河南科技學(xué)院動物科技學(xué)院 ， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

流感病毒(IAV)為分節(jié)段的RNA病毒，極易發(fā)生變異，感染后可以激發(fā)很強的先天性和獲得性免疫反應(yīng)。流感病毒基因組可以通過基因突變及片段的重組而不斷產(chǎn)生新毒株。通常來說，流感病毒感染后，CD8+T細(xì)胞約需要5～7 d才能達(dá)到肺部發(fā)揮作用，而在此時間段先天性免疫就顯得尤為重要?？咕?antimicrobial peptides, AMPs)作為體內(nèi)先天性免疫的重要組成部分，其抗流感病毒活性逐漸引起學(xué)者的關(guān)注。在本文中，我們將對天然的抗菌肽和優(yōu)化的抗菌肽類似物的抗IAV和免疫調(diào)節(jié)活性機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 AMPs的抗流感病毒活性

人類呼吸道黏液里含有兩類雙親性的AMPs： 防御素類和抗菌肽類。大量研究顯示，這兩類AMPs均可以發(fā)揮抗流感病毒的作用。

1.1 防御素和流感病毒 防御素主要分為兩類：α-防御素和β-防御素。有一類α-防御素主要表達(dá)于嗜中性粒細(xì)胞，因此又稱為人嗜中性粒細(xì)胞肽(Human neutrophil peptides, HNPs)1-4。HNP在感染的早期起到抗病毒作用，因為在感染早期，支氣管中浸潤的嗜中性粒細(xì)胞可以啟動免疫反應(yīng)。此外，HNPs還參與嗜中性粒細(xì)胞胞外殺菌網(wǎng)絡(luò)(Neutrophil extracellular traps, NETs)的抗感染作用[1-2]。還有一類α-防御素主要表達(dá)于上皮細(xì)胞，主要是腸道和泌尿生殖道的上皮細(xì)胞，稱為人防御素(Human defensins, HDs)5和6。雖然HD有可能有抗IAV的作用，但是這方面的報道比較少。而β-防御素則主要表達(dá)于上皮細(xì)胞，在IAV感染過程中發(fā)揮主要的抗病毒作用[3]。

1.1.1 HNPs和IAV 當(dāng)前，關(guān)于HNPs詳細(xì)的抗病毒機(jī)制并不是很清楚。研究發(fā)現(xiàn)，HNPs可以引起病毒凝集，并通過與病毒直接作用發(fā)揮抗病毒效果。將上皮細(xì)胞在感染前和感染后加入防御素孵育，只能起到很小的抑制病毒活性的作用。但是使用HNPs與病毒粒子孵育以后則可以抑制病毒活性[4]。與此相反的是，Salvatore等發(fā)現(xiàn)，HNPs抑制IAV的活性是通過抑制上皮細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶C的活化來完成的。此外，防御素可以形成多分子復(fù)合物從而增強與病毒的結(jié)合活性，這也有可能是防御素可以凝集病毒的原因。HNPs發(fā)揮抗病毒作用與傳統(tǒng)的藥物不同，不是經(jīng)由抑制HA或其他蛋白活性實現(xiàn)的[5]。

1.1.2 β-防御素和IAV 人β-防御素(Human β-defensins, HBDs)，主要是由呼吸道上皮細(xì)胞產(chǎn)生，發(fā)揮炎癥應(yīng)答和抗病毒作用。HBDs的抗病毒效果不如HNP，但是可以在IAV感染過程中發(fā)揮很重要的免疫調(diào)節(jié)作用[6]。Ryan等研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，體內(nèi)缺失β-防御素(mouse β defensins, mBD1)的小鼠感染IAV后可以引起肺臟內(nèi)更高的炎性反應(yīng)，但是病毒載量差別不大。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，IAV感染后引起的mBD1上調(diào)主要是由胞漿內(nèi)的樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生的[7]。

1.1.3 Retrocylins 除上述兩種，還有一類防御素主要表達(dá)于非人靈長類，同樣具有很強的抗IAV活性，稱為θ-防御素或retrocylins(環(huán)形的特點)。Retrocylins與HNPs具有類似功能，可以引起IAV凝集并且具有比HNPs更強的內(nèi)在抗病毒活性[8]。有研究顯示，Retrocylins及其他防御素類可以發(fā)揮凝集素的作用結(jié)合到病毒分子的糖分子上，從而發(fā)揮抗病毒活性[9]。

1.2 LL-37和流感 有一類抗菌肽稱為Cathelicidins抗菌肽，其中具有代表性的就是LL-37。LL-37具有廣譜的活性，包括抗病毒活性，免疫細(xì)胞的趨化活性，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的炎性反應(yīng)，調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞的反應(yīng)等[10-11]。LL-37極有可能參與IAV感染后的宿主反應(yīng)。LL-37與HNPs相類似的，都是在受到在某些分子刺激后由嗜中性粒細(xì)胞合成并釋放。白三烯B4(TLB4)可以通過刺激呼吸道上皮細(xì)胞使其產(chǎn)生LL-37和β-防御素從而增強抗IAV能力[12]。

2 AMPs的免疫調(diào)節(jié)活性

除了具有直接的抗微生物或病毒活性外，AMPs還有一個很重要的作用就是介導(dǎo)免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。

2.1 對嗜中性粒細(xì)胞的病毒攝入、呼吸暴發(fā)和NET形成的作用 HNPs，retrocyclins等可以提高嗜中性粒細(xì)胞攝入病毒的能力，在單核細(xì)胞中也觀察到了同樣的結(jié)果[4,13]。從這類結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)，AMPs提高病毒攝入的能力主要是經(jīng)由提高凝集病毒的能力。與這一推測相一致的就是LL-37并不改變嗜中性粒細(xì)胞攝入病毒的能力[2]。AMPs可以影響嗜中性粒細(xì)胞呼吸暴發(fā)反應(yīng)。IAV感染后可以引起以H2O2為代表的明顯的呼吸暴發(fā)，添加HNPs后，H2O2釋放量明顯降低；而LL-37除可以影響H2O2反應(yīng)，還可以增強IAV感染過程中NET的形成[14]。巨噬細(xì)胞表面具有多種LL-37分子的受體，如甲?；氖荏w(formyl peptide receptor 2, FPR2)，CXCR2，表皮生長因子受體(EGFR)和P2X7受體(P2X7 receptor, P2X7R)等。IAV感染后，使用FPR2的特異性受體阻斷劑可以觀察到LL-37經(jīng)由FRP2介導(dǎo)的明顯的H2O2和NET反應(yīng)[2]。

2.2 IAV感染后細(xì)胞因子反應(yīng)的影響 IAV感染后可以刺激嗜中性粒細(xì)胞產(chǎn)生IL-8，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎性因子(如TNF或IL-6)，此類促炎性因子的釋放可以導(dǎo)致各類綜合征和肺損傷的發(fā)生。大量相關(guān)研究均顯示，降低感染后的炎性反應(yīng)對減輕肺損傷有重要作用。LL-37可以降低多種刺激下誘導(dǎo)的細(xì)胞因子反應(yīng)。有研究顯示，LL-37可以降低IAV和LPS所引起的嗜中性粒細(xì)胞中IL-8的釋放[15]。當(dāng)前的研究主要集中于IAV感染后多種AMPs對單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子作用。

2.3 AMPs在獲得性免疫中的作用 AMPs可以招募和激活免疫細(xì)胞，因此也被稱為“警報素”。AMPs通過多種途徑調(diào)節(jié)獲得性免疫反應(yīng)。例如，HBDs和其他的防御素可以結(jié)合到淋巴細(xì)胞表面的受體上起到趨化的作用。LL-37可以增強DCs向T細(xì)胞遞呈抗原的能力。α-防御素可以增強腸病毒感染中的抗體中和反應(yīng)[16-18]。目前，這類活性在IAV感染過程中還沒有出現(xiàn)，但是在未來的研究中還是很值得深入探索的。

3 修飾合成的具有抗病毒活性的AMPs

當(dāng)前有大量的研究致力于改進(jìn)或合成防御素類似物從而提高其抗細(xì)菌和抗病毒活性。近期Zhao等的研究顯示，測定小鼠β-防御素4(mBD4)不同片段對呼吸道病毒，人源和禽源IAV，SARS-CoV和MERS-CoV的作用效果。其中有一個長為30個氨基酸殘基的mBD4片段(作者命名為P9)在體內(nèi)和體外都具有活性且超過完整的40個氨基酸殘基的本體肽段。同時P9還可以提高感染致死劑量的H5N1和H7N9小鼠的存活率[19]。這個研究為我們提供一個有趣的例子，就是天然產(chǎn)生的防御素截短片段可能具有比本體更強的活性。而截短片段GI-20含有LL-37的核心螺旋結(jié)構(gòu)，在體外可以抑制pandemic/H1N1/2009，但是LL-37和其他片段不具有此活性[20]。

4 展望

針對IAV兩種傳統(tǒng)藥物的耐藥毒株已經(jīng)出現(xiàn)，迫切需要開發(fā)新型的針對IAV的藥物。IAV所導(dǎo)致的死亡主要是由于嚴(yán)重的肺損傷，多系統(tǒng)炎癥或者細(xì)菌的雙重感染等引起，因此新型的藥物研發(fā)方向是抗病毒、抗細(xì)菌和抗炎癥。AMPs是抗微生物肽，不僅對宿主防御病原體有重要作用，同時還可以調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥反應(yīng)。未來的研究將集中于探索肺臟內(nèi)AMPs與宿主其他防御蛋白的互作及最佳給藥途徑從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更多的AMPs及探索AMPs抵抗IAV流行毒株的機(jī)理。

[1] Narasaraju T, Yang E, Samy R P,etal. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis [J]. The American journal of pathology， 2011，179(1)：199-210.

[2] Tripathi S, Verma A, Kim E J,etal. LL-37 modulates human neutrophil responses to influenza A virus [J]. Journal of leukocyte biology，2014，96(5)：931-938.

[3] Doss M, White M R, Tecle T,etal. Interactions of alpha-, beta-, and theta-defensins with influenza A virus and surfactant protein D [J]. Journal of immunology，2009，182(12)：7 878-7 887.

[4] Doss M, Ruchala P, Tecle T,etal. Hapivirins and diprovirins: novel theta-defensin analogs with potent activity against influenza A virus[J]. Journal of immunology，2012，188(6)：2 759-2 768.

[5] Hartshorn K L, White M R, Tecle T,etal. Innate defense against influenza A virus: activity of human neutrophil defensins and interactions of defensins with surfactant protein D[J]. Journal of immunology，2006，176(11)：6 962-6 972.

[6] Jiang Y, Wang Y, Kuang Y,etal. Expression of mouse beta-defensin-3 in MDCK cells and its anti-influenza-virus activity[J]. Archives of virology，2009，154(4)：639-647.

[7] Ryan L K, Dai J, Yin Z,etal. Modulation of human beta-defensin-1 (hBD-1) in plasmacytoid dendritic cells (PDC), monocytes, and epithelial cells by influenza virus, Herpes simplex virus, and Sendai virus and its possible role in innate immunity[J]. Journal of leukocyte biology，2011， 90(2)：343-356.

[8] Liang Q L, Zhou K, He H X. Retrocyclin 2: a new therapy against avian influenza H5N1 virus in vivo and vitro[J]. Biotechnology letters，2010，32(3)：387-392.

[9] Leikina E, Delanoe-Ayari H, Melikov K,etal. Carbohydrate-binding molecules inhibit viral fusion and entry by crosslinking membrane glycoproteins[J]. Nature immunology，2005，6(10)：995-1 001.

[10] Doss M, White M R, Tecle T,etal. Human defensins and LL-37 in mucosal immunity[J]. Journal of leukocyte biology，2010， 87(1)：79-92.

[11] Tecle T, Tripathi S, Hartshorn K L. Review: Defensins and cathelicidins in lung immunity[J]. Innate immunity，2010，16(3)：151-159.

[12] Gaudreault E, Gosselin J. Leukotriene B4 induces release of antimicrobial peptides in lungs of virally infected mice[J]. Journal of immunology，2008，180(9)：6 211-6 221.

[13] Tecle T, White M R, Gantz D,etal. Human neutrophil defensins increase neutrophil uptake of influenza A virus and bacteria and modify virus-induced respiratory burst responses[J]. Journal of immunology，2007，178(12)：8 046-8 052.

[14] Hartshorn K L, Collamer M, White M R,etal. Characterization of influenza A virus activation of the human neutrophil[J]. Blood，1990，75(1)：218-226.

[15] Hu Z, Murakami T, Suzuki K,etal. Antimicrobial cathelicidin peptide LL-37 inhibits the LPS/ATP-induced pyroptosis of macrophages by dual mechanism[J]. PloS one，2014，9(1)：e85765.

[16] Davidson D J, Currie A J, Reid G S,etal. The cationic antimicrobial peptide LL-37 modulates dendritic cell differentiation and dendritic cell-induced T cell polarization[J]. Journal of immunology，2004，172(2)：1 146-1 156.

[17] Gounder A P, Myers N D, Treuting P M,etal. Defensins Potentiate a Neutralizing Antibody Response to Enteric Viral Infection[J]. PLoS pathogens，2016，12(3)：e1005474.

[18] Grigat J, Soruri A, Forssmann U,etal. Chemoattraction of macrophages, T lymphocytes, and mast cells is evolutionarily conserved within the human alpha-defensin family[J]. Journal of immunology，2007，179(6)：3 958-3 965.

[19] Zhao H, Zhou J, Zhang K,etal. A novel peptide with potent and broad-spectrum antiviral activities against multiple respiratory viruses[J]. Scientific reports，2016，6：22008.

[20] Tripathi S, Wang G, White M,etal. Identifying the Critical Domain of LL-37 Involved in Mediating Neutrophil Activation in the Presence of Influenza Virus: Functional and Structural Analysis[J]. PloS one，2015，10(8)：e0133454.