16S rDNA擴增子測序揭示長期定位秸稈還田對土壤細菌群落的影響

袁銘章，劉樹堂，陳延玲，辛 勵，劉錦濤

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 青島 266109)

16S rDNA擴增子測序揭示長期定位秸稈還田對土壤細菌群落的影響

袁銘章，劉樹堂，陳延玲，辛 勵，劉錦濤

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 青島 266109)

為探究典型的長期定位秸稈還田耕作模式對土壤微生物多樣性的影響以及土地施肥變化與生態(tài)環(huán)境效應(yīng)之間的關(guān)系，利用連續(xù)進行6年的長期定位秸稈還田試驗，采用16S rDNA 擴增子測序技術(shù)，分析土壤細菌群落結(jié)構(gòu)組成的情況。結(jié)果表明，土壤長期施入秸稈和有機肥可提升土壤細菌群落多樣性及物種豐富度。秸稈還田后土壤中細菌優(yōu)勢種群為變形桿菌和酸桿菌。主成分分析顯示，各處理間微生物種類及含量有明顯差別。WC與WCN處理N、P、K等速效養(yǎng)分含量有明顯差別。WCN處理中的N、P、K等速效養(yǎng)分，有機碳含量與蔗糖酶、脲酶、纖維素酶活性顯著高于WC。秸稈還田施用氮肥顯著增加土壤養(yǎng)分含量，增強土壤酶活性，有利于土壤細菌群落的多樣性和穩(wěn)定性的提高，改善土壤生態(tài)環(huán)境，從而促進作物增產(chǎn)。

秸稈還田；16S rDNA；長期定位；細菌群落

秸稈還田技術(shù)不僅是回收利用秸稈的一種重要方式，還可以減少因秸稈焚燒造成的環(huán)境污染等問題[1]。長期秸稈還田不僅能夠提升土壤細菌物種豐富度、微生物群落多樣性，還有利于土壤養(yǎng)分循環(huán)及肥力的提高，提供良好的土壤生態(tài)體系[2]。土壤細菌是影響農(nóng)田生態(tài)循環(huán)的重要因子之一[3]，與各種土壤環(huán)境中微生物活性密切相關(guān)，是評價土壤質(zhì)量的重要生物指標[4-5]。隨著有關(guān)學(xué)者對微生物種類的深入研究，微生物核糖體數(shù)據(jù)庫得到了日益完善，16S rDNA 擴增子測序作為細菌等微生物的識別與鑒定的主要工具也得到了高度認可[6-7]。

迄今為止，對于潮土土壤細菌多樣性研究，多數(shù)以其分布規(guī)律、酶活性等為基礎(chǔ)進行研究土壤細菌群落結(jié)構(gòu)以及代謝特征；而在分子水平上，特別是利用16S rDNA 基因測序技術(shù)對長期定位秸稈還田土壤細菌的微生物多樣性進行的研究鮮見報道[8-9]。

本試驗從土壤細菌微生態(tài)角度出發(fā)，運用DNA擴增因子測序技術(shù)，對長期不同秸稈還田施肥處理下的土壤細菌的物種豐富度、變化程度及物種均勻度進行了研究，揭示了農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的細菌群落組成與結(jié)構(gòu)的基本差異，較為客觀地反映了細菌群落的真實情況，從而為保護農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)的正確管理提供了合理的量化理論支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗設(shè)在山東萊陽長期定位試驗站，非石灰性潮土。施肥前耕層土壤全氮量0.60 g/kg，全磷量0.64 g/kg，土壤有效磷16.34 mg/kg，土壤速效鉀72.00 mg/kg，陽離子代換量為13.80 cmoL/kg，pH 值6.8，土壤有機質(zhì)含量為5.01 g/kg。

試驗始于2009年秋。開始試驗設(shè)置5個處理：1季秸稈還田(WN)、2季秸稈還田(WC)、2季秸稈還田施氮肥(WCN)、單施有機肥(M)，具體施肥見表1。每個處理做空白對照，且做3次重復(fù)，隨機分區(qū)排列，其間均設(shè)隔離板。

試驗以冬小麥-夏玉米每年2作的輪作制進行，冬小麥品種為煙優(yōu)361；夏玉米品種為魯玉16號。尿素做無機肥，豬圈糞做有機肥，含全氮量2.1～3.0 g/kg，含全磷量0.48～2.20g/kg，有機質(zhì)含量20～50 g/kg，干燥的玉米、小麥秸稈其全氮含量平均為1.93%、施用高低量均以與無機氮肥等含氮量計算。

表1 試驗處理Tab.1 Experimental treatment

注：+.單季小麥；++.小麥-玉米。

Note：+.Single season wheat；+ +.Wheat and corn.

1.2 樣品采集

土壤樣品在2015 年玉米收獲期采集，按“S”形多點采樣法取表層(0～20 cm)混合土壤，混勻后作為該施肥處理的1個試驗樣品，取200 g 新鮮土壤進行冷存。

1.3 土壤養(yǎng)分的測定

有機質(zhì)測定采用K2Cr2O7容量-外加熱法；土壤的水解性N測定采用堿解擴散法；采用NaHCO3浸提P；K測定采用乙酸溶液浸提-火焰光度計法；用pHS-3c儀器測定pH值[10]。

1.4 高通量測序及數(shù)據(jù)處理

提取(CTAB法)樣品的基因組DNA。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度、濃度，并使樣品進行離心至1 ng/μL。稀釋后的基因組DNA為模板；根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物High-Fidelity PCR，利用高效、高精度的酶進行聚合酶鏈反應(yīng)，以確保擴增效率和準確度。引物對應(yīng)區(qū)域16S V4區(qū)引物為515F-806R。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，產(chǎn)物濃度為2%，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，用熱凝膠回收試劑盒收集產(chǎn)品[11]。

1.4.1 Library 構(gòu)建和測序 通過新英格蘭生物公司的生物DNA數(shù)據(jù)庫，比對模型中數(shù)據(jù)，合格后進行上機測序[12]。

1.4.2 Information分析流程 將原始數(shù)據(jù)進行拼接和過濾，然后基于Operational Taxonomic Units 進行Cluster和物種分類分析，這樣能確保信息分析的結(jié)果更加準確、可靠。結(jié)合利用原始數(shù)據(jù)做出的物種注釋，得到了每個樣本的基本分析結(jié)果。同時，在CK、WN、WCN、WC、M處理的物種豐富度、多樣性指數(shù)等進行分析的同時，對5個處理群落結(jié)構(gòu)進行統(tǒng)計分析，對各層次的物種進行標注。最終，結(jié)合對秸稈還田不同施肥處理數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上，再進行了多種多樣的SCCA(物種多樣性分析Cluster analysis of species composition)，PCA呈現(xiàn)了基因組成差異，并與環(huán)境因子進行了相關(guān)性分析[13-16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥對土壤養(yǎng)分的影響

與CK相比，長期秸稈還田(WN、WC和WCN)和有機肥(M)顯著增加土壤全氮、堿解氮、有效磷、有機碳含量，尤其是長期秸稈還田與氮肥或有機肥單獨應(yīng)用，養(yǎng)分含量提高更顯著。長期秸稈還田和施肥處理不影響土壤的酸堿度(表2)，但玉米產(chǎn)量有顯著差異，主要規(guī)律為WCN>M>WN>WC>CK，與CK相比，玉米產(chǎn)量分別依次增加16.1%，13.6%，9.9%，7.6%。3種不同秸稈還田和有機施肥處理的土壤蔗糖酶、脲酶、纖維素酶活力的影響均顯著提高(表3)，其中，WC土壤酶活性最低，WCN酶活性最高，WN和M處理居中。

表2 不同處理土壤養(yǎng)分含量與pH值Tab.2 Different treatments of soil nutrient content and pH value

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。CK.對照；WC.玉米-小麥兩季秸稈還田；WN.小麥秸稈還田配施276 kg/hm2氮肥；M.有機肥，6 000 kg/hm2豬糞；WCN.小麥玉米秸稈還田配施276 kg/hm2氮肥。表3-4同。

Note：The different small letters represent significant difference(P<0.05).CK.Control；WC.Maize-wheat season straw；WN.Wheat straw returned to the field with application of 276 kg/ha N；M.Organic fertilizer，6 000 kg/ha，pig manure；WCN.Wheat and maize straw returned to the field with 276 kg/ha N.The same as Tab.3-4.

表3 不同處理土壤蔗糖酶、脲酶、纖維素酶活性與玉米產(chǎn)量Tab.3 The activity of invertase，urease，cellulase and the yield of maize in different treatments

2.2 稀釋曲線

對Illumina MiSeq/HiSeq 測序平臺得到的下機數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，獲取Tags值，默認提供以97%和95%的一致性將序列聚類成為OTUs，繪制稀釋曲線。如圖1所示，測序數(shù)據(jù)量充足，各處理曲線趨向平滑，表明樣品物種的豐富程度較高，本試驗可信度較高，能夠最大程度地反映各處理樣品的信息。各處理中，M處理OTU數(shù)最高，其次為WCN。

圖1 物種豐富度稀釋D曲線Fig.1 Species richness dilution curve

2.3 物種分類鑒定結(jié)果

通過序列優(yōu)化過程中獲得了16 000多個有效讀取，并計算了細菌群落豐富度指數(shù)，如表4所示。WCN、WN、WC、M樣品OTUs值分別較CK高28.9%，23.9%，17.0%，16.5%。Shannon和Chaol表明，與CK處理相比，秸稈還田和有機肥處理顯著提高土壤細菌群落多樣性。

表4 97%的OTUs數(shù)據(jù)統(tǒng)計與rDNA豐富度和多樣性指數(shù)Tab.4 97% OTUs data statistics and rDNA richness and diversity index

2.4 土壤細菌物種聚類OTU分析及物種注釋

各測試樣品結(jié)果進行了聚類分析，用數(shù)據(jù)分析軟件對所有標簽(默認情況下采用97%的一致性序列)將序列聚類成為有效值(OTUs)，并根據(jù)序列在所有樣品中最小值進行聚類結(jié)果規(guī)范化處理，對秸稈還田5個處理樣本數(shù)據(jù)進行初步統(tǒng)計。平均有效序列得到了290個OTUs，注釋到11個門。

在土壤細菌物種聚類OTU分析圖中(圖2)，秸稈還田5個處理樣本有11個門水平存在差異，除一些含量稀少的門外，Proteobacteria(變形菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)相對豐富較高。

橫坐標(Sample name)是樣品名；縱坐標(Relative abundance)表示相對豐度；Others表示最大相對豐度(某個門在所有樣品中相對豐度的最大值)最高的10個門之外的所有門的相對豐度的和。

Name Sample (Horizontal coordinate) is the name of the sample; Relative abundance of vertical coordinates; Others represents maximum relative abundance(the maximum value of the relative abundance of a door in all samples).The highest relative abundance of all the doors outside the 10 gates.

圖2 土壤細菌物種聚類OTU分析
Fig.2 Analysis of soil bacterial species cluster OTU

秸稈還田5個處理樣本有效值進行比較分析，施肥處理顯示數(shù)均大于對照，說明秸稈還田耕層土壤環(huán)境中細菌的差異種類數(shù)較高。秸稈還田與施氮肥處理下的土壤細菌群落的多樣性有一定的變化。

2.5 不同施肥處理物種豐度聚類

選取最大相對豐度排名的前10個屬所對應(yīng)的OTUs系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系數(shù)據(jù)，以及它們對應(yīng)的OTUs的相對豐度信息，實現(xiàn)OTUs水平上的樣品聚類(縱向聚類)，以此考察不同樣品間的相似或差異性，展示結(jié)果見圖3。

不同的施肥處理創(chuàng)造了不同的土壤環(huán)境，進而影響土壤細菌的數(shù)量以及不同處理間種類分布特征。CK處理的氨氧化古菌屬(Candidatusnitrososphaera)、片球菌屬(Pediococcus)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、硝化螺旋菌屬(Nitrospira)等豐度熱度值較高，說明橫向表示樣品信息，縱向表示物種注釋信息，位于左側(cè)聚類樹表示物種聚類；圖上方表示樣品聚類樹；中間熱圖為Z值，表示已標準化處理后每行物種的相對豐度，即一個樣品在某個分類上的Z值為樣品在該分類上的相對豐度和所有樣品在該分類的平均相對豐度的差除以所有樣品在該分類上的標準差所得到的值。

Lateral representation of sample information，longitudinal representation of species annotation information，on the left side of the cluster tree indicates species clustering；Sample clustering tree；The middle image is Z，it is said to have been normalized for each species relative abundance，namely a sample in a classification on the Z value of the relative abundance of the sample in the classification and the difference in the average relative abundance of all the samples divided by the difference in the standard deviation of all the samples on the classification.

圖3 細菌物種豐富度聚類圖
Fig.3 The species richness of bacteria

這類產(chǎn)孢菌為CK處理特有菌類。M處理中深淵藤黃孢菌(Dokdonella)、單胞菌屬(Luteimonas)、馬賽菌屬(Steroidobacter)等豐度熱值較高，為M處理特有菌類。

WN、WCN、M、WC處理片球菌屬(Pediococcus)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、硝化螺旋菌屬(Nitrospira)3種菌類豐度Z值較低，說明這3種菌類為CK處理特有的菌類。WCN處理的嗜酸菌屬類(Candidatus-koribacter、Granulicella)豐度熱度值值較高，為WCN處理特有菌類。WC處理為寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、假黃色單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)熱度值較高。

2.6 樣品復(fù)雜度分析

2.6.1 主成分分析 如圖4所示，第一主成分貢獻率達51.42%，第二主成分貢獻率達20.17%，因子1和因子2代表總變量的71.59%。 以這2個主成分為坐標軸構(gòu)建的二維坐標系中，各個處理在主成分分析圖上分布差異顯著，CK處理明顯與其他處理分布位置不同，5組樣本間的微生物組成存在差異，不同秸稈還田處理與對CK比都發(fā)生了明顯的位置變化，顯而易見，可以劃分為3個大類，2季秸稈還田、有機肥處理較近，表明：秸稈還田處理土壤細菌群落的多樣性與單施有機肥處理相似，1季秸稈還田加氮肥與最接近2季秸稈還田加氮肥處理，不同處理對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響是不同的，2季秸稈還田加氮肥處理對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響最大。在圖4坐標系中，WCN處理與WC處理相距最遠，這表明相同秸稈還田條件下，2季秸稈還田加氮肥與2季秸稈還田相比土壤細菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，秸稈與化肥的作用效果不同，從而導(dǎo)致細菌群落的差異。

圖4 基于門水平的的PCA分析結(jié)果展示Fig.4 PCA analysis based on the level of bacteria

2.6.2 樣品聚類分析 在圖5中，由在門水平上物種豐度統(tǒng)計結(jié)果所做的UPGMA聚類分析可以看出，不同處理之間細菌群落結(jié)構(gòu)有明顯的差異，各處理均有其優(yōu)勢門。

各處理變形桿菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)含量較高，為兩大常見細菌類。CK處理泉古菌門(Crenarchaeota)距離較大。其中M處理變形桿菌門(Proteobacteria)相對豐度最大，并且WC處理細菌豐度分布與M處理相近。WN、WCN處理酸桿菌門(Acidobacteria)距離最大，說明其含量較為豐富，這表明秸稈降解以及追加的肥料(氮肥)對微生物的繁殖和生長具有一定的促進和誘導(dǎo)作用。

圖5 細菌 UPGMA聚類分析Fig.5 Bacteria UPGMA clustering analysis

3 討論與結(jié)論

秸稈結(jié)構(gòu)是由半纖維素、木質(zhì)素、纖維素等復(fù)雜的物質(zhì)成分組成[17]，土壤需要大量酶、多種微生物及土壤細菌、真菌等聯(lián)合作用才能充分降解施入土壤中的秸稈物料，從而促進了土壤中的養(yǎng)分循環(huán)。作物秸稈經(jīng)過分解后，可為植物提供生長必需的營養(yǎng)元素，秸稈還田還可以增加有效養(yǎng)分含量及氮含量，提高土壤肥力，從而推動了該領(lǐng)域農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展。

本試驗運用秸稈還田與氮肥配施，結(jié)果表明兩者配施較單施秸稈更有利于土壤有效養(yǎng)分的形成；秸稈還田與有機肥，結(jié)果表明，兩者配施較單施秸稈物料更有利于提高土壤微生物群落的活性及物種豐富度。因此，秸稈還田必須結(jié)合有機肥和氮肥等化肥的施用方可發(fā)揮最大能量作用。

國外學(xué)者指出，微生物降解分解秸稈物料的過程發(fā)揮著重要的作用，有機和無機肥料可提供作物生長所必需的元素，作物根部器官生長旺盛，分泌物較多，相應(yīng)地提高了根系的生理活性，使得土壤細菌更加活躍，顯示出旺盛的生命力，進而改變了與根際效應(yīng)關(guān)系密切的變形桿菌門(Proteobacteria)、酸桿菌(Acidobacteria)等，促進了相對豐度的增加[18-21]。土壤環(huán)境中，土壤微生物量碳、氮等絕大部分來源于細菌[22]。在門水平上相對豐度中，變形桿菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、泉古菌門(Crenarchaeota)在秸稈還田后的土壤豐度較高，在對5個秸稈還田處理進行比較分析后表明，各秸稈還田施肥處理間細菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著，其中秸稈和氮肥是影響細菌群落組成的主要因素。另外，從物種豐度聚類分析的結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，在不同的施肥條件下，不同耕作處理和秸稈管理(化肥與有機肥、秸稈還田與不還田)對土壤細菌影響都有很大差異。

長期施肥(氮肥配施和秸稈還田)提高了土壤肥力和質(zhì)量，改善了細菌生長的生境條件，細菌種群多樣性明顯高于不施肥(CK)處理。CK、WC、WCN、WN、M處理之間微生物的群落結(jié)構(gòu)不同。土壤微生物數(shù)量和種類會受氣候和土壤類型等影響，但后期秸稈和肥料對土壤細菌群落的影響也比較大，秸稈降解和添加肥料(氮肥料)對微生物的繁殖和生長有一定的效應(yīng)，長期秸稈還田條件下，配施氮肥有利于土壤微生物群落的多樣性和穩(wěn)定性的提高，特別是可利用秸稈的土壤微生物的種群增加，有利于土壤生態(tài)環(huán)境的改善[23]。

本試驗結(jié)果表明，化肥、秸稈能夠顯著的改變土壤的細菌數(shù)量，不同程度地促進或抑制土壤微生物數(shù)量的改變，加深對根際土壤生物活性的影響，尤其是有機肥能夠促進根際細菌的繁殖[24-26]。隨著長期施氮肥，土壤細菌群落為應(yīng)對外界環(huán)境的變化自發(fā)的調(diào)整結(jié)構(gòu)類型，同時顯示出一定的穩(wěn)定性[27-28]。由此可見，不同秸稈還田與施肥措施不僅改變了原土壤細菌群落的微環(huán)境，也影響了土壤細菌群落結(jié)構(gòu)組成。其中秸稈還田細菌數(shù)量的增幅效果最大。

除CK外，WN、WCN、WC、M各個處理土壤中細菌的群落結(jié)構(gòu)都具有較大的差異，其中2季秸稈還田+氮肥這2個因子對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)具有較大影響；通過多樣性分析數(shù)據(jù)顯示，長期秸稈還田及配施有機肥對土壤細菌群落多樣性、豐富度及結(jié)構(gòu)等也有一定的作用。

秸稈還田配施氮肥、單施有機肥均有利于提高土壤養(yǎng)分含量。秸稈還田的同時配施適量氮肥提高了植物根際和土壤中微生物活性，使植物秸稈更易分解，能快速轉(zhuǎn)化成土壤中養(yǎng)分，從而在短時期內(nèi)使作物增產(chǎn)。

秸稈還田與施肥能夠不同程度地促進或抑制土壤細菌生長，以秸稈還田為主的施肥技術(shù)能夠增加細菌活性，調(diào)節(jié)土壤細菌群落結(jié)構(gòu)，提高土壤質(zhì)量。

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Illumina Amplicon Sequencing of 16S rDNA Tag Reveals Bacteria Community Development of Long-term Straw Returning Soil

YUAN Mingzhang，LIU Shutang，CHEN Yanling，XIN Li，LIU Jintao

(Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China)

In order to explore the influence of the typical long term orientation of straw returning to field on soil microbial diversity and the relationship between soil microbial diversity and ecological environment effect, using 16S rDNA PCR sequencing technology,continuous 6 years of long term positioning of straw to field test,analysis of the composition of soil bacterial community structure.The results showed that soil microbial community diversity and species richness could be promoted after long-term fertilization of straw and organic fertilizer.The dominant species of bacteria in the soil after straw returning to field were the deformation of the Proteobacteria and Acidobacteria.Principal component analysis that significant differences in the types and contents of microorganisms among different treatments.WC and WCN treatment of N, P, K and other available nutrient content was significantly different.WCN treatment in the N, P, K and other available nutrients, organic carbon content and invertase, urease, cellulase activity was significantly higher than WC.The application of nitrogen fertilizer could significantly increase the soil nutrient content and enhance the soil enzyme activity, conducive to the improvement of soil is bacterial community diversity and stability, and improve the ecological environment of soil, so as to promote the increase of crop yield.

Straw returning；16S rDNA；Long-term experiment；Soil bacterial community

2017-07-12

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)經(jīng)費項目(SDAIT-01-022-06);魯東丘陵區(qū)小麥玉米水肥自然資源高效利用綜合技術(shù)集成與示范研究項目(2013BAD07B06-03);高效海洋復(fù)合微生物肥料關(guān)鍵技術(shù)的研究與示范(2015ZDXX0502B01)

袁銘章(1991-)，女，山東臨沂人，在讀碩士，主要從事植物營養(yǎng)與施肥技術(shù)研究。

劉樹堂(1962-)，男，山東安丘人，教授，博士，主要從事植物營養(yǎng)與施肥技術(shù)研究。

S158

A

1000-7091(2016)06-0157-07

10.7668/hbnxb.2016.06.025