熱應(yīng)激誘導(dǎo)豬腎小管上皮(LLC-PK1)細(xì)胞線粒體凋亡相關(guān)因子的時(shí)效表達(dá)

霍愛(ài)華，孫雪榮，于文慧，李華濤，李 樂(lè)，李洪才，田文儒

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109)

熱應(yīng)激誘導(dǎo)豬腎小管上皮(LLC-PK1)細(xì)胞線粒體凋亡相關(guān)因子的時(shí)效表達(dá)

霍愛(ài)華，孫雪榮，于文慧，李華濤，李 樂(lè)，李洪才，田文儒

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109)

擬探討熱應(yīng)激誘導(dǎo)LLC-PK1細(xì)胞線粒體凋亡相關(guān)因子的表達(dá)和活性情況，以及激活線粒體凋亡通路的時(shí)間。采用qRT-PCR方法和Caspase活性檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)42 ℃熱應(yīng)激處理后0，2，4，8，16 h以及37 ℃培養(yǎng)的LLC-PK1細(xì)胞中HSP72、Bcl-2、Bax、AIF和Cyt.c的基因表達(dá)以及Caspase-9和Caspase-3的活性。結(jié)果顯示，42 ℃熱應(yīng)激1 h，LLC-PK1細(xì)胞Bcl-2/Bax(P<0.05)和AIF(P<0.01)基因表達(dá)以及 Caspase-3(P<0.01)活性從0 h開(kāi)始升高(P<0.01)，到2 h達(dá)到最高(P<0.01)；HSP72基因表達(dá)和Caspase-9活性0 h即達(dá)到最高(P<0.01)；Cyt.c基因表達(dá)在2 h開(kāi)始極顯著升高(P<0.01)，并且此時(shí)最高，8 h以后全部因子恢復(fù)到正常水平。結(jié)果表明，42 ℃熱應(yīng)激1 h即激活LLC-PK1細(xì)胞線粒體凋亡通路，且熱應(yīng)激后的0～8 h線粒體凋亡通路處于活化狀態(tài)，其中2 h時(shí)最為活躍。

熱應(yīng)激；豬腎小管上皮細(xì)胞；線粒體凋亡

地球溫度在升高，人類(lèi)正面臨高溫的影響。已經(jīng)證明，高溫使動(dòng)物產(chǎn)生熱應(yīng)激反應(yīng)，降低繁殖力和生產(chǎn)力。研究表明，熱應(yīng)激可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[1]，引起豬腎小管上皮細(xì)胞損傷[2-3]。線粒體凋亡通路是細(xì)胞凋亡的主要通路之一。線粒體凋亡通路中，凋亡信號(hào)誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C(Cyt.c)和AIF等凋亡誘導(dǎo)因子，線粒體Cyt.c在電子傳遞鏈中扮演傳遞電子的角色，而釋放到細(xì)胞質(zhì)中后，與Apaf-1結(jié)合活化Caspase-9，激活的Caspase-9可以切割并激活Caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[4]；從線粒體中釋放出的AIF則轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，切割DNA，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。而熱休克蛋白(HSPs)對(duì)熱應(yīng)激反應(yīng)極其敏感，起到保護(hù)細(xì)胞的作用，其中HSP72對(duì)熱應(yīng)激反應(yīng)最為敏感[6]，是細(xì)胞受到應(yīng)激刺激而合成的1組高度保守的蛋白。研究表明，HSP72能提高細(xì)胞的熱耐受性[7]，抑制線粒體上游和下游的凋亡因子活性[8]，保護(hù)線粒體[9]。研究證明，凋亡細(xì)胞線粒體膜通透性發(fā)生改變，導(dǎo)致跨膜電位下降[10]，而B(niǎo)cl-2家族在細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵作用，其中Bax為促凋亡主要的蛋白，作用于細(xì)胞線粒體膜上，促進(jìn)線粒體跨膜通道的開(kāi)放，改變線粒體通透性，進(jìn)而促進(jìn)Cyt.c和AIF等促凋亡蛋白的釋放；Bcl-2是Bcl-2家族中主要的抑制凋亡蛋白，主要分布于線粒體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等，起到抑制Bax的促凋亡的作用[11]。Bcl-2蛋白家族可以調(diào)控線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)的開(kāi)閉，同時(shí)熱應(yīng)激時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體內(nèi)的Ca2+超載，ROS增加，能量衰竭等也影響MPTP的開(kāi)閉[12]。因此，研究熱應(yīng)激誘導(dǎo)的線粒體凋亡相關(guān)因子的表達(dá)以及活性情況，有利于深入理解細(xì)胞凋亡的機(jī)理，并可為降低熱應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、緩解動(dòng)物的熱應(yīng)激反應(yīng)，提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試劑

DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自Thermo公司，胰蛋白酶購(gòu)自Sigma公司，青霉素與鏈霉素混合液(100×)購(gòu)自Solarbio公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自Aidlab Biotech公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo 公司，LighCycler?480 SYBR Green I Master 購(gòu)自Roche公司；Caspase-9 和Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 細(xì)胞系及其培養(yǎng)

豬腎小管上皮細(xì)胞系(LLC-PK1)購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，購(gòu)買(mǎi)時(shí)為3代細(xì)胞系。用高糖 DMEM 培養(yǎng)液+10%胎牛血清+1%青鏈霉素混合液(100×)，在37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁達(dá)80%～90%時(shí)，進(jìn)行胰酶消化傳代。

1.3 線粒體凋亡相關(guān)基因時(shí)效表達(dá)的檢測(cè)

豬腎小管上皮細(xì)胞進(jìn)行42 ℃熱應(yīng)激1 h，分別于熱應(yīng)激處理后0，2，4，8，16 h后提取熱應(yīng)激處理細(xì)胞以及37 ℃培養(yǎng)細(xì)胞(作為對(duì)照組)的總RNA，并按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL：提取的RNA 7 μL，隨機(jī)引物(0.2 μg/μL) 1 μL，DEPC水4 μL，5×Reaction Buffer 4 μL，Ri-bolockTMRNase Inhibitor 1 μL；10 mmol/L dNTP Mix 2 μL；反轉(zhuǎn)錄酶(RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase)1 μL，反轉(zhuǎn)錄條件為：25 ℃ 5 min，42 ℃ 1 h，70 ℃ 5 min。反轉(zhuǎn)錄后，使用滅菌雙蒸水稀釋到90 μg/mL，然后用Roche Ligh Cycler480Ⅱ熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，其反應(yīng)體系(10 μL)為：cDNA 1 μL，ddH2O 3.6 μL，LighCycler?480 SYBR Green I Master 5 μL，引物上游0.2 μL、下游0.2 μL。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。qRT-PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共 45個(gè)循環(huán)。各組以β-action基因?yàn)閮?nèi)參，采用2-ΔΔCt進(jìn)行相對(duì)定量分析[13]。

表1 引物列表Tab.1 Primer sequences for the qRT-PCR assay

注：HSP72.熱休克蛋白72基因；Bcl-2.B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因；Bax.B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白基因；Cyt.c.細(xì)胞色素C基因；AIF.促凋亡蛋白基因；β-action.β-肌動(dòng)蛋白基因。

Note：HSP72 .Heat shock protein 72 gene；Bcl-2.B-cellymphoma/leukemia-2 gene；Bax.Bcl-2 associated X protein gene；Cyt.c.Cytochrome c gene；AIF.Apoptosis inducing factor gene；β-action.β-non-muscle actin gene.

1.4 Caspase-9和Caspase-3活性檢測(cè)

參照Caspase活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，首先測(cè)定酶產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)曲線，將酶產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為0，10，20，50，100，200 μmol/L，作為標(biāo)準(zhǔn)品，分光光度分別檢測(cè)A405下的吸光值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后將42 ℃熱應(yīng)激1 h的豬腎小管上皮細(xì)胞分別于熱應(yīng)激處理后0，2，4，8，16 h熱應(yīng)激組以及37 ℃培養(yǎng)的對(duì)照組用胰酶收集至細(xì)胞培養(yǎng)液中，以2 557 r/min離心5 min，PBS洗滌一次，加入裂解液進(jìn)行冰浴裂解15 min，在4 ℃條件下，以13 210 r/min離心10 min，收集上清，進(jìn)行Caspase活性以及蛋白濃度測(cè)定。Caspase酶活性反應(yīng)體系為檢測(cè)緩沖液50 μL+樣品40 μL+底物10 μL。37 ℃孵育1 h，用微量分光光度計(jì)在A405nm處測(cè)定。蛋白濃度用Bradford方法檢測(cè)。計(jì)算出每毫克蛋白中含多少酶活力單位(一個(gè)酶活力單位為底物飽和時(shí)在37 ℃ 1 h內(nèi)剪切1 nm底物產(chǎn)生1 nm產(chǎn)物Caspase的酶量)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)使用Graph Pad Prism 5 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，LSD多重比較分析，均值間進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱應(yīng)激誘導(dǎo)的LLC-PK1細(xì)胞HSP72、Bcl-2和Bax基因的時(shí)效表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果(圖1)顯示，42 ℃熱應(yīng)激1 h處理豬腎小管上皮細(xì)胞，HSP72 mRNA迅速轉(zhuǎn)錄，與37 ℃對(duì)照組相比極顯著增高(P<0.01)，且在熱應(yīng)激后立即達(dá)到最高點(diǎn)，隨后逐漸下降，在0～2 h內(nèi)下降迅速，2～4 h內(nèi)下降緩慢，8 h后趨于平穩(wěn)與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。Bcl-2熱應(yīng)激后0～16 h內(nèi)mRNA的表達(dá)量先升高后降低，在2 h時(shí)表達(dá)量最高，極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，隨后逐漸下降，4 h后表達(dá)量與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)；BaxmRNA表達(dá)趨勢(shì)與Bcl-2 相反，在0～16 h內(nèi)先降低后升高而后趨于對(duì)照組表達(dá)量，在2 h表達(dá)量最低，顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，8 h表達(dá)量最高，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；Bcl-2/Bax表達(dá)曲線顯示在0～16 h內(nèi)，其比值先升高后降低，2 h時(shí)最高，極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，4～16 h內(nèi)與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。

*.與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)；**.與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。圖2-3同。*.Significant difference compared to control(P<0.05)；**.Extremely significant difference compared to control(P<0.01).The same as Fig.2-3.

2.2 熱應(yīng)激誘導(dǎo)的LLC-PK1細(xì)胞Cyt.c和AIF基因的時(shí)效表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果(圖2)表明，熱應(yīng)激后16 h內(nèi)，AIF和Cyt.cmRNA表達(dá)量逐漸增高，2 h后開(kāi)始降低。其中0，2 hAIF表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，4 h后趨于平穩(wěn)，與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異(P>0.05)；Cyt.c的表達(dá)量在2，4 h時(shí)極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，8 h的表達(dá)量略高于對(duì)照組但與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，16 h的表達(dá)量亦與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，且2 h后Cyt.c的表達(dá)量一直是降低趨勢(shì)，直到16 h。

圖2 各組細(xì)胞中AIF和Cyt.c mRNA表達(dá)Fig.2 Heat stress induces the production of AIF and Cyt.c mRNA in LLC-PK1 cells

2.3 熱應(yīng)激誘導(dǎo)的LLC-PK1細(xì)胞Caspase-9和Caspase-3活性

Caspase活性檢測(cè)結(jié)果表明(圖3)，熱應(yīng)激處理后的16 h內(nèi)，Caspase-9的活性在熱應(yīng)激剛剛結(jié)束后最高，且極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；而后逐漸降低，8 h后其活性逐漸恢復(fù)到平穩(wěn)，與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。Caspase-3的活性也是先升高后降低。在2 h處活性最高，極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，而后逐漸降低，其中0～4 h活性仍然極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，8 h以后與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。

圖3 各組細(xì)胞中Caspase-9和Caspase-3活性檢測(cè)Fig.3 Heat stress induces the activity of Caspase-9 and Caspase-3 in LLC-PK1 cells

3 討論

HSPs是在受熱或其他理化以及生物等刺激后發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)而產(chǎn)生的一類(lèi)蛋白。其中HSP70家族的成員最為保守，廣泛分布于細(xì)胞的各個(gè)部分[14]。其中HSP72在正常細(xì)胞中不表達(dá)或者很少表達(dá)，但在熱應(yīng)激條件下可以迅速表達(dá)。HSP72參與蛋白質(zhì)的合成、折疊、積聚、裝配、運(yùn)輸和降解，能幫助新生肽正確折疊以及修正或降解錯(cuò)誤的蛋白，以維持細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能，增強(qiáng)細(xì)胞的耐受性，保護(hù)細(xì)胞[15]。另一方面，HSP72也通過(guò)抗細(xì)胞凋亡作用，增強(qiáng)細(xì)胞的耐受性。研究表明，HSP72經(jīng)線粒體通路抗細(xì)胞凋亡，HSP72可抑制Cyt.c的釋放以及其與Apaf-1結(jié)合，阻止Caspase-9前體募集到Apaf-1，從而抑制Caspase-9的激活[16]；Garg等[17]研究表明，HSP72阻止Bax轉(zhuǎn)移到線粒體上，維持線粒體膜的通透性，抑制凋亡因子AIF和Cyt.c等的釋放，從而抑制線粒體凋亡通路。HSP72在細(xì)胞應(yīng)激中扮演著重要角色，本研究表明，42 ℃熱應(yīng)激1 h后LLC-PK1細(xì)胞HSP72 mRNA迅速表達(dá)，并立即達(dá)到最高點(diǎn)，而后逐漸下降?？赡苁怯捎诎|(zhì)中HSP72基因沒(méi)有內(nèi)含子，可以迅速大量轉(zhuǎn)錄出HSP72 mRNA[18]；而且，HSP72基因的轉(zhuǎn)錄主要受熱休克因子HSF調(diào)控、啟動(dòng)迅速，當(dāng)熱應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，HSF磷酸化，形成有活性的三聚體，轉(zhuǎn)入核內(nèi)，在核內(nèi)與熱休克基因上游啟動(dòng)子區(qū)域HSE序列結(jié)合，并進(jìn)一步被激酶磷酸化，啟動(dòng)熱休克基因的表達(dá)，這個(gè)過(guò)程迅速快捷，在受熱后數(shù)分鐘便可達(dá)到最高水平[19]。邱定杰[20]研究在不同的熱應(yīng)激持續(xù)時(shí)間中，肝臟HSP72 mRNA的轉(zhuǎn)錄量急劇升高，至1 h達(dá)到峰值，與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著重要作用，線粒體在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著重要作用，而有研究表明，Bcl-2家族蛋白的主要作用位點(diǎn)就在線粒體膜上[21-22]。Bcl-2家族的大部分抗凋亡蛋白一般作為細(xì)胞器膜(如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜)的整合膜蛋白被隔離起來(lái)，而促凋亡蛋白則以非活性的形式定位分布于胞液中或細(xì)胞質(zhì)骨架上。其中Bax是主要的促凋亡因子，當(dāng)細(xì)胞受一定刺激時(shí)，其轉(zhuǎn)移到線粒體等膜上，使線粒體膜的通透性增強(qiáng)，釋放凋亡因子AIF和Cyt.c等，激活線粒體凋亡通路；而抑制凋亡蛋白Bcl-2與Bax結(jié)合形成異二聚體，從而拮抗Bax的抗凋亡作用。Scopa等[23]、Oshikawa等[24]以及Adhya等[25]研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2/Bax可作為預(yù)測(cè)腫瘤或者癌癥臨床治療療效的標(biāo)志物。本試驗(yàn)結(jié)果顯示熱應(yīng)激處理后，Bcl-2先升高后降低，在2 h處最高；而B(niǎo)ax先降低后升高，2 h最低，Bcl-2/Bax比值升高表示其發(fā)揮抗凋亡的作用，而非促進(jìn)凋亡。而熱應(yīng)激處理后，AIF和Cyt.c基因表達(dá)增高，也是在2 h處達(dá)到最高，其次Caspase-9和Caspase-3也不同程度的增高，因此，42 ℃熱應(yīng)激1 h處理豬腎小管上皮細(xì)胞其線粒體凋亡通路被激活。因此猜測(cè)，其線粒體通路激活是由其他因素導(dǎo)致的，不是Bax引起的。Bcl-2家族中Bad也能與Bcl-2形成異二聚體，拮抗Bcl-2的抗凋亡作用；Wei等[26]、Kataoka等[27]研究發(fā)現(xiàn)，被激活的tBid和Bcl-rambo也能引起線粒體膜通透性的改變，促進(jìn)Cyt.c等的釋放，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，線粒體膜通透性的改變也受到活性氧增加、Ca2+超載和能量衰竭等多種因素的影響。

線粒體凋亡過(guò)程中，促凋亡蛋白從線粒體的釋放至關(guān)重要[28]，一旦釋放促凋亡蛋白(Cyt.c、AIF)，激活Capsase-9和Caspase-3等，級(jí)聯(lián)放大凋亡信號(hào)，導(dǎo)致蛋白降解，DNA切割，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Caspase不僅是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，還可以激活第二信使，修飾Bcl-2(將Bcl-2轉(zhuǎn)變?yōu)榇俚蛲龅腂ax樣因子)，改變細(xì)胞內(nèi)氧化還原水平，過(guò)表達(dá)Bax和Bak等促凋亡因子，再作用于線粒體，實(shí)現(xiàn)凋亡信號(hào)的放大，加快凋亡進(jìn)程。這也可能是本研究中，Caspase-9的表達(dá)首先達(dá)到最高點(diǎn)，而后AIF和Cyt.c等隨后達(dá)到最高點(diǎn)的原因。

本研究從分子水平揭示了熱應(yīng)激誘導(dǎo)LLC-PK1細(xì)胞線粒體凋亡通路相關(guān)因子基因以及相關(guān)活性的時(shí)效表達(dá)情況，但是細(xì)胞凋亡的調(diào)控過(guò)程精密而又錯(cuò)綜復(fù)雜，需要進(jìn)一步研究。

42 ℃熱應(yīng)激1 h即激活LLC-PK1細(xì)胞線粒體凋亡通路，且熱應(yīng)激后的0～8 h線粒體凋亡通路處于活化狀態(tài)，其中2 h時(shí)最為活躍。

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Expression of Factors Related to Mitochondrial Apoptosis in Pig Kidney Proximal Tubular (LLC-PK1) Cells Induced by Heat Stress

HUO Aihua，SUN Xuerong，YU Wenhui，LI Huatao，LI Le，LI Hongcai，TIAN Wenru

(College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China)

To investigate the expression and the activity of factors related to mitochondrial apoptosis in LLC-PK1 cells induced by heat stress，and the time of activation of mitochondrial apoptotic pathway，we assessed theHSP72，Bcl-2，Bax，AIF，Cyt.cexpressions in LLC-PK1 cells by qRT-PCR and Caspase-9，Caspase-3 activity by caspase activity assay kit at 0，2，4，8，16 h after 42 ℃ heat stress treatment for 1 h.The above factors were also measured in cells cultured at 37 ℃ as control.Results demonstrated thatBcl-2/BaxandAIFgene expressions and Caspase-3 activity significantly increased from 0 h，and reached the highest point at 2 h after heat stress；HSP72 gene expression and Caspase-9 activity reached the highest point at 0 h；Cyt.cgene expression significantly increased and reached the highest point at 2 h，and all the measured factors returned to normal level at 8 h after heat stress.The above results reveal that mitochondrial apoptotic pathway in LLC-PK1 cells is in a state of activation in 0-8 h after 42 ℃ heat stress for 1 h and is the most active at 2 h.

Heat stress；LLC-PK1 cells；Mitochondrial apoptosis

2016-04-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31572590；31502138)；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BS2015NY001)

霍愛(ài)華(1987-)，女，山東菏澤人，碩士，主要從事動(dòng)物生殖生理與疾病研究。

田文儒(1959-)，男，黑龍江蘭西人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物生殖生理與疾病研究。

Q78

A

1000-7091(2016)06-0094-06

10.7668/hbnxb.2016.06.015