蘭州百合鱗莖不定芽誘導和植株再生

胡友軍，賈雙雙，周玉麗

(安徽科技學院 生命科學學院，安徽 鳳陽 233100)

蘭州百合鱗莖不定芽誘導和植株再生

胡友軍，賈雙雙，周玉麗

(安徽科技學院 生命科學學院，安徽 鳳陽 233100)

目的:研究6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)和α-萘2酸(NAA)對蘭州百合鱗莖的誘導、增殖、生根及試管苗移栽的影響，篩選出不同培養(yǎng)階段的最佳培養(yǎng)基。方法:選取生長健壯的蘭州百合鱗莖，采用MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度6-BA和NAA，進行不定芽的誘導。以鱗莖誘導的幼苗為外植體，MS添加不同濃度6-BA和NAA進行試管苗增殖培養(yǎng)。將試管苗轉入以1/2 MS、MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度6-BA和NAA組合的生根培養(yǎng)基中進行試管苗的生根培養(yǎng)，當幼根長2～3 cm時，煉苗1～2 d，再移入蛭石和珍珠巖配比為1 ∶1的營養(yǎng)缽中管理。結果:叢生芽誘導時，6-BA的最適濃度為1.0 mg/L，過高則芽的生長受到抑制；增殖試驗中，NAA與6-BA配合使用，可提高芽的增殖率，而且新芽產生時間早，增殖倍數(shù)高；1/2 MS和MS培養(yǎng)基中NAA可以提高百合幼苗生根率，6-BA則明顯抑制生根量。結論:蘭州百合鱗莖片不同部位誘導叢生芽的誘導率順序為下部>中部>上部；經煉苗移栽，再生株成活率可達100%。

百合鱗莖；不定芽誘導；植株再生

蘭州百合(Liliumdavidiivar.willmottiae)為百合科百合屬川百合的變種，多年生草本植物，為蘭州地區(qū)名優(yōu)特產蔬菜之一，其地下鮮鱗莖莖瓣大，闊卵狀球形或扁球形，外無皮膜。蘭州百合鱗片富含碳水化合物、蛋白質、多種維生素以及人體所必需的多種微量元素，為我國食用百合最佳品種，不僅有極高的營養(yǎng)價值，而且具有滋陰潤肺、清心安神、清熱利尿、消暑[1]等功效。

蘭州百合主要依靠小鱗莖分株繁殖，單鱗片扦插[2]。小鱗莖分株繁殖方式在生產上應用較廣，優(yōu)點在于能保持其后代遺傳基礎的一致性，較少發(fā)生變異。百合長期的無性繁殖會使植株逐漸積累大量病毒，發(fā)生病毒病并導致種性退化。種子繁殖雖能獲得大量無病毒健康的幼苗，但百合結實率極低，且種子發(fā)芽緩慢，栽培周期長，在生產中不適宜大規(guī)模采用，難以滿足市場需求。為克服傳統(tǒng)繁殖方法的不足，加快繁殖速度組織培養(yǎng)方法在國內外都做了不少研究，繁殖的效果也比較好[3-7]。近年來，蘭州百合組織培養(yǎng)技術的研究也有報道[8-12]，多以鱗片為外植體，繁殖率高，但鱗片不同部位的繁殖效果存在差異。本試驗以蘭州百合鱗片為材料，研究不同生長調節(jié)劑配比濃度對組織培養(yǎng)的影響，并篩選出最佳培養(yǎng)基配方，為蘭州百合組培苗大量生產，提高種球繁殖率、抗病性，實現(xiàn)百合優(yōu)質種球繁育產業(yè)化提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 以蘭州百合(農家地方品種)鱗莖為試驗材料。主要儀器為電子分析天平(JA2003N型)、移液槍(德國Eppendorf)；藥品和試劑為瓊脂粉、蔗糖(分析純)、酒精(分析純)；α-萘乙酸(NAA，化學純)、6-芐氨基腺嘌呤(6-BA，化學純)。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 本試驗主要采用MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，生根時使用MS、1/2 MS(大量元素減半)，附加各種激素，每升培養(yǎng)基中加入蔗糖30 g(生根時20 g)，瓊脂6 g，調節(jié)pH值5.8～6.0，培養(yǎng)溫度(25±1)℃，光照1600～2000 lx，14 h/d，相對濕度80%左右[13]。

1.2 方法

1.2.1 外植體的消毒 選取生長健壯的蘭州百合鱗莖，剝除外層泥漬較多的老鱗莖片，剪取嫩白肥厚的鱗莖片作為外植體，先用洗滌液或洗衣粉液充分洗滌，再用流動自來水沖洗30 min，置于超凈臺上用75%酒精消毒30 s，最后用0.1%的升汞溶液消毒15 min，中間更換一次升汞溶液，消毒及沖洗過程中要不斷搖動，使藥劑充分接觸，取出后用無菌水沖洗5～8次，用無菌濾紙吸干表面水分，在無菌的條件下進行接種[14]。

1.2.2 試管苗不定芽的誘導 以MS為基本培養(yǎng)基，6-BA設置0.5、1.0、1.5 mg/L三個濃度梯度，NAA濃度設置為0.1、0.2 mg/L，各組合見表1。每個組合接種9瓶，每瓶接種5片鱗莖片段，且分上、中、基部三個部分接于培養(yǎng)瓶內。

1.2.3 試管苗增殖培養(yǎng) 蘭州百合的增殖培養(yǎng)過程中，用鱗莖誘導的幼苗為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，6-BA設置0.2、0.5、0.8 mg/L三個濃度梯度，NAA設置為0.1、0.2、0.3 mg/L三個梯度，各組合見表2。每個組合接種11瓶，每瓶接種4株幼苗。

1.2.4 試管苗的生根培養(yǎng) 試管苗增殖后，選取2～3 cm高,生長健壯的試管苗轉入生根培養(yǎng)基中。以1/2 MS(C1～C8)、MS為基本培養(yǎng)基，設置6-BA、NAA兩個因素，并且將1/2 MS培養(yǎng)基NAA濃度設置為0.1，0.2，0.3，0.4 mg/L四個濃度梯度，MS培養(yǎng)基NAA濃度設置為0.1，0.2，0.3，0.4 mg/L四個濃度梯度，1/2 MS培養(yǎng)基NAA濃度設置為0.3、0.6、0.9、1.2 mg/L，6-BA濃度設置為0.05、0.1 mg/L兩個梯度，各組合見表3。每個組合接種8瓶，每瓶接種4株無菌苗，并定期觀察統(tǒng)計生根情況。

1.2.5 試管苗移栽 當幼根在生根培養(yǎng)基上長到2～3 cm左右時，選取生長健壯且生根良好的蘭州百合試管苗，去掉培養(yǎng)瓶瓶蓋，煉苗1～2 d后將其取出，用自來水洗去其根部的培養(yǎng)基，然后移入以蛭石和珍珠巖配比為1 ∶1的營養(yǎng)缽中。前7 d覆蓋無色透明地膜，防止水分蒸發(fā)過快，保持溫度20～25 ℃左右，濕度80～90%，每1～2 d澆一次清水，中間適當補充1～2次培養(yǎng)液(1/20 MS大量元素)，7 d后逐漸揭去塑料袋，轉入常規(guī)管理。

另外，分別扦插了一批用100 mg/L的IBA和NAA浸泡5 min的無根苗于以上基質中，澆透水，置于室內散射光下，隔日澆水，并保持一定的濕度，逐漸增加光照量。大約30 d后出苗，放置于室外生長。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

平均芽數(shù)=統(tǒng)計時誘導芽總數(shù)/外植體數(shù)

誘導率(%)=(統(tǒng)計時萌芽總數(shù)/接種芽數(shù))× 100

增殖倍數(shù)=統(tǒng)計時芽總數(shù)/接種芽數(shù)

生根率(%)=(統(tǒng)計時生根的植株數(shù)/接種植株數(shù))× 100

平均根數(shù)=統(tǒng)計時的總根數(shù)/接種植株總數(shù)

平均根長=統(tǒng)計時的總根長/接種植株數(shù)

2 結果與分析

2.1 不同濃度激素對蘭州百合叢生芽的誘導

根據(jù)表1的配方，將蘭州百合鱗莖消毒的鱗莖片接入MS培養(yǎng)基中，7 d左右鱗莖片開始由白色變成淡黃色，14 d左右鱗莖片轉為淡綠色，并有芽形成，3～4周后鱗莖片轉為綠色，并隨NAA濃度的增高，鱗莖片逐漸轉為棕褐色。對40 d的誘導情況進行統(tǒng)計，結果如表1所示。觀察發(fā)現(xiàn)，雖然A1培養(yǎng)基對鱗莖誘導叢生芽的誘導率不是最高，但其長勢情況最好。

表1 不同激素配比對不定芽誘導的影響(40 d)

從表1可以看出，蘭州百合上部鱗莖片誘導芽的最適培養(yǎng)基為：MS + 蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L + 6-BA 1.5 mg/L + NAA 0.1 mg/L，中部鱗莖片誘導芽的最適培養(yǎng)基為：MS + 蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L + 6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，下部鱗莖片誘導芽的最適培養(yǎng)基為：MS + 蔗糖30 g/L + 瓊脂6 g/L + 6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L。其中鱗莖片不同部位誘導叢生芽的誘導率順序為下部>中部>上部。圖1(A、B)是培養(yǎng)誘導出叢生芽的生長狀況。

2.2 不同濃度激素配比對蘭州百合增殖的影響

將蘭州百合無菌叢生芽接入A1培養(yǎng)基內進行繼代培養(yǎng)一段時間后，轉接入不同濃度激素的MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)25 d后對增殖情況進行統(tǒng)計，結果如表2所示。在6-BA濃度為0.2 mg/L，NAA 0.1 mg/L的組合下誘導了大量的叢生芽，增殖倍數(shù)達到4.9，可在短期內獲得較大的增殖群體，其他處理組出現(xiàn)的叢生芽增值倍數(shù)相對較低。

從表2可以看出，不同濃度激素配比對蘭州百合增殖效果有著明顯的差異，其中B1培養(yǎng)基處理的增殖倍數(shù)最大，其次為B4處理。極差分析結果表明，對蘭州百合增殖影響最大的因素為6-BA，其次為NAA，其中6-BA以0.2 mg/L效果最好，NAA以0.1 mg/L效果最好，即最優(yōu)的培養(yǎng)基為：MS + 蔗糖30 g + 瓊脂6 g/L+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L。培養(yǎng)增殖芽的生長狀況見圖1(C、D)。

表2 不同濃度激素配比對增殖的影響(25 d)

注：K1、K2、K3和R為極差分析結果。其中K1、K2、K3分別代表各因素(6-BA和NAA)在水平1、2、3下的增殖倍數(shù)之和，R代表各因素處理后增殖倍數(shù)最大值與最小值之差。

圖1 百合鱗莖不定芽誘導和植株再生各階段生長狀況

A：百合鱗莖誘導14 d左右芽的生長狀況；B：百合鱗莖誘導叢生芽40 d的生長狀況；C、D：百合試管苗增殖培養(yǎng)25 d的長勢；E：百合試管苗生根培養(yǎng)25 d的生長狀況；F：試管苗生根移栽30 d的生長狀況

A: The growth status of 14 days and so on bulb of lily bulb; B: The growth status of 40 days of induction of cluster buds in lily bulb; C and D: The growth of the test tube plantlets of Lily in 25 days; E: The growth status of the test tube rooting culture of lily bulb for 25 days; F: The growth status of Lily test tube seedlings after rooting for 30 days.

2.3 不同濃度激素對蘭州百合生根的影響

6-BA和NAA兩種植物激素的不種組合加入1/2 MS(C1～C8)和MS生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)25 d的結果見表3。蘭州百合在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周后植株開始生根，接種25 d的生根苗見圖1(E)。

從表3可以看出，1/2 MS和MS培養(yǎng)基中NAA可以使生根率提高，而6-BA對百合幼苗生根具有明顯的抑制作用。由此可見，就根數(shù)和根長方面而言C9組合生根培養(yǎng)基中NAA 0.1 mg/L時對生根效果最佳，其中C1～C8培養(yǎng)基內幼苗出現(xiàn)黑根現(xiàn)象，且長勢較弱，C5～C8培養(yǎng)基內幼苗生根量較少，C9～C10培養(yǎng)基內幼苗根較為粗壯。綜上所述，在本試驗中，蘭州百合幼苗生根的最佳培養(yǎng)基為：MS + 蔗糖30 g/L + 瓊脂6 g/L+NAA 0.1 mg/L。

表3 不同激素濃度對生根的影響(25 d)

2.4 試管苗移栽與扦插

移栽前兩周保持較高的空氣濕度，移栽后的蘭州百合植株能夠成活，且長勢較好，生根苗在兩周左右長出新葉。30 d成活率的統(tǒng)計結果見表4，生根苗移栽見圖1(F)。

表4 移栽成活率統(tǒng)計(30 d)

注：D1號處理為生根苗移栽，D2、D3號為無根苗的扦插。

Note: D1 signal processing for rooting plantlets, D2, D3 for cutting seedlings.

由表4可以看出，移栽的生根苗成活率最高為100%，用NAA浸泡的扦插苗比用IBA浸泡的扦插苗成活率高。

3 結論與討論

3.1 激素種類和濃度對蘭州百合鱗莖離體誘導培養(yǎng)的影響

植物組織培養(yǎng)中，應用最多的細胞分裂素為6-BA，6-BA能促進細胞分裂，誘導芽的分化，用量一般在1.0～2.0 mg/L。當組織內細胞分裂素與生長素比例過高時，細胞分裂素起著主導作用，誘導芽的分化，促進側芽萌發(fā)。本次試驗選用了添加不同濃度6-BA和NAA的MS和1/2 MS培養(yǎng)基，誘導試驗的結果表明，6-BA的最適濃度為1.0 mg/L。隨著6-BA的濃度增加，芽的生長反而會受到抑制，甚至導致變態(tài)芽的發(fā)生，這與宛淑艷等研究結果相接近[15]。故最適培養(yǎng)基為：MS + 蔗糖30 g/L + 瓊脂6 g/L + 6-BA1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L。

3.2 激素種類和濃度對蘭州百合幼苗離體增殖培養(yǎng)的影響

不同濃度激素的作用機理不同，在蘭州百合叢生芽的增殖試驗中使用了6-BA和NAA兩類植物激素。NAA與6-BA配合使用，不僅提高芽的增殖率，而且新芽產生時間早、增殖倍數(shù)高、種性變異小、成苗率高。

從增殖結果可以看出，幼苗發(fā)生的不定芽增殖率與培養(yǎng)基中添加的NAA濃度密切相關，隨著NAA濃度的升高，不定芽的增殖倍數(shù)增大，NAA濃度為 0.1 mg/L時，增殖倍數(shù)達到最大值為4.9，形成叢生芽體，芽苗健壯，長勢良好。當NAA濃度高于0.1 mg/L 時，形成叢生芽數(shù)量減少。

不同濃度的6-BA 對蘭州百合的增殖也有較大影響，濃度較低或較高，增殖效果都不太理想，芽苗較小，長勢較弱。當6-BA 濃度為0.5 mg/L時，芽苗增殖倍數(shù)最高，且芽苗健壯，葉片顏色鮮綠，長勢最好。張衛(wèi)芳[16]香石竹組織培養(yǎng)的研究也表明在MS + 蔗糖30 g/L + 瓊脂6 g/L + 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基上，能夠保證有一定的增殖倍數(shù)。

綜上所述，培養(yǎng)基：MS + 蔗糖30 g/L + 瓊脂6 g/L + 6-BA 0.2 mg/L + NAA 0.1 mg/L 最適于蘭州百合的增殖培養(yǎng)。

3.3 激素種類和濃度對蘭州百合組培苗生根的影響

組織培養(yǎng)中，生長調節(jié)劑的種類和濃度的不同組合對器官的形成有著重要作用。本次試驗選用了1/2 MS和MS 附加不同濃度的激素對蘭州百合鱗莖片組培苗進行生根的培養(yǎng)。從生根結果可以看出，加入適量的NAA可以使生根率明顯提高，濃度在0.1 mg/L時最佳，根條數(shù)多且長，苗長勢較好。所以在蘭州百合組培苗生根培養(yǎng)中最佳的培養(yǎng)基為：MS + 蔗糖30 g/L + 瓊脂6 g/L + NAA 0.1 mg/L。

3.4 結論

本次試驗經過多次重復對比，篩選出不同培養(yǎng)階段的最佳培養(yǎng)基。在叢生芽誘導培養(yǎng)中，蘭州百合上部鱗莖片誘導芽的最適培養(yǎng)基為：MS + 蔗糖30 g/L + 瓊脂6 g/L + 6-BA 1.5 mg/L + NAA 0.1 mg/L；中部鱗莖片誘導芽的最適培養(yǎng)基為：MS + 蔗糖30 g/L + 瓊脂6 g/L + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L；下部鱗莖片誘導芽的最適培養(yǎng)基為：MS + 蔗糖30 g/L + 瓊脂6 g/L + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L。其中鱗莖片不同部位誘導叢生芽的誘導率順序為：下部>中部>上部。在增殖培養(yǎng)中，最佳培養(yǎng)基為：MS + 蔗糖30 g/L + 瓊脂6 g/L + 6-BA 0.2 mg/L + NAA 0.1 mg/L。在生根培養(yǎng)中，最佳培養(yǎng)基為：MS + 蔗糖30 g/L + 瓊脂6 g/L+NAA 0.1 mg/L。生根苗移栽能夠成活且長勢良好。30 d的成活率統(tǒng)計顯示：生根苗移栽成活率最高達100%。

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(責任編輯：馬世堂)

Adventitious Shoots Induction and Plant Regeneration from Bulb Explant ofLiliumdavidiivar.willmottiae

HU You-jun, JIA Shuang-shuang, ZHOU Yu-li

(College of Life Science, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China)

Objective:To investigate the effects of 6-BA and NAA on the induction, proliferation, rooting and transplanting of test tube seedlings ofLiliumdavidiivar.willmottiae, and to select the best culture medium in different stages. Methods: Select theLiliumdavidiivar.willmottiaebulb of robust growth, using MS as the basic medium supplemented with different concentrations of 6-BA and NAA for adventitious bud induction. The seedlings were used as explants, MS was added with different concentrations of 6-BA and NAA to test the pro-liferation and culture of test tube seedlings.The plantlets transferred to 1/2 MS and MS as the basic medium supplemented with different concentrations of 6-BA and NAA combination of rooting medium for rooting of plantlets, at the root length of 2～3 cm, 1～2 d seedling, and then into the vermiculite and perlite ratio for the management of nutrition pot in 1 ∶1. Results: Bud induction, the optimum concentration of 6-BA for 1 mg/L, high bud growth was inhibited; proliferation test, with the use of NAA and 6-BA, can enhance the bud proliferation rate and sprout time early, high proliferation rate and MS medium; 1/2 MS in NAA can improve the rooting rate of lily seedlings, 6-BA inhibited the rooting capacity. Conclusion: In different parts ofLiliumdavidiivar.willmottiaebulb slices induced multiple induction rate order lower > middle > upper buds; After transplanting, the survival rate of the regenerated plants was 100%.

Lily bulb; Adventitious bud induction; Plant regeneration

2016-06-01

安徽科技學院校級重點學科(AKZDXK2015C05)。

胡友軍(1964-)，男，安徽省定遠縣人，學士，副教授，主要從事園藝植物栽培生理及組織培養(yǎng)研究。

Q813.1+2

A

1673-8772(2016)06-0026-06