HPLC同步測定多種合成色素含量檢測結(jié)果的不確定度評(píng)定

伍雅婷，郭怡陽，黃常剛，劉俊玲，吳曉旻，孫言鳳，李靜娜

(1武漢市疾病預(yù)防控制中心，武漢 430015; 2武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心，武漢 430015)

HPLC同步測定多種合成色素含量檢測結(jié)果的不確定度評(píng)定

伍雅婷1，郭怡陽2，黃常剛1，劉俊玲1，吳曉旻1，孫言鳳1，李靜娜1

(1武漢市疾病預(yù)防控制中心，武漢 430015;2武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心，武漢 430015)

目的：分析高效液相色譜法(HPLC)同步測定多種色素含量的不確定度。方法：通過評(píng)定各不確定度分量，計(jì)算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴(kuò)展不確定度。結(jié)果：HPLC同步測定多種色素含量的擴(kuò)展不確定度范圍在3.97%～7.13% (k=2)；天平稱量和提取回收率對(duì)合成色素的測量結(jié)果不確定度影響最大。結(jié)論：本研究建立了簡便易行的HPLC同步測定肉制品中色素含量檢測結(jié)果的不確定度評(píng)定方法。

高效液相色譜；同步測定；合成色素；不確定度

食品中人工合成色素是食品安全重要的檢測指標(biāo)[1]。肉類通常被認(rèn)為是基質(zhì)復(fù)雜食品樣品的代表，當(dāng)需要界定肉類及其制品中是否存在合成色素濫用現(xiàn)象時(shí)，目前的檢測方法通常是對(duì)其中可能濫用的色素逐一篩查，這無疑增加了工作量、延長工作時(shí)間和降低工作效率，顯然更不能對(duì)突發(fā)事件做出快速反應(yīng)。本課題組前期開發(fā)的色素同步測定方法則可以極大限度地提高基層食品檢測單位的效率[2]。不確定度是對(duì)測量結(jié)果可能誤差的度量，也是定量說明測量結(jié)果質(zhì)量好壞的一個(gè)參數(shù)[3-5]。不確定度的分析是保證檢測結(jié)果可信度和準(zhǔn)確性的關(guān)鍵要素[7-9]。對(duì)高效液相色譜法同步測定多種色素含量的不確定度進(jìn)行分析便于測量者和管理者對(duì)測量結(jié)果的可信度和準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)定。

本文依據(jù)《化學(xué)分析中的不確定度的評(píng)估指南》[3]、《測量不確定度評(píng)定與表示》[8]，對(duì)高效液相色譜法同步測定多種色素的含量分析其不確定度進(jìn)行[2]，對(duì)建立的HPLC多種色素測定方法的不確定度進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)了影響其測定結(jié)果的不確定度來源，確保檢測過程和結(jié)果的可靠性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters e2695型高效液相色譜儀、Waters 2998型二極管陣列檢測器、Waters717型自動(dòng)進(jìn)樣器，美國 Waters公司；BP211D電子天平、PT-310電子天平，德國賽多利斯公司；KH-600E超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；AFX2-1001-P超純水機(jī)，頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司；TGL-16M高速冷凍離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；BF-S2500無油真空泵，北京八方試劑科技有限公司；Symmetry-C18色譜柱(5μm，4.6×250 mm)，美國Waters公司；固相萃取裝置，美國Agilent公司；WAX 6CC固相萃取小柱(150 mg，30 μm)，美國 Waters公司；OA-SYS N-EVAP 112氮吹儀，美國Organomation Associates，Inc.公司。

標(biāo)準(zhǔn)品：檸檬黃(0.500 mg/mL )，中國計(jì)量科學(xué)研究院；莧菜紅(0.500 mg/mL )，中國計(jì)量科學(xué)研究院；胭脂紅(0.500 mg/mL )，中國計(jì)量科學(xué)研究院；日落黃(0.500 mg/mL)，中國計(jì)量科學(xué)研究院；亮藍(lán)(0.500 mg/mL)，中國計(jì)量科學(xué)研究院；新紅(92.0%)、誘惑紅(83.0%)、紅色2G(60.0%)、酸性紅(99.0%)、赤蘚紅(91.7%)、酸性橙Ⅱ(87.0%)，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH。

1.2 檢測方法

參見本課題組前期發(fā)表的文章《同時(shí)測定肉制品中酸性橙Ⅱ等11種合成色素的方法研究》[8]。取食品樣品可食部搗碎并混合均勻后，準(zhǔn)確稱取2.00 g置于50 mL離心管，加入2.0 g海砂混勻，加入10 mL石油醚脫脂(樣品不含脂肪則無需脫脂)，振搖并超聲10 min后(注意放氣)，離心10 min(4 000 r/min)，棄去醚層，必要時(shí)重復(fù)上述過程以保證脫去樣品脂肪完全。80℃水浴揮去多余石油醚后，加入20 mL乙醇氨水水溶液，振搖1 min、超聲30 min以提取色素，高速冷凍離心 10 min(4℃，10 000 r/min)后立即將溶液轉(zhuǎn)入100 mL燒杯，殘?jiān)貜?fù)提取2次，每次加入10 mL乙醇氨水水溶液，合并提取液后于80℃水浴蒸發(fā)至總體積約 10 mL，用乙酸溶液調(diào)至弱酸性(pH=5.0～6.0)，加入5 mL乙腈、5 mL水為試樣溶液，待凈化。

凈化：將試樣溶液轉(zhuǎn)移至預(yù)先經(jīng)5 mL甲醇、5 mL水活化的WAX固相萃取小柱，依次用乙腈、酸性甲醇、甲醇和水洗滌2次(5 mL/次)，抽濾至近干后，用 12 mL乙醇氨水水溶液洗脫(流速< 1 mL/min)。洗脫液于40℃下氮?dú)獯抵?.5～1 mL，用乙酸溶液調(diào)至中性，加入200 μL甲醇并用水定容至5 mL，經(jīng)0.45 μm聚四氟乙烯有機(jī)濾膜過濾后供HPLC-PDA測定。

1.3 樣品來源

向已購買的市售肉制品(2g)中加入100μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)合成色素，充分渦旋震蕩5min，超聲5min混勻后作為樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 建立數(shù)學(xué)模型

試樣中色素的含量公式如式(1)：

(1)

式(1)中，X：試樣中目標(biāo)物含量(ng/g)；C：樣液測定含量(ng/mL)；V：試樣稀釋后的總體積(mL)；m：試樣的質(zhì)量(g)；Rec：樣品處理后回收率(%)。因此，樣品中色素含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的公式為式(2)：

(2)

2.2 分析不確定分量

根據(jù)實(shí)際前處理方法，不確定度來源主要有重復(fù)性操作、容量瓶、移液管、天平稱量、標(biāo)準(zhǔn)溶液配置、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合等因素。

2.3 不確定度分量的評(píng)定

檸檬黃重復(fù)測定引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

同理可以計(jì)算出新紅、胭脂紅、莧菜紅、日落黃、誘惑紅、赤蘚紅、紅色2G、亮藍(lán)、酸性紅、酸性橙Ⅱ等色素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度(表1)。

表1 11種色素重復(fù)測量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量

平行測定多種色素的混合標(biāo)準(zhǔn)液3次，則共15次。

表2 曲線方程及標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度

表3 稀釋中由玻璃量具校準(zhǔn)所致的不確定度

表4 稀釋中由溫度變化引起的不確定度

而由樣品不均勻性引起的測量不確定度用B類評(píng)定，因?yàn)闃悠肪鶠橐簯B(tài)，并充分渦旋混合，由此帶來的不確定度可忽略不計(jì)。因此由玻璃量具校準(zhǔn)引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

稀釋過程中由溫度產(chǎn)生的相對(duì)不確定度為：

試樣稀釋引入相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

同理，各類色素回收率引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果見表5。

2.4 不確定度的合成

表5 色素加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

表6 樣品中各類色素含量測定的不確定度分量

3 討論

游靖[10]報(bào)道了使用國標(biāo)方法分別檢測葡萄酒中的檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅及日落黃的不確定度，其不確定度在為4.08%～4.43%，影響最大的不確定度分量是樣品分析中回收率所產(chǎn)生的不確定度。與該研究相比較，由于本實(shí)驗(yàn)采用的是百分之一的天平，而使得天平稱量所導(dǎo)致的不確定度達(dá)1.44%，其不確定度分量對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的不確定度影響最大；同時(shí)對(duì)酸性紅、赤蘚紅而言，提取回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量最大與游靖研究結(jié)果一致(表7)。

表7 樣品中各類色素含量測定的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度 及擴(kuò)展不確定度 單位：%

本文對(duì)前期所建立的HPLC多色素測定方法的不確定度進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)估了前期開發(fā)的肉質(zhì)品中多種合成色素含量的檢測過程中產(chǎn)生的不確定度分量，并計(jì)算出其相對(duì)擴(kuò)展不確定度。比較各分量的相對(duì)不確定度發(fā)現(xiàn)，對(duì)大部分色素而言，天平稱量所導(dǎo)致的不確定度對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度貢獻(xiàn)最大；而對(duì)酸性紅、赤蘚紅而言，提取回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量最大。因此，在試驗(yàn)過程中，除了需要更換精密度更高的天平以外，對(duì)樣品的處理過程，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液系列配制過程也需要嚴(yán)格要求?！?/p>

[1]Minioti K S，et al. Determination of 13 synthetic food colorants in water-soluble foods by reversed-phase high-performance liquid chromatography coupled with diode-array detector[J]. Analytica Chimica Acta，2007，583(1)：103-110.

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(責(zé)任編輯 李婷婷)

Uncertainty Evaluation on Measurement Results for Simultaneous Determination on Synthetic Pigments by HPLC

WU Ya-ting1,GUO Yi-yang2，HUANG Chang-gang1，LIU Jun-ling1，WU Xiao-min1，SUN Yan-feng1，LI Jing-na1

(1Wuhan Center for Disease Control and Prevention，Wuhan 430015，China;2Wuhan Women and Children’s Health Care Center, Wuhan 430015,China)

【Objective】To evaluate the uncertainty of the content of several kinds of synthetic pigments for simultaneous determination by high performance liquid chromatography (HPLC).【Method】The synthetic standard uncertainties and expanded uncertainties were calculated.【Result】It was found that sample weighing and the rate of recovery had the strongest impact on the uncertainty.The uncertainties of synthetic pigments were at the range of 3.97%～7.13 % (k=2).【Conclusion】A feasible method for uncertainty evaluation on the determination on synthetic pigments in processed meat was established.

HPLC；simultaneous determination；synthetic pigments；uncertainty

武漢市衛(wèi)生局資助課題(項(xiàng)目編號(hào)：WG11B02)。

伍雅婷(1986— )，女，博士，醫(yī)師，研究方向：公共衛(wèi)生。

李靜娜(1965— )，女，學(xué)士，副主任技師，研究方向：食品安全。