微生物固態(tài)發(fā)酵和酶解工藝處理棉粕的研究

韓 偉，李曉敏，劉 倩，王曉玲，張曉琳

(1.國家糧食局 科學研究院，發(fā)酵生物技術(shù)組，北京 100037； 2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122)

生物工程

微生物固態(tài)發(fā)酵和酶解工藝處理棉粕的研究

韓 偉1，李曉敏1，劉 倩1，王曉玲2，張曉琳1

(1.國家糧食局 科學研究院，發(fā)酵生物技術(shù)組，北京 100037； 2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122)

研究了微生物和蛋白酶共同作用下棉粕中毒性因子和營養(yǎng)成分的變化。在枯草芽孢桿菌GJ00141、釀酒酵母GJ00079和中性蛋白酶等參與的固態(tài)發(fā)酵和酶解體系中，檢測棉粕中游離棉酚、粗蛋白質(zhì)、酸溶蛋白質(zhì)、粗纖維、氨基酸組成、益生菌活菌數(shù)等指標。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比原棉粕，60 h的固態(tài)發(fā)酵與酶解后，棉粕中游離棉酚含量降低40%以上，酸溶蛋白質(zhì)提高了108.7%，粗纖維降低約12.7%，枯草芽孢桿菌和釀酒酵母活菌數(shù)分別為7.75、7.00 lg(CFU/g)，粗蛋白質(zhì)、氨基酸總量基本沒有變化。由此可見，經(jīng)過發(fā)酵和酶解后棉粕的營養(yǎng)價值和飼料品質(zhì)有所提高。

棉粕；固態(tài)發(fā)酵；酶解；游離棉酚；營養(yǎng)成分

我國飼用蛋白資源匱乏，近年來豆粕、魚粉等原料進口量逐年增大。與此同時，作為產(chǎn)棉大國，棉粕年產(chǎn)量超過600萬t[1]。棉粕被認為是一種很好的飼用蛋白來源，粗蛋白質(zhì)含量在35%～50%[2-3]。限制棉粕飼用的因素主要有兩點：一是營養(yǎng)構(gòu)成不均衡和消化率偏低；二是含有抗營養(yǎng)因子，如游離棉酚、環(huán)丙烯脂肪酸等[2,4-5]。

很多研究以降低游離棉酚或改良營養(yǎng)構(gòu)成為靶點，采用微生物發(fā)酵法提升棉粕飼用價值[6-9]。例如，諸葛斌等[10]利用黑曲霉P1和枯草芽孢桿菌H1按2∶1比例混菌發(fā)酵，發(fā)酵后棉粕小肽含量可提高至18.36%，平均肽鏈長度可降至4.23，體外消化率可提高至88.59%；并從多肽降解效果角度說明混菌發(fā)酵優(yōu)于單菌發(fā)酵。喬曉艷等[11]則利用熱帶假絲酵母JD-9和干酪乳桿菌MX-48發(fā)酵棉粕，發(fā)酵后棉粕中游離棉酚含量降低至270 mg/kg，脫毒率達到48.1%; 棉粕中小肽含量提高到14.43%；總氨基酸和必需氨基酸含量分別提高了10.81%和11.57%，其中賴氨酸和蛋氨酸含量分別提高了11.24%和35.48%。吳妍妍等[12]發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌S5菌種發(fā)酵后，棉粕中有機酸(戊酸、琥珀酸、檸檬酸)、B族維生素(B1、B2、B3、B5)、游離氨基酸(亮氨酸、苯丙氨酸)等含量分別有不同程度的顯著性提高。由此可見，微生物作用有助于棉粕品質(zhì)的改善。

但現(xiàn)有研究大多存在幾點不足：一是固態(tài)發(fā)酵與酶解法結(jié)合處理棉粕的研究相對較少，且工藝細節(jié)報道不多，如加酶時間點和添加量與微生物生長的關(guān)系，發(fā)酵與酶解效果的關(guān)鍵指標和關(guān)鍵時間點，發(fā)酵終點的判斷等。二是混淆益生菌和功能化微生物。很多研究將增加益生菌數(shù)量作為發(fā)酵棉粕的主要結(jié)果，忽略了不同微生物特有功能的篩選和體現(xiàn)，缺乏微生物數(shù)量變化和評價指標間的對應關(guān)系。三是無視不同微生物的生理特性、特有功能、生存條件要求及不同酶屬性等，發(fā)酵(多種微生物)和酶解沒有分成若干時間階段加以精細過程控制。

本研究通過利用具有脫除游離棉酚作用的枯草芽孢桿菌、提高酸溶蛋白質(zhì)作用的中性蛋白酶及釀酒酵母的協(xié)同作用，以棉粕為底物進行固態(tài)發(fā)酵并酶解，探究棉粕的毒性因子和營養(yǎng)價值變化，為評價微生物發(fā)酵棉粕源蛋白質(zhì)飼料提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

棉粕，新疆泰昆集團奎屯油廠，質(zhì)量指標為粗蛋白質(zhì)50.27%、含油1.57%、水分8.04%、溶解度63.96%、纖維素6.71%、灰分6.47%，試驗前粉碎至過10目篩。

枯草芽孢桿菌GJ00141，實驗室保藏，經(jīng)由游離棉酚標準品為唯一碳源的篩選體系證實，對游離棉酚有顯著脫除作用；釀酒酵母GJ00079，實驗室保藏，經(jīng)由益生菌體外評價體系篩選；蛋白酶，活性為25 U/g；玉米粉、葡萄糖為食品級；其他試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子液制備

枯草芽孢桿菌GJ00141:取斜面菌種1環(huán)接于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)8 h后，按0.5%比例轉(zhuǎn)接至另一同樣液體培養(yǎng)基，37℃、220 r/min 搖床或(通氧)發(fā)酵罐培養(yǎng)12 h，備用。

釀酒酵母GJ00079: 取斜面菌種1環(huán)接于PDA液體培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min 搖床培養(yǎng)12 h后，按5%比例轉(zhuǎn)接到另一同樣液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min 搖床或(通氧)發(fā)酵罐培養(yǎng)36 h，備用。

1.2.2 固態(tài)發(fā)酵與酶解工藝

原料配比見表1。添加順序:①將棉粕、玉米粉、葡萄糖、無機鹽組合投入反應器中，攪拌均勻；②將枯草芽孢桿菌GJ00141發(fā)酵液與水(25℃≤溫度≤35℃、水添加量為25.00%)混合后均勻灑入發(fā)酵體系中；③發(fā)酵24 h，將釀酒酵母GJ00079發(fā)酵液與水(水添加量為3.43%)混合后均勻灑入發(fā)酵體系中，同時調(diào)節(jié)溫度范圍；④發(fā)酵36 h，將中性蛋白酶與水(45℃≤溫度≤60℃、水添加量為2.00%)混合后均勻灑入發(fā)酵體系中；⑤發(fā)酵60 h后，發(fā)酵和酶解過程結(jié)束，干燥，得到發(fā)酵和酶解產(chǎn)物。

表1 原料配比 %

注：枯草芽孢桿菌和釀酒酵母的有效活菌數(shù)分別為1.0×108CFU/mL和1.0×107CFU/mL；無機鹽組合,包括磷酸氫二鉀和磷酸二氫鈉(1∶1)。

1.2.3 指標檢測

粗蛋白質(zhì)，參照GB/T 6432—1994方法；粗纖維，參照GB/T 6434—2006方法；游離棉酚，參照GB/T 13086—1991方法；氨基酸組成，參照GB/T 18246—2000方法；酸溶蛋白質(zhì)，參照GB/T 22492—2008方法；枯草芽孢桿菌活菌數(shù)，參照GB/T 4789.2—2010方法；釀酒酵母活菌數(shù)，參照GB/T 4789.15—2010方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離棉酚、酸溶蛋白質(zhì)和微生物的變化

在該固態(tài)發(fā)酵和酶解體系中，枯草芽孢桿菌、釀酒酵母和蛋白酶三者作用所需溫度、水分、水活度、pH等條件不盡相同，故進入反應體系的時間和控制要求也不同。由于游離棉酚是棉粕中最主要的毒性因子，其含量降低主要依靠枯草芽孢桿菌GJ00141的脫除作用，所以枯草芽孢桿菌GJ00141率先被投入到反應體系中；隨著枯草芽孢桿菌GJ00141進入穩(wěn)定期后期和pH的降低，釀酒酵母GJ00079被投入到反應體系中；36 h后，發(fā)酵活躍期基本結(jié)束，加入中性蛋白酶進行酶解過程。

發(fā)酵體系中指標參數(shù)的變化見表2。由表2可知，0～16 h，枯草芽孢桿菌GJ00141生長代謝活躍，活菌數(shù)達到最高點8.3 lg(CFU/g)，與此同時，溫度升高且游離棉酚含量迅速降低，降低約36.6%。24 h后加入釀酒酵母GJ00079，而枯草芽孢桿菌GJ00141生長代謝速度減慢，溫度逐漸降低，pH、游離棉酚含量的變化趨緩。36～60 h，蛋白酶酶解階段，酸溶蛋白質(zhì)含量大幅增加，由3.68%增至7.68%，提高了108.7%；直至反應過程結(jié)束，枯草芽孢桿菌GJ00141和釀酒酵母GJ00079的活菌數(shù)分別為7.75、7.00 lg(CFU/g),游離棉酚含量降低40%以上。

表2 發(fā)酵體系中指標參數(shù)的變化

2.2 粗蛋白質(zhì)和粗纖維的變化

粗蛋白質(zhì)和粗纖維是評定棉粕質(zhì)量的兩個重要指標。固態(tài)發(fā)酵和酶解前后粗蛋白質(zhì)和粗纖維的變化見表3。由表3可知，通過固態(tài)發(fā)酵和酶解，棉粕的粗蛋白質(zhì)含量并沒有顯著增長，而粗纖維含量略有降低，從7.1%降至6.2%，降低約12.7%。由此推斷，所用菌種枯草芽孢桿菌GJ00141和釀酒酵母GJ00079的發(fā)酵過程對粗蛋白質(zhì)總量提高沒有顯著影響，蛋白質(zhì)含量的高低依然取決于棉籽質(zhì)量、脫殼、脫絨工序水平等；粗纖維的降低可能與微生物產(chǎn)生的酶類(如纖維素酶)有關(guān)，這一結(jié)果和喬曉艷等[11]報道一致。

表3 固態(tài)發(fā)酵和酶解前后粗蛋白質(zhì)和粗纖維的變化 %

2.3 氨基酸組成的變化

與豆粕相比，棉粕氨基酸含量不均衡，棉粕中賴氨酸(Lys)含量低，為1.97%～2.13%，只有豆粕的50%左右，同時賴氨酸的利用率較差。故賴氨酸是棉粕的第一限制性氨基酸，但精氨酸(Arg)含量(4.65%～4.98%)遠高于豆粕(只有3.4%左右)，色氨酸、甲硫氨酸含量豐富[1]。固態(tài)發(fā)酵和酶解前后氨基酸組成的變化見表4。

表4 固態(tài)發(fā)酵和酶解前后氨基酸組成的變化 %

由表4可知，通過枯草芽孢桿菌GJ00141和釀酒酵母GJ00079的固態(tài)發(fā)酵與中性蛋白酶酶解作用，棉粕的氨基酸總量在40.50%～41.76%范圍間；與原棉粕相比，發(fā)酵和酶解棉粕的氨基酸總量和必需氨基酸總量均沒有顯著性改變(P>0.05)，而氨基酸組成發(fā)生了明顯的變化，如精氨酸含量降低了1.4%～14.3%。

2.4 穩(wěn)定性中試試驗

為了驗證本試驗采取工藝的穩(wěn)定性，重復進行21次、單次物料投入量250 kg的中試試驗，以游離棉酚脫除率為主要檢驗指標。通過固態(tài)發(fā)酵和酶解，游離棉酚降至330～575.5 mg/kg之間；測量值中位數(shù)對比中，游離棉酚脫除率為51.2%；且固態(tài)發(fā)酵和酶解產(chǎn)物形態(tài)良好。由此可推測，本試驗工藝復現(xiàn)性好，易于工業(yè)擴大化推廣。

3 結(jié) 論

本試驗研究了在枯草芽孢桿菌GJ00141、釀酒酵母GJ00079和中性蛋白酶等參與的固態(tài)發(fā)酵和酶解體系中棉粕的毒性因子和營養(yǎng)成分的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過60 h的處理，相比于原棉粕，固態(tài)發(fā)酵和酶解后的棉粕中游離棉酚含量降低40%以上，酸溶蛋白質(zhì)含量提高了108.7%，粗纖維含量降低了12.7%，枯草芽孢桿菌和釀酒酵母活菌數(shù)分別為7.75、7.00 lg(CFU/g)，pH降至5.0左右，呈酸香味；而粗蛋白質(zhì)、氨基酸總量基本沒有變化。并在中試試驗中重復該工藝，以游離棉酚脫除率為衡量指標，棉粕的發(fā)酵和酶解效果穩(wěn)定。綜上所述，使用發(fā)酵和酶解工藝能夠穩(wěn)定地提高棉粕的營養(yǎng)價值和飼料品質(zhì)。

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Treatment of cottonseed meal by solid-state fermentation and enzymatic hydrolysis

HAN Wei1, LI Xiaomin1, LIU Qian1, WANG Xiaoling2, ZHANG Xiaolin1

(1.Fermentation Biotechnology Group, Academy of State Administration of Grain, Beijing 100037,China;2.School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China)

The changes of toxic factors and nutritional components in cottonseed meal treated by solid-state fermentation and enzymatic hydrolysis were studied. The free gossypol, crude protein, acid soluble protein, crude fiber, amino acid composition and viable count of probiotics were determined in the system of solid-state fermentation and enzymatic hydrolysis participated byBacillussubtilisGJ00141,SaccharomycescerevisiaeGJ00079 and neutral proteinase. The results showed that compared with the original cottonseed meal,after solid-state fermentation and enzymatic hydrolysis for 60 h, the contents of free gossypol and crude fiber decreased by more than 40% and 12.7% respectively, the acid soluble protein increased by 108.7%, the viable count ofBacillussubtilisandSaccharomycescerevisiaewere 7.75, 7.00 lg(CFU/g) respectively, and the contents of crude protein and total amino acid unchanged. Therefore, the nutritional value and feed quality of cottonseed meal were improved by fermentation and enzymatic hydrolysis.

cottonseed meal; solid-state fermentation; enzymatic hydrolysis; free gossypol; nutritional component

2016-05-30；

2016-10-27

國家糧食局科學研究院自主選題科研計劃課題(ZX1505)

韓 偉(1983)，男，助理研究員，碩士研究生，研究方向為工業(yè)微生物(E-mail)hw@chinagrain.org。

張曉琳，教授(E-mail)zxl@chinagrain.org。

S816;TQ92

A

1003-7969(2017)01-0112-04