2株棉酚分解菌對棉籽油脫毒效果的研究

海米代·吾拉木，阿依米熱·毛拉木，烏斯?jié)M·依米提

(新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046)

油脂安全

2株棉酚分解菌對棉籽油脫毒效果的研究

海米代·吾拉木，阿依米熱·毛拉木，烏斯?jié)M·依米提

(新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046)

以從棉花秸稈中分離得到的2株棉酚分解菌莫海威芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)和死谷芽孢桿菌(Bacillusvallismortis)為實驗菌株，對棉酚含量高的棉籽油進(jìn)行脫毒實驗。結(jié)果表明：莫海威芽孢桿菌和死谷芽孢桿菌對棉籽油具有一定的脫毒作用，脫毒率分別達(dá)到22.1%和22.2%。

棉酚分解菌；脫毒效果；微生物發(fā)酵；棉籽油

新疆是我國的產(chǎn)棉大區(qū)，棉花總產(chǎn)量達(dá)353.3萬～360萬t(2015年)，占全國棉花產(chǎn)量的60%[1]，每年棉花秸稈總產(chǎn)量為770萬t(2009年)[2]，擁有十分豐富的棉花副產(chǎn)品資源。棉花副產(chǎn)品包括棉花秸稈、棉籽餅、棉籽粕、棉籽油及棉籽油泥等[3]。棉籽油是棉花加工產(chǎn)量高的主要副產(chǎn)品之一。由于棉籽油中游離棉酚含量較高，對人體健康有害。國標(biāo)GB 2716—2005《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定食用棉籽油中游離棉酚的含量不得超過0.02%，超過此規(guī)定的棉籽油不能食用和出售[4-5]。

芽孢桿菌(Bacillus)是種類多、分布廣的一種植物病害生物防治研究中的重要非致病細(xì)菌，是土壤和植物微生態(tài)系統(tǒng)的優(yōu)勢種群，在防治植物病害方面發(fā)揮多種有益作用。

目前采用的棉酚脫毒法有物理脫毒法、化學(xué)脫毒法及微生物發(fā)酵脫毒法。其中微生物發(fā)酵脫毒法是當(dāng)前最安全、脫毒效果最好、生產(chǎn)成本低的脫毒方法[6]。本文以添加對游離棉酚具有分解能力的棉酚分解菌來脫除棉酚，以期為棉籽油脫除棉酚提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

莫海威芽孢桿菌(Bacillusmojavensis，B1)、死谷芽孢桿菌(Bacillusvallismortis，B9)，從吐魯番地區(qū)棉花秸稈中分離得到；棉籽油，來自于新疆吐魯番市棉籽加工廠。

磷酸，丙酮，無水乙醇，氮氣，甲醇，棉酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度>95%)。

高壓滅菌鍋，振蕩培養(yǎng)箱，數(shù)顯光照培養(yǎng)箱，電子天平，燒杯，pH精密試紙，稱量紙，超凈操作臺，高效液相色譜儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 棉酚標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備

準(zhǔn)確稱取0.1 g(精確到0.000 1 g)棉酚標(biāo)準(zhǔn)品，用丙酮溶解，并定容至100.00 mL。

1.2.2 棉酚中間標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

取1.0 mg/mL棉酚標(biāo)準(zhǔn)儲備液5.0 mL于100 mL 容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度。

1.2.3 棉酚標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備

準(zhǔn)確吸取1.00、2.00、5.00、8.00 mL棉酚中間標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，分別得到5、10、25、40 μg/mL的棉酚標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.4 HPLC測定棉酚

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別將棉酚標(biāo)準(zhǔn)工作液注入高效液相色譜儀中，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，棉酚標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。HPLC條件：色譜柱為C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)或具同等性能的色譜柱；流動相為甲醇-磷酸溶液(體積比85∶15)；流速1.0 mL/min；柱溫(40±1)℃；紫外測定波長235 nm；進(jìn)樣體積10 μL。得到回歸方程y=59.856x-23.497，R2=0.999 8。

1.2.4.2 試樣制備及測定

稱取油樣1 g(精確至0.01 g)于離心試管中，加入5 mL無水乙醇，劇烈振搖2 min，靜置分層(或冰箱過夜)，取上清液濾紙過濾，4 000 r/min離心10 min，上清液過0.45 μm濾膜，即為試樣液。將試樣液注入高效液相色譜儀中，按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算待測液中游離棉酚含量。

1.2.5 菌株活化

將分離后凍存的2株棉酚分解菌各取出1 mL，分別加入到100 mL以醋酸棉酚為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中，在35℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行第1次活化。取出第1次活化的菌株3 mL，加入到250 mL的培養(yǎng)基中，在35℃培養(yǎng)16～24 h進(jìn)行第2次活化。

1.2.6 棉酚分解菌對棉籽油的脫毒

將經(jīng)兩次活化的棉酚分解菌菌懸液各取5 mL分別接種到50 mL棉籽油中進(jìn)行脫毒實驗。對照組：未接種菌懸液，35℃振蕩培養(yǎng)3 d的棉籽油；實驗組1：添加B1菌懸液，35℃振蕩培養(yǎng)3 d的棉籽油；實驗組2：添加B9菌懸液，35℃振蕩培養(yǎng)3 d的棉籽油。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS17和Excel軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 棉酚分解菌對棉籽油中游離棉酚含量的影響(見表1)

從表1可以看出，棉酚分解菌B1和B9對棉籽油中游離棉酚脫毒率分別達(dá)到21.1%和22.2%。對照組與各實驗組之間差異極顯著(P<0.01)，實驗組1和實驗組2之間差異不顯著(P>0.05)。說明2株棉酚分解菌對棉籽油有一定的脫毒作用。

表1 棉酚分解菌對棉籽油中游離棉酚含量的影響

2.2 2株棉酚分解菌脫毒效果分析

近幾年來，國內(nèi)有關(guān)棉酚分解菌分離鑒定的報道主要集中于酵母菌和霉菌的分離鑒定，而有關(guān)芽孢桿菌對棉酚降解作用方面的研究較少[7]。楊利民等[8]發(fā)現(xiàn)一種死谷芽孢桿菌(SZ-4)對惡疫霉菌(Phytophthoracactorum)、腐皮鐮孢菌(Fusariumsolani)、葡萄孢菌(Botrytiscinerea)和人參核盤菌(Sclerotiniaschinseng)菌絲生長有抑制作用。司麗娜[9]研究表明，死谷芽孢桿菌對棉花枯萎病致病菌具有拮抗作用，抑菌率可達(dá)到87.4%，并證明其與有機(jī)肥共同施用不但有防病的作用，同時還可使連作棉花土壤微生物群向合理健康的方向發(fā)展。馮中紅等[10]通過實驗驗證莫海威芽孢桿菌(ZA1)對馬鈴薯壞疽病具有拮抗作用。上述文獻(xiàn)主要研究死谷芽孢桿菌和莫海威芽孢桿菌對棉花枯萎病致病菌的拮抗作用和對馬鈴薯壞疽病的拮抗作用，而本文研究發(fā)現(xiàn)這兩種菌株對游離棉酚有一定的分解作用，為其在棉籽油加工中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)研究。

與前人研究報道的脫毒率比較，這2株棉酚分解菌對棉籽油的脫毒率不太高，可能是由于：①棉籽油中含有2%以上的棉酚及磷脂、甾醇、樹脂、脂、烴類和色素，這些成分不能只用微生物發(fā)酵法來脫除，一定要經(jīng)過精煉；②在棉籽油發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時間的延長，底物中有機(jī)物質(zhì)的濃度不斷下降，微生物沒有足夠的營養(yǎng)來源，微生物濃度和活力下降，因此微生物降解率較低；③可能微生物的脫毒率與選擇的樣品化學(xué)性質(zhì)有關(guān)，不同微生物對不同底物的脫毒率也有差別。

3 結(jié) 論

棉籽加工過程中大部分的游離棉酚沉淀在棉籽油中，因此棉籽油中游離棉酚含量較高。本文以從棉花秸稈中分離篩選的莫海威芽孢桿菌、死谷芽孢桿菌為實驗菌株，對棉籽油進(jìn)行脫毒實驗，結(jié)果表明莫海威芽孢桿菌和死谷芽孢桿菌對游離棉酚的脫毒率分別達(dá)到21.1%和22.2%。目前關(guān)于棉酚分解菌對棉花副產(chǎn)品發(fā)酵過程中的代謝機(jī)理還不清楚，需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。

[1] 劉福元，鄒阿玲，陳建國，等. 整粒棉籽飼喂荷斯坦牛的試驗研究[J]. 中國奶牛，2015(22)：8-10.

[2] 熱沙來提汗·買買提. 化學(xué)及生物處理對棉花秸稈消化性改善效果研究[D]. 烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[3] 田小紅. 新疆棉副產(chǎn)品的主要成分的提取分析研究[D]. 烏魯木齊：新疆大學(xué)，2012.

[4] 潘江貴. 棉酚的特性及在棉籽油生產(chǎn)中的工藝控制[J]. 中國新技術(shù)新產(chǎn)品，2013(6)：23.

[5] 劉大川. 棉籽油加工及其營養(yǎng)[J]. 中國油脂，2012，37(11)：8-10.

[6] 楊霞. 高效棉酚降解菌株的篩選鑒定及其差異蛋白組學(xué)研究[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2010.

[7] 張叢，李佳，袁洪水，等. 高效降解棉酚菌株的篩選鑒定及毒性試驗[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2012，28(12)：112-117.

[8] 楊利民，孫卓，韓梅，等. 一種死谷芽孢桿菌及其應(yīng)用：CN103952329[P]. 2014-07-30.

[9] 司麗娜. 微生物菌肥菌種分離，鑒定及混合發(fā)酵[D]. 濟(jì)南：山東大學(xué)，2012.

[10] 馮中紅，暢濤，楊成德，等. 一株抗馬鈴薯壞疽病莫海威芽孢桿菌(BacillusmojavensisZA1)培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J]. 草業(yè)學(xué)報，2016，25(2)：77-86.

Detoxification of cottonseed oil by two gossypol decomposing bacterias

HAIMIDA Gulamu，AYMIHRI Mollal，WUSIMAN Yimitil

(College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046，China)

The two strains ofBacillusmojavensisandBacillusvallismortisseparated from cotton straw were used to decompose the free gossypol in cottonseed oil. The results showed thatBacillusmojavensisandBacillusvallismortishad certain detoxification effects，and their detoxification rates were 22.1% and 22.2%，respectively.

gossypol decomposing bacteria；detoxification effect；microbial fermentation；cottonseed oil

2016-05-07；

2016-10-21

國家自然科學(xué)基金項目(31260014)

海米代·吾拉木(1990)，女(維吾爾族)，在讀碩士，研究方向為微生物資源開發(fā)(E-mail)haimida215@163.com。

烏斯?jié)M·依米提，副教授，博士(E-mail)xafkat@sina.com。

TS201.6;Q939.9

A

1003-7969(2017)01-0074-03