離子液體體系對脂肪酶性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的影響研究進展

秦 杰，鄒孝強，金青哲，王興國

(江南大學 食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，食品營養(yǎng)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122)

油脂化學

離子液體體系對脂肪酶性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的影響研究進展

秦 杰，鄒孝強，金青哲，王興國

(江南大學 食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，食品營養(yǎng)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122)

簡述了離子液體的特點，包括蒸氣壓低、不可燃、不揮發(fā)等優(yōu)點；分析了利用離子液體為介質(zhì)的酶促反應中酶的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的變化。離子液體體系能夠提高脂肪酶的活性、穩(wěn)定性和選擇性，并且相對于有機溶劑較好地保護了脂肪酶的二級結(jié)構(gòu)。離子液體的性質(zhì)，如疏水性、極性和黏度都可能影響脂肪酶的活性、穩(wěn)定性和二級結(jié)構(gòu)。

離子液體；酶活性；穩(wěn)定性；選擇性；結(jié)構(gòu)

離子液體大多常溫下呈液態(tài)，具有飽和蒸氣壓低、不可燃性、疏水性、可設計性等特殊性質(zhì)，作為一種新型溶劑，廣泛應用在酶催化反應中。自1984年發(fā)現(xiàn)酶在有機溶劑中表現(xiàn)出一定活力和獨特性質(zhì)后，有機溶劑體系中的酶促反應逐漸引起了人們的重視，并且研究較為成熟，但有機溶劑熔點低，在反應過程中存在揮發(fā)、對人體有害和污染環(huán)境的缺點。而離子液體可以彌補有機溶劑的缺點，并且在離子液體作介質(zhì)下，脂肪酶的活性、穩(wěn)定性和選擇性都有了提升，并且產(chǎn)物的得率和原料的轉(zhuǎn)化率也有了提高，因此離子液體的應用將會是今后研究的一個熱點。本文從離子液體的簡介、離子液體對脂肪酶性質(zhì)的影響、離子液體對脂肪酶二級結(jié)構(gòu)的影響3個方面作介紹。

1 離子液體

1.1 離子液體簡介

離子液體(Ionic liquids，ILs)，是指由特定的有機陽離子與無機或有機陰離子構(gòu)成的，在室溫或近室溫下呈液態(tài)的熔鹽體系[1]。傳統(tǒng)的溶劑大多是由分子組成的液體，而離子液體是由陰陽離子組成的(常見組成離子液體的陰陽離子見表1、圖1)[2]，因此離子液體具有一定的可設計性。根據(jù)陽離子的不同，離子液體可以分為吡啶鹽類、咪唑鹽類、吡咯啉類、噻唑類、季銨鹽類、季磷鹽類等[3]。

離子液體熔點低(<100℃)，液體溫度范圍寬，離子液體的性質(zhì)大多取決于組成的陰陽離子[3]。離子液體是一類極性較強的溶劑，但是大多數(shù)離子液體是疏水性的，僅僅能溶解很少量的水[2,4](1%左右)，而且水的存在可能會影響其物理性質(zhì)[2]。

表1 離子液體中常見陰離子

圖1 離子液體中常見陽離子

1.2 離子液體的特點

離子液體可以被設計成環(huán)境友好型、可持續(xù)發(fā)展的溶劑[5]。通過不同陰陽離子的組合，可以較大范圍地改變離子液體的物理化學性質(zhì)。離子液體具有以下特性：蒸氣壓低；溶解能力強，能夠溶解各種溶質(zhì)，包括極性的或非極性的有機物、無機物、聚合物[5]；可與許多溶劑形成兩相系統(tǒng)[3]；不可燃，大多具有良好的熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性；可設計性，可以通過改變離子液體陰陽離子的種類，從而改變其極性、疏水性和溶解性等。然而，離子液體合成途徑復雜且較難合成很純的離子液體，因此其價格較高；離子液體的可設計性導致部分離子液體所采用的陰陽離子在合成過程中仍存在毒性，離子液體的生物毒性的強弱主要與其陽離子烷基碳鏈長度有關，但目前研究離子液體的生物毒性機制還不夠，還需繼續(xù)研究才能評估對整個生態(tài)環(huán)境及人類健康的影響[6]。

2 離子液體對脂肪酶性質(zhì)、結(jié)構(gòu)的影響

2.1 離子液體對脂肪酶性質(zhì)的影響

2.1.1 離子液體對脂肪酶活性、穩(wěn)定性的影響

酶的活性指酶催化特定化學反應的能力。一般情況下，酶催化反應的活力大小由一定反應條件下酶促反應的反應速度確定，酶促反應速度越小，酶的活力越小。在反應過程中，酶的活性受到底物濃度、酶濃度、溫度、pH、激活劑、抑制劑等因素的影響，因此隨著反應的進行，底物濃度可能發(fā)生改變，酶本身受影響或產(chǎn)物對反應的抑制作用，這些因素都會影響酶促反應速度的測定，繼而影響到酶活力的測定，所以在反應初期的一段時間內(nèi)取樣，測到的酶促反應的速度是一致的，也比較能客觀地表征酶促反應的反應速度，可表征該反應中酶的活力[7]。

2.1.1.1 疏水性

疏水性是指一個分子與水互相排斥的物理性質(zhì)，常常被人們與極性相聯(lián)系，但其實兩者有本質(zhì)的區(qū)別。疏水性用logP(辛-水分配系數(shù))表征， 就是離子液體在水飽和的正辛醇與正辛醇飽和的水中濃度比的對數(shù)值，離子液體雖然都有較高的極性，但是通常是疏水性的。離子液體中酯交換的初速度與離子液體的logP有很好的相關性，疏水性的離子液體除[Bmim][TfO]以外都誘發(fā)了酶的活性，而在親水性離子液體中酶的活性非常低[13]。

吳紅平[14]研究非水相脂肪酶催化合成辛酸戊酯時發(fā)現(xiàn)含[BMIM][PF6]的有機溶劑體系中，反應初速度隨溶劑logP(2.0～5.1)的增大先降低后升高，此變化趨勢與有機溶劑中反應初速度隨溶劑logP的變化趨勢一致。

Lou等[15]研究發(fā)現(xiàn)離子液體中酶活性與其logP之間有較好的相關性。Zhao等[16]研究了Novozyme 435在20多種離子液體中的轉(zhuǎn)酯化反應，發(fā)現(xiàn)脂肪酶的活性先隨著logP增大達到最大值，然后隨logP的繼續(xù)增大而減小，與疏水性呈現(xiàn)松散的鐘形關系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高疏水性有利于酶的穩(wěn)定性，然而高疏水性同樣意味著底物基態(tài)的熱力學穩(wěn)定性增加，反而導致底物轉(zhuǎn)化率下降。相關文獻報道結(jié)果見表2。

表2 離子液體體系疏水性對酶活力的影響

2.1.1.2 黏度

離子液體的黏度普遍高于有機溶劑，其黏度與乙二醇相近，遠遠高于甲醇和甲苯等常用的有機溶劑。氫鍵和范德華力的強弱決定了離子液體的黏度。一般情況下，陽離子烷基取代基的碳鏈越長，陰離子越大，離子液體的黏度越高。Van Rantwijk等[18]認為高黏度的離子液體減緩了蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，使酶可以較長時間保持原來的結(jié)構(gòu)和活力。然而，這一理論并不一定完全正確。Basso等[19]則得出了相反的結(jié)論，他們認為離子液體[BMIM][PF6]和[BMIM][BF4]的黏度并沒有影響酰胺合成反應中的反應速率。Zhao等[16]研究了20 多種離子液體中的酶促轉(zhuǎn)酯化反應，認為高黏度的離子液體一定程度上影響了酶的反應速率，但黏度不是決定酶活力的首要因素。

2.1.1.3 極性

2.1.2 離子液體對脂肪酶對映選擇性的影響

對映選擇性是指反應優(yōu)先生成或消耗一對對映異構(gòu)體中的某一種。離子液體中酶促反應會提高酶的對映選擇性，酶催化不對稱水解反應的對映選擇性是由熱力學參數(shù)(平衡常數(shù))和動力學參數(shù)(對映體比率)復雜的相互作用決定的。一些酶在離子液體中的對映選擇性比有機溶劑高，某些脂肪酶在離子液體中動力學拆分手性醇時，表現(xiàn)出高的對映選擇性[22-25]。Itoh等[26]用Candidaantarctica酶在催化手性烯丙基醇轉(zhuǎn)酯化反應中，離子液體([PF6]-類的離子液體為主)影響了酶的結(jié)構(gòu)，在此過程中，酶的活性和對映選擇性相比有機溶劑都有了顯著的提高。辛嘉英等[27]對比研究了水飽和異辛烷和水飽和離子液體[BMIM][PF6] 中脂肪酶催化萘普生甲酯不對稱水解反應，結(jié)果表明：[BMIM][PF6]同時具有極性和疏水性，是萘普生甲酯不對稱水解反應較好的反應介質(zhì)；與異辛烷相比，離子液體降低了水解反應的平衡常數(shù)，增大了對映體比率，因此提高了水解反應的平衡轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的對映體過量值。Fráter等[28]研究了在離子液體和異丙醇混合物中的α-乙酰氨基肉桂酸的不對稱氫化反應，使用Rh-EtDuPHOS作為催化劑，在[BMIM][BF4]/i-PrOH介質(zhì)中得到了ee值為93%的對映選擇性。

2.1.3 離子液體對脂肪酶位置選擇性的影響

脂肪酶位置的選擇性對甘油酯的合成較為重要。目前脂肪酶大多分為兩種，無特異性和sn-1,3位置選擇性，在催化合成甘油酯的過程中，如果脂肪酶對sn-1或sn-3作用能力大于sn-2時，合成產(chǎn)品中sn-1,3甘油二酯的含量較高[29]。目前尚未有離子液體對脂肪酶位置選擇性影響的相關研究。李人望[30]研究了溶劑和水活度對脂肪酶位置選擇性的影響，首先以單甘酯的醇解為載體，研究了脂肪酶位置選擇性與溶劑的關系，得出結(jié)論：在相同水活度下Lipozyme TL的位置選擇性隨著溶劑logP的增大而逐漸減弱，而位置選擇性很弱的Novozyme 435 醇解速率常數(shù)的變化規(guī)律與Lipozyme TL是一致的。進而研究了甘油三酯醇解體系，通過比較甘油二酯和單甘酯隨甲醇變化率的變化和甲醇轉(zhuǎn)化率隨時間的變化發(fā)現(xiàn)，在相同水活度下，脂肪酶Lipozyme TL的位置選擇性隨著疏水性提高而減弱。這是因為親水性溶劑會使脂肪酶活性中心附近的氫鍵數(shù)目明顯大于疏水性溶劑中脂肪酶活性中心附近的氫鍵數(shù)目，氫鍵的增多會使局部區(qū)域變得更為緊湊，從而催化活性會降低，然而位置選擇性卻提高了[30]。

生物催化反應在離子液體中顯示出較高的選擇性、較快的速度和較好的穩(wěn)定性[11]。使用較強極性的溶劑提高極性物質(zhì)溶解度的能力可以加快反應速率，并且改變反應的位置選擇性。Park等[10]在離子液體中用從CAL-B提取出來的脂肪酶B來催化葡萄糖的乙?；倪^程中，脂肪酶有更高的位置選擇性，因為葡萄糖在離子液體中的溶解度是在有機溶劑中的100倍。

2.2 離子液體對脂肪酶結(jié)構(gòu)的影響

酶的二級結(jié)構(gòu)可以通過傅里葉紅外光譜測定，其紅外吸收光譜主要由一系列酰胺吸收帶組成，其中酰胺 Ⅰ 帶(1 600～1 700 cm-1)和酰胺Ⅲ帶(1 220～1 330 cm-1)在研究二級結(jié)構(gòu)中應用較多。酰胺Ⅰ帶通過分析可以分辨出α-螺旋、β-折疊、γ-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲，其中α-螺旋、β-折疊在二級結(jié)構(gòu)指認方面的研究已經(jīng)比較成熟。Santiago-Gómez等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在有機溶劑中氫過氧化物裂合酶中α-螺旋含量的增加，會使酶活力顯著增加。Pavlidis等[31]研究發(fā)現(xiàn)，從Candidarugosa,Chromobacteriumviscosum和Thermomyceslanuginose提取的酶在水和離子液體混合微乳液中的催化活力與酶的二級結(jié)構(gòu)含量有很大的聯(lián)系，具體表現(xiàn)為α-螺旋含量降低、β-折疊含量增高時，酶的催化活力提高。楊麗萍[32]研究離子液體在中碳鏈甘油酯的合成中，對正己烷、[BMIM][PF6]、[BMIM][BF4]、[BMIM][Tf2N]中孵育的脂肪酶二級結(jié)構(gòu)進行了檢測，發(fā)現(xiàn)24 h孵育后[BMIM][BF4]處理的Novozyme 435中α-螺旋對應的子峰消失，α-螺旋含量顯著降低，而在反應過程中，酶幾乎沒有活性，呈現(xiàn)失活態(tài)勢；而在[BMIM][PF6]、[BMIM][Tf2N]中α-螺旋含量無顯著變化，酶活力較好。Liu等[8]研究Burkholderiacepacia脂肪酶在有機溶劑和離子液體中催化活力和結(jié)構(gòu)變化得出，這種酶中α-螺旋含量的降低會影響酶活性位點，α-螺旋含量越低，更容易接觸到反應底物，活性位點“打開”越大，從而影響酶催化反應的活力。

3 展 望

離子液體作為一種新型的、可設計的介質(zhì)，其特殊的性質(zhì)可以彌補有機溶劑的缺點。目前，很多研究發(fā)現(xiàn)脂肪酶在離子液體中的活性、穩(wěn)定性以及選擇性都比有機溶劑中好，但沒有系統(tǒng)指出離子液體性質(zhì)與酶催化反應中性能的相關性，也就是對于不同的反應如何選擇離子液體還沒有系統(tǒng)的指導；目前利用離子液體合成甘油酯的研究大多采用甘油解的方式，但是難以得到高純度的單一脂肪酸甘油酯。因此，后續(xù)的研究大概從以下方面進行：首先建立不同反應中酶活力、穩(wěn)定性和選擇性與離子液體性質(zhì)之間的關系，供研究者參考，繼而篩選出較合適的離子液體和脂肪酶進行合成上的應用；離子液體對脂肪酸的影響也可以進行考慮，是否對脂肪酸具有一定的選擇性，這可以為以后不同脂肪酸類甘油酯的合成作鋪墊；離子液體作為介質(zhì)的反應中，對產(chǎn)物的選擇性也可進行研究，在甘油酯方面，對單甘酯和甘油二酯是否具有選擇性也是值得探索的問題。

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Advance in influence of ionic liquids system on properties and structure of lipase

QIN Jie, ZOU Xiaoqiang, JIN Qingzhe, WANG Xingguo

(Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition, State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China)

The characteristics of ionic liquids were introduced, including low vapor pressure, nonflammable and nonvolatile. The changes of properties and structure of enzyme during enzymatic reaction with ionic liquid as medium were analyzed. Ionic liquids system could improve the activity, stability and selectivity of lipase, and protect the secondary structure of lipase compared with organic solvent. The activity, stability and secondary structure of lipase may be influenced by the properties of ionic liquids, such as hydrophobicity, polarity and viscosity.

ionic liquid; enzyme activity; stability; selectivity; structure

2016-03-24;

2016-09-22

江蘇省自然科學基金(BK20140149)

秦 杰(1992)，男，在讀碩士，研究方向為脂質(zhì)科學與技術(E-mail)qinjie_qj@163.com。

鄒孝強，副教授(E-mail)xiaoqiangzou@163.com。

TQ426;Q556

A

1003-7969(2017)01-0026-05