圓二色光譜在中藥小分子與生物大分子相互作用中應(yīng)用的研究進(jìn)展Δ

徐 飛，于 慧，陸 彩，陳 軍，谷 巍，吳啟南（.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 0046；.江蘇省中醫(yī)院血液科，南京 009）

·綜述講座·

圓二色光譜在中藥小分子與生物大分子相互作用中應(yīng)用的研究進(jìn)展Δ

徐 飛1＊，于 慧2，陸 彩1，陳 軍1，谷 巍1，吳啟南1（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 210046；2.江蘇省中醫(yī)院血液科，南京 210029）

目的：為不同類型中藥小分子體外篩選及設(shè)計(jì)合成改造提供參考。方法：以“圓二色光譜”“中藥小分子與DNA”“中藥小分子與蛋白質(zhì)”“Circular dichroism”“Interaction of traditional Chinese medicine and DNA”“Interaction of traditional Chinese medicine and protein”等為關(guān)鍵詞，組合查詢2005年1月－2016年4月在PubMed、Web of Science、Wiley Online Library、SpringerLink、中國知網(wǎng)、萬方、維普等數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)文獻(xiàn)，對圓二色光譜（CD）在中藥小分子與DNA、中藥小分子與蛋白質(zhì)相互作用中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。結(jié)果與結(jié)論：共檢索到相關(guān)文獻(xiàn)349篇，其中有效文獻(xiàn)54篇。生物堿、黃酮類、醌類、苯丙素類、植物色素等類型的中藥小分子，與DNA相互作用以溝槽結(jié)合和嵌插結(jié)合2種模式為主；苯丙素類、黃酮類、萜類、生物堿、醌類等類型的中藥小分子，與蛋白質(zhì)結(jié)合后，通常使其α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。后續(xù)進(jìn)行誘導(dǎo)圓二色譜的探索性研究，可得到更多兩者相互作用的結(jié)合信息，如中藥小分子與DNA的結(jié)合序列及與蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)；還可將CD與紫外-可見吸收光譜法、熒光光譜、分子模擬等技術(shù)聯(lián)用，以實(shí)現(xiàn)多種技術(shù)互為驗(yàn)證、互為補(bǔ)充。

圓二色光譜；中藥小分子與DNA；中藥小分子與蛋白質(zhì)；相互作用

圓二色光譜（CD）是一種利用平面偏振光研究生物大分子結(jié)構(gòu)的快速、簡單、準(zhǔn)確的方法[1]，對生物大分子二級及三級結(jié)構(gòu)的變化十分敏感，可檢測其微小變動，且具高選擇性。近年來，CD在中藥小分子與生物大分子相互作用的研究中得到了廣泛應(yīng)用。筆者以“圓二色光譜”“中藥小分子與DNA”“中藥小分子與蛋白質(zhì)”“Circular dichroism”“Interaction of traditional Chinese medicine and DNA”“Interaction of traditional Chinese medicine and protein”等為關(guān)鍵詞，組合查詢2005年1月－2016年4月在PubMed、Web of Science、Wiley Online Library、SpringerLink、中國知網(wǎng)、萬方、維普等數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)文獻(xiàn)。結(jié)果，共檢索到相關(guān)文獻(xiàn)349篇，其中有效文獻(xiàn)54篇?，F(xiàn)對CD在中藥小分子與DNA、中藥小分子與蛋白質(zhì)相互作用中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期為不同類型中藥小分子體外篩選及設(shè)計(jì)合成改造提供參考。

1 CD在中藥小分子與DNA相互作用中的應(yīng)用

DNA是組成生命體最重要的物質(zhì)之一，是生命體重要的遺傳信息載體，是很多藥物的重要靶點(diǎn)。研究中藥小分子與DNA的相互作用，有助于從分子水平上了解其藥用機(jī)制，而且對抗腫瘤、抗病毒藥物的體外設(shè)計(jì)、篩選都具有十分重要的意義。

DNA的CD譜是由其骨架結(jié)構(gòu)中的不對稱糖分子和由這些糖分子的構(gòu)型決定的螺旋結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的。根據(jù)中藥小分子對原有的DNA CD信號的影響，可得知其DNA結(jié)合的不同模式。DNA的CD特征峰包括248 nm處的負(fù)峰與276 nm處的正峰，前者對應(yīng)DNA的右手螺旋B構(gòu)象，后者對應(yīng)DNA的堿基堆積，兩者均對DNA與小分子的相互作用模式非常敏感。中藥小分子與DNA相互作用主要有非共價(jià)鍵結(jié)合、共價(jià)鍵結(jié)合（烷基化/金屬化）和剪切作用3種模式。非共價(jià)鍵結(jié)合又分為靜電結(jié)合、溝槽結(jié)合和嵌插結(jié)合3種模式。靜電結(jié)合是小分子作用于DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的外壁，無選擇性；溝槽結(jié)合是分子與DNA的大溝或小溝的堿基對邊緣直接作用，中藥小分子多在小溝區(qū)作用；嵌插結(jié)合是小分子中的平面結(jié)構(gòu)嵌入核酸的堿基之間，這是中藥小分子與DNA發(fā)生相互作用的最重要的形式之一。小分子與DNA的溝槽結(jié)合和靜電結(jié)合對堿基堆積和螺旋的色帶影響很小或幾乎沒有影響，而嵌插結(jié)合會改變色帶的穩(wěn)定并使DNA的右手螺旋B構(gòu)象向C構(gòu)象轉(zhuǎn)變[2-5]。下面從中藥的有效成分幾大分類分別進(jìn)行介紹。

1.1 生物堿

Kundu N等[2]研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸小檗堿（BBCL）與DNA作用時(shí)，插入DNA堿基對，該結(jié)果為深入研究其抗腫瘤作用機(jī)制提供了理論依據(jù)。Chen ZF等[3]研究發(fā)現(xiàn)，氧化海罌粟堿（OG）及其與金離子（Au3+）、鋅離子（Zn2+）、鈷離子（Co2+）、錳離子（Mn2+）4種金屬配合物與DNA相互作用的方式均是嵌插結(jié)合。Saha SK等[4]研究發(fā)現(xiàn)，白毛茛（HC）中的小檗堿、黃連堿、巴馬汀和氫化小檗堿與DNA的結(jié)合導(dǎo)致了DNA構(gòu)象變化，作用方式為嵌插結(jié)合。

BBCL、OG、小檗堿、氫化小檗堿、黃連堿、巴馬汀等均屬于異喹啉類生物堿，該類生物堿結(jié)構(gòu)為2個(gè)異喹啉環(huán)稠合而成。CD譜結(jié)果顯示，其與DNA結(jié)合模式均為嵌插結(jié)合。

1.2 黃酮類

李悅等[5]研究發(fā)現(xiàn)，楊梅素使DNA的CD譜正峰和負(fù)峰強(qiáng)度略有減弱，同時(shí)正峰位伴有輕微藍(lán)移，說明楊梅素與DNA為溝槽結(jié)合。歐陽熙林等[6]研究發(fā)現(xiàn)，山柰苷及其鋅配合物與DNA作用時(shí)均以插入方式嵌入到DNA雙鏈的堿基對之間。配合物插入鍵合作用更強(qiáng)，說明山柰苷鋅配合物抗腫瘤能力強(qiáng)于山柰苷。王瑞玲[7]研究發(fā)現(xiàn)，4′-苯基-3-溴-8-[N，N-二（2-羥基乙基）氨基甲基]黃酮會使274 nm波長處信號發(fā)生變化，說明其與DNA發(fā)生了嵌插結(jié)合。Hemachandran H等[8]研究發(fā)現(xiàn)，兒茶素與DNA非嵌插結(jié)合，而是發(fā)生溝槽結(jié)合和靜電作用。Hegde AH等[9]研究發(fā)現(xiàn)，橙皮素和柚皮素與DNA為嵌插結(jié)合。Zhang G等[10]研究發(fā)現(xiàn)，杜鵑素與DNA結(jié)合為嵌插結(jié)合，作用力主要為疏水相互作用和氫鍵。

黃酮類中藥小分子與DNA相互作用的結(jié)合模式不盡相同，與其結(jié)構(gòu)有關(guān)。山柰苷、楊梅素屬于黃酮醇類，兒茶素屬于黃烷醇類，杜鵑素、橙皮素、柚皮素屬于二氫黃酮類，4′-苯基-3-溴-8-[N，N-二（2-羥基乙基）氨基甲基]黃酮屬黃酮類。CD譜的結(jié)果表明，黃酮類和二氫黃酮類中藥小分子與DNA相互作用方式多為嵌插結(jié)合，黃烷醇類和黃酮醇類多為溝槽結(jié)合。比較結(jié)構(gòu)差異可知，黃烷醇類和黃酮醇類C環(huán)的3位均有—OH，而黃酮類和二氫黃酮類該位置無—OH。提示黃酮類化合物的中藥小分子與DNA相互作用的方式可能與其C環(huán)3位上的—OH有關(guān)，該位置為兩者結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。

1.3 醌類

李玉英等[11]研究發(fā)現(xiàn)，隨著1，4-二甲基-6，8-二甲氧基-9，10-蒽醌濃度的增大，DNA的CD譜正、負(fù)峰的強(qiáng)度均減弱，說明為嵌插作用。王新寧等[12]研究發(fā)現(xiàn)，隨著大黃素濃度的不斷增加，c-myc G4-DNA在265 nm波長處的正CD信號不斷減弱，且c-myc G4-DNA在295 nm波長處出現(xiàn)了1個(gè)正的誘導(dǎo)CD信號，說明其與c-myc G4-DNA可能是溝槽結(jié)合。

1，4-二甲基-6，8-二甲氧基-9，10-蒽醌和大黃素均屬于羥基蒽醌類，但兩者與DNA的結(jié)合模式不同。分析結(jié)構(gòu)差異，大黃素的1位、6位和8位均為—OH，1，4-二甲基-6，8-二甲氧基-9，10-蒽醌的結(jié)構(gòu)中無—OH，由此推測該類結(jié)構(gòu)中1、6、8位為兩者結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)，1、6、8位的—OH為兩者結(jié)合的關(guān)鍵基團(tuán)。

1.4 苯丙素類

田莉莉[13]研究發(fā)現(xiàn)，丹參素、咖啡酸、原兒茶醛與DNA相互作用方式為溝槽結(jié)合。呂夢嬌[14]研究發(fā)現(xiàn)，新型選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑類香豆素衍生物與DNA的主要作用方式是溝槽模式，當(dāng)衍生物是由丙二酸相連接時(shí)，CD信號明顯。Sarwar T等[15]研究發(fā)現(xiàn)，秦皮乙素與DNA結(jié)合模式主要為溝槽結(jié)合，不插入DNA堿基對。Zhou X等[16]研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂素（PSO）與DNA的相互作用為嵌插作用。

丹參素、原兒茶醛、咖啡酸屬簡單苯丙素類，PSO、秦皮乙素、新型SERMs類香豆素衍生物均屬香豆素類。CD譜結(jié)果表明，簡單苯丙素類的中藥小分子與DNA的作用模式多是嵌插結(jié)合，而香豆素類的中藥小分子則多為溝槽結(jié)合。分析兩者結(jié)構(gòu)，二者均具有1分子苯環(huán)和3個(gè)直鍵碳連在一起為單位的基礎(chǔ)單元，但香豆素具有苯駢α-吡喃酮母核的結(jié)構(gòu)，因此推測其吡喃環(huán)上的內(nèi)酯鍵可能是造成兩者結(jié)合方式不同的主要原因，為兩者結(jié)合關(guān)鍵基團(tuán)。

1.5 植物色素

Hoshyar R等[17]研究發(fā)現(xiàn)，藏紅花酸、藏紅花苷、藏紅花醛、藏紅花素與G-四鏈體相互作用為溝槽結(jié)合模式，結(jié)合能力藏紅花酸＞藏紅花素，藏紅花苷＞藏紅花醛。Rajesh J等[18]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素及姜黃素-銅（Ⅱ）配合物與DNA相互作用是溝槽結(jié)合模式。Ahmadi F等[19]研究發(fā)現(xiàn)，鋁-姜黃素配合物與DNA結(jié)合的模式為溝槽結(jié)合。

藏紅花酸、藏紅花苷、藏紅花醛、藏紅花素、姜黃素均為脂溶性的植物色素，CD譜表明，該類化合物與DNA相互作用多為溝槽結(jié)合。藏紅花酸、藏紅花苷、藏紅花醛、藏紅花素與DNA的結(jié)合能力有差異：藏紅花酸是具有共軛多烯烴的直鏈結(jié)構(gòu)，碳鏈兩端的第2個(gè)碳上均為—COOH；藏紅花素是由藏紅花酸與2個(gè)分子龍膽二糖結(jié)合而成的酯，即兩端—COOH中的H被龍膽二糖取代。而藏紅花酸與DNA結(jié)合能力遠(yuǎn)大于藏紅花素，提示藏紅花酸類結(jié)構(gòu)的中藥分子中兩端—COOH為其結(jié)合的關(guān)鍵基團(tuán)。藏紅花醛結(jié)構(gòu)為1，3-三甲基-2-甲氧基-1，5-環(huán)己二烯，藏紅花苷在其5位連接1個(gè)葡萄糖分子，藏紅花苷與DNA結(jié)合能力強(qiáng)于藏紅花醛，說明該類結(jié)構(gòu)中5位為其結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。

2 CD在中藥小分子與蛋白質(zhì)相互作用中的應(yīng)用

藥物小分子進(jìn)入體內(nèi)后，經(jīng)過體內(nèi)運(yùn)輸和儲存，到達(dá)受體部位與之結(jié)合后發(fā)揮藥效。蛋白質(zhì)受體的構(gòu)象變化對其發(fā)揮生理功效有重大意義。CD譜對構(gòu)象變化靈敏，常用于探討蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象的變化。蛋白質(zhì)典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)在位于208、222 nm處有雙負(fù)峰；β-折疊約在215 nm處存在1個(gè)負(fù)峰；200 nm附近的負(fù)峰是無規(guī)則卷曲的特征曲線。利用軟件或計(jì)算公式可以計(jì)算出蛋白中α-螺旋等二級結(jié)構(gòu)含量的改變。下面仍從中藥小分子的常見分類分別進(jìn)行介紹。

2.1 苯丙素類

謝余寰[20]研究發(fā)現(xiàn)，短葉蘇木酚酸與牛血清白蛋白（BSA）相互作用后，使該蛋白α-螺旋含量增加。王靜[21]研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸與溶菌酶（LYSO）相互作用，使其α-螺旋結(jié)構(gòu)增加，空間結(jié)構(gòu)更加緊密；使BSA和人血清白蛋白（HSA）的α-螺旋含量均增加，對HSA影響更大。吳愛芝等[22]研究發(fā)現(xiàn)，肉蓯蓉苷F（CF）與BSA結(jié)合形成復(fù)合物，使其α-螺旋含量減少；同時(shí)研究了金屬離子Cu2+、Fe3+、Zn2+、Mg2+對CF與BSA結(jié)合的影響，發(fā)現(xiàn)4種金屬離子均可以增強(qiáng)二者的結(jié)合作用。宋志英[23]研究發(fā)現(xiàn)，PSO、異補(bǔ)骨脂素（ISO）、5-甲氧基補(bǔ)骨脂素（5-MOP）、8-甲氧基補(bǔ)骨脂素（8-MOP）與LYSO相互作用后，分別使蛋白中α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量降低27.1%、11.5%、10.6%、0.917%，作用強(qiáng)度大小為8-MOP＞5-MOP＞ISO＞PSO；且4種稀土離子鑭離子（La3+）、釓離子（Gd3+）、鐿離子（Yb3+）、镥離子（Lu3+）加入后，增強(qiáng)了該類小分子與LYSO的相互作用。岳園園[24]研究發(fā)現(xiàn)，秦皮乙素是通過與HSA結(jié)合，使其α-螺旋含量降低而發(fā)揮相應(yīng)的藥理作用。

綠原酸、短葉蘇木酚酸、CF、白藜蘆醇均為簡單苯丙素類化合物，CD譜表明，其與蛋白質(zhì)作用后，大多使α-螺旋含量增加，但CF卻使α-螺旋含量減少。分析結(jié)構(gòu)差異發(fā)現(xiàn)，CF在3位被1分子的蕓香糖取代，說明簡單苯丙素類化合物中3位可能為決定其與蛋白作用方式的關(guān)鍵位點(diǎn)。PSO、ISO、5-MOP、8-MOP、秦皮乙素均為香豆素類化合物，與蛋白作用后均使α-螺旋含量減少。簡單苯丙素類與香豆素類的結(jié)構(gòu)差異表現(xiàn)為，香豆素類具有苯駢α-吡喃酮母核的結(jié)構(gòu)，因此推斷香豆素類吡喃環(huán)上的內(nèi)酯鍵可能是造成兩者結(jié)合方式不同的主要原因。PSO、ISO、5-MOP、8-MOP與蛋白作用強(qiáng)度的差異與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，PSO、ISO呋喃環(huán)位置不同，PSO在6、7位，ISO在7、8位，8-MOP在8位-OCH3取代，5-MOP在5位-OCH3取代。這說明5、6、7、8位取代基差異可直接影響該類化合物與蛋白作用強(qiáng)度，為其作用關(guān)鍵位點(diǎn)。

2.2 黃酮類

王瑞玲[7]研究表明，4′-苯基-3-溴-8-[N，N-二（2-羥基乙基）氨基甲基]黃酮是通過與HSA結(jié)合后改變其二級結(jié)構(gòu)，使其α-螺旋含量降低，從而發(fā)揮抗菌、抗病毒作用。王瑛[25]研究發(fā)現(xiàn)，陳皮中的桔皮素和3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮與免疫球蛋白E相互作用，α-螺旋結(jié)構(gòu)、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量降低，β-折疊和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量增加。吳錦繡等[26]研究發(fā)現(xiàn)，蘆丁與BSA、HSA相互作用后，BSA和HSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)減少。王春等[27]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素使BSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)明顯減少。黃燦[28]研究發(fā)現(xiàn)，劍葉龍血素A、劍葉龍血素B均使BSA的α-螺旋含量明顯減少，且劍葉龍血素B的作用力更強(qiáng)。岳園園[24]研究發(fā)現(xiàn)，川陳皮素、杧果素均是通過與HSA結(jié)合，使其α-螺旋含量降低，而發(fā)揮相應(yīng)的藥理作用。閆家凱[29]研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素使α-葡萄糖苷酶的α-螺旋含量減少，而β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的含量不斷增加，使α-葡萄糖苷酶的構(gòu)象發(fā)生變化，使其二級結(jié)構(gòu)重新排列，誘導(dǎo)酶活性口袋關(guān)閉，使該酶活性降低。王亞杰等[30]研究發(fā)現(xiàn)，桑色素使黃嘌呤氧化酶β-折疊含量增加，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的含量降低，使該酶的結(jié)構(gòu)更加緊湊而不利于其活性中心暴露于反應(yīng)環(huán)境中，從而降低了其活性。田建裊等[31]研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷使α-糜蛋白酶的α-螺旋含量減少。Shao J等[32]研究發(fā)現(xiàn)，葛根素使細(xì)胞色素P450酶（CYP）的疏水作用減弱，α-螺旋含量下降。Tang L等[33]研究發(fā)現(xiàn)，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷使BSA的α-螺旋含量增加。He W等[34]研究發(fā)現(xiàn)，山姜素使HSA的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)減少，無規(guī)則卷曲增加。He Y等[35]研究發(fā)現(xiàn)，葛根素使HSA中α-螺旋輕微減少。

桔皮素、柚皮苷、山姜素屬于二氫黃酮類，木犀草素、川陳皮素、桑色素、4′-苯基-3-溴-8-[N，N-二（2-羥基乙基）氨基甲基]黃酮、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮屬于黃酮類，蘆丁、槲皮素屬于黃酮醇類，劍葉龍血素A、劍葉龍血素B屬于二氫查爾酮類，杧果素屬于苯駢色原酮類，葛根素屬于異黃酮類，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷屬于花色素類。CD譜表明，黃酮類的中藥小分子與蛋白質(zhì)作用后，大多使其α-螺旋含量減少，但矢車菊素-3-O-葡萄糖苷使α-螺旋含量增加。黃酮類基本母核的C環(huán)無羰基，1位氧原子以佯鹽的形式存在，使其具有如親水性強(qiáng)等類似鹽的性質(zhì)，該特殊結(jié)構(gòu)可能是花色素類黃酮與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)使其α-螺旋含量增加的原因。劍葉龍血素B對蛋白的作用強(qiáng)于劍葉龍血素A，分析兩者結(jié)構(gòu)差異，劍葉龍血素B的4位上比劍葉龍血素A多1個(gè)—OCH3，提示二氫查爾酮類化合物的4位可能為其相互作用的活性位點(diǎn)。

2.3 萜類

劉金河等[36]研究發(fā)現(xiàn)，甘草次酸使得Bloom解旋酶α-螺旋結(jié)構(gòu)減少，改變其構(gòu)象。劉璐莎等[37]研究發(fā)現(xiàn)，土貝母皂苷Ⅱ使HSA的α-螺旋含量減少。劉志芳等[38]研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸和齊墩果酸均使胰脂肪酶α-螺旋含量降低，熊果酸比齊墩果酸的影響更顯著。丁蘭等[39]研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸使BSA的α-螺旋顯著減少，肽鏈伸展，疏水作用減弱。丁蘭等[40]研究發(fā)現(xiàn)，貝殼杉烷二萜類化合物L(fēng)eukamenin E單體使BSA結(jié)構(gòu)收縮，α-螺旋結(jié)構(gòu)增加。Chen YC等[41]研究發(fā)現(xiàn)，柴胡皂苷C使HSA的α-螺旋減少，β-折疊和無規(guī)則卷曲增加。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，澤瀉調(diào)酯有效成分23-乙酰澤瀉醇B和24-乙酰澤瀉醇A使HSA、人血紅蛋白的α-螺旋含量降低，β-折疊和無規(guī)則卷曲含量增加，23-乙酰澤瀉醇B引起的結(jié)構(gòu)變化程度比24-乙酰澤瀉醇A高[42-43]。該作用結(jié)果可能與2種化合物的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的差異有關(guān)，側(cè)鏈打開則結(jié)合力強(qiáng)，側(cè)鏈與母環(huán)折疊則結(jié)合力弱。

土貝母皂苷Ⅱ、柴胡皂苷C、甘草次酸、齊墩果酸、熊果酸、23-乙酰澤瀉醇B和24-乙酰澤瀉醇A均屬三萜類，Leukamenin E單體屬二萜類。CD譜表明，三萜類中藥小分子與蛋白質(zhì)的相互作用大多使其α-螺旋含量降低，但Leukamenin E則相反。二者基本碳架均為異戊二烯單位，但Leukamenin E的11位上連1個(gè)羰基，由此推測萜類化合物的11位為其相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)。熊果酸比齊墩果酸對蛋白作用更強(qiáng)，兩者為同分異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)差異為E環(huán)上2個(gè)甲基位置不同，熊果酸甲基在C19位，齊墩果酸在C20位，由此推測19、20位為兩者相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)。

2.4 生物堿

苑莉莉等[44]研究發(fā)現(xiàn)，喜樹堿（HCPT）使BSA的α-螺旋含量減少，導(dǎo)致肽鏈變得疏松。周能等[45-46]研究發(fā)現(xiàn)，荷花堿使BSA肽鏈?zhǔn)湛s，導(dǎo)致α-螺旋結(jié)構(gòu)增加。楊健等[47]研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿加入后使BSA構(gòu)象改變，α-螺旋減少，β-折疊增加。楊美玲等[48]研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿使HSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量顯著降低。徐香玉等[49]研究發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿使BSA的α-螺旋含量降低，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)部分轉(zhuǎn)變成了β-折疊結(jié)構(gòu)，有序性增強(qiáng)。閆瀟娜[50]研究發(fā)現(xiàn)，黃藤素（PMT）使牛血紅蛋白（BHb）α-螺旋含量降低；在BHb-PMT體系中加入鎂離子（Mg2+）、Zn2+、銅離子（Cu2+）、鐵離子（Fe3+）、Co2+、鎳離子（Ni2+），發(fā)現(xiàn)Mg2+、Zn2+、Cu2+、Co2+不利于BHb與PMT的結(jié)合，而Fe3+、Ni2+則反之。

苦參堿、氧化苦參堿屬賴氨酸系生物堿類中的喹諾里西啶類，HCPT是色氨酸系生物堿類中的單萜吲哚類，荷花堿、青藤堿、黃藤素均屬異喹啉類。CD譜表明，生物堿與蛋白質(zhì)結(jié)合后，大多使α-螺旋減少，β-折疊增加。但荷花堿使α-螺旋增加，其結(jié)構(gòu)為2個(gè)芐基異喹啉通過1～3個(gè)醚鍵相連接，由此推測可能是其分子中的醚鍵引起了BSA肽鏈的收縮，拉近肽鏈中的—C＝O和—NH，形成新的氫鍵，使α-螺旋結(jié)構(gòu)含量增大。這提示同一生源途徑結(jié)合化學(xué)結(jié)構(gòu)類型的生物堿與蛋白質(zhì)相互作用對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響大體可能相似，但也可以通過改變其分子結(jié)構(gòu)，改變其與蛋白質(zhì)的結(jié)合方式。

2.5 醌類

田萌等[51]研究發(fā)現(xiàn)，大黃素、大黃酸、大黃酚通過改變胰蛋白酶的二級結(jié)構(gòu)，使其α-螺旋含量減少，β-折疊含量增加，抑制其活性，作用強(qiáng)度大小為大黃酸＞大黃素＞大黃酚。劉華等[52]研究發(fā)現(xiàn)，大黃酸通過使α-淀粉酶的α-螺旋含量下降來實(shí)現(xiàn)對α-淀粉酶的抑制作用。馬躍文等[53]研究發(fā)現(xiàn)，大黃酸和大黃素通過與過氧化氫酶結(jié)合，使過氧化氫酶的α-螺旋含量下降，其中大黃素對過氧化氫酶作用較強(qiáng)。趙芳等[54]研究發(fā)現(xiàn)，大黃酸銅（Ⅱ）配合物使BSA的α-螺旋含量減小，使色氨酸殘基所處微環(huán)境的疏水性增加。

大黃素、大黃酸、大黃酚均屬于羥基蒽醌類，CD譜表明，其與蛋白質(zhì)相互作用后，大多使α-螺旋含量減少，β-折疊含量增加，且三者的作用強(qiáng)度大小為大黃酸＞大黃素＞大黃酚。分析其結(jié)構(gòu)：大黃酸3位是—COOH，6位是—H；大黃素3位是—CH3，6位是—OH；大黃酚的3位是—CH3，6位是—H。由此推測，3、6位為羥基蒽醌類小分子與蛋白質(zhì)結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)，該位置取代基極性越大，則結(jié)合力越強(qiáng)。

3 結(jié)語

目前，X-射線晶體衍射是檢測生物大分子構(gòu)象變化最準(zhǔn)確的方法，但結(jié)構(gòu)復(fù)雜、柔性大的蛋白質(zhì)難以得到理想的晶體結(jié)構(gòu)，且對分子量較大的蛋白質(zhì)，所得數(shù)據(jù)過于龐大，難以計(jì)算處理。相比之下，CD譜則具有樣品用量少，操作簡單、快速，對生物大分子構(gòu)象變化敏感，不受分子大小限制等優(yōu)點(diǎn)。近年來，CD譜被廣泛用于研究中藥小分子與生物大分子相互作用的研究。根據(jù)中藥小分子與DNA、蛋白質(zhì)相互作用后，DNA、蛋白質(zhì)的CD譜中特征峰的強(qiáng)度改變及位移，可知中藥小分子與DNA的結(jié)合模式及對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的改變，并可根據(jù)公式計(jì)算改變的程度。筆者已將CD技術(shù)應(yīng)用于中藥小分子乙酰澤瀉醇與HSA、Hb相互作用的研究[42-43]，探討了其調(diào)脂活性差異與小分子結(jié)構(gòu)差異的關(guān)聯(lián)，其結(jié)果可為調(diào)脂中藥澤瀉的藥效機(jī)制提供依據(jù)。

CD下一步突破點(diǎn)與重點(diǎn)研究趨勢：針對CD譜存在提供的構(gòu)象方面信息較少的缺陷，研究者們進(jìn)行了兩方面的后續(xù)研究。（1）進(jìn)行誘導(dǎo)CD的探索性研究。很多中藥小分子沒有光學(xué)活性，但與生物大分子相互作用后，分子構(gòu)象發(fā)生變化，通過兩者之間的電子躍遷偶極矩的耦合可獲得誘導(dǎo)CD。在中藥小分子與生物大分子的混合體系的CD譜中，根據(jù)誘導(dǎo)CD信號，可得到更多兩者相互作用的結(jié)合信息，如出現(xiàn)裂分誘導(dǎo)CD信號，則提示出現(xiàn)中藥小分子二聚體或更大聚合體。中藥小分子與DNA作用后，通過誘導(dǎo)CD信號的變化，根據(jù)4個(gè)序列的譜型特征，可推測其與DNA結(jié)合的序列。中藥小分子與蛋白質(zhì)作用后，誘導(dǎo)CD信號則可提供兩者的結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合構(gòu)象等信息。（2）將CD譜與紫外-可見吸收光譜法、熒光光譜，分子模擬等技術(shù)聯(lián)用[2，5，42-43，52]，紫外、熒光、分子模擬可提供兩者相互作用的結(jié)合距離、結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合模式、結(jié)合能、靜電能等多方面的結(jié)合參數(shù)。多種技術(shù)間彼此互為驗(yàn)證、互相補(bǔ)充，一方面可大大拓展CD的適用范圍，另一方面可從不同的角度完善其結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，進(jìn)而提高了分析結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。

[1] 甘禮社，周長新.振動圓二色譜：一種確定手性分子絕對構(gòu)型的新方法[J].有機(jī)化學(xué)，2009，29（6）：848-857.

[2] Kundu N，RoyA，Banik D，et al.Unveiling the mode of interaction of berberine alkaloid in different supramolecular confined environments：interplay of surface charge between nano-confined charged layer and DNA[J].J Phys Chem B，2016，120（6）：1106-1120.

[3] Chen ZF，Shi YF，Liu YC，et al.TCM active ingredient oxoglaucine metal complexes：crystal structure，cytotoxicity，and interaction with DNA[J].Inorg Chem，2012，51（4）：1998-2009.

[4] Saha SK，Sikdar S，Mukherjee A，et al.Ethanolic extract of the Goldenseal，Hydrastis canadensis，has demonstrable chemopreventive effects on HeLa cells in vitro：drug-DNA interaction with calf thymus DNA as target[J].Environ Toxicol Pharmacol，2013，36（1）：202-214.

[5] 李悅，何華，肖得力，等.光譜法及分子模擬法研究楊梅素與ct-DNA的相互作用[J].分析測試學(xué)報(bào)，2015，34（11）：1233-1239.

[6] 歐陽熙林，朱志仁，王恒山，等.山柰苷及其鋅配合物與DNA的相互作用[J].右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，35（4）：453-455.

[7] 王瑞玲.4′-苯基-3-溴-8-[N，N-二（2-羥基乙基）氨基甲基]黃酮與生物大分子相互作用的研究[D].南昌：江西師范大學(xué)，2013：1-38.

[8] Hemachandran H，Anantharaman A，Priya RR，et al.Interaction of catechu dye with DNA：spectroscopic and in silico approach[J].Nucleos Nucleot Nucl，2016，35（4）：195-210.

[9] Hegde AH，Prashanth SN，Seetharamappa J.Interaction of antioxidant flavonoids with calf thymus DNA analyzed by spectroscopic and electrochemical methods[J].J Pharm Biomed Anal，2012，doi：10.1016/j.jpba.2012.01.034.

[10] Zhang G，F(xiàn)u P，Wang L，et al.Molecular spectroscopic studies of farrerol interaction with calf thymus DNA[J].J Agric Food Chem，2011，59（16）：8944-8952.

[11] 李玉英，管英英，張立偉，等.1，4-二甲基-6，8-二甲氧基-9，10-蒽醌的合成及其與BSA和ct-DNA的相互作用[J].

化學(xué)通報(bào)，2015，78（6）：525-531.

[12]王新寧，張召，吳孝惠，等.大黃素與c-myc G4-DNA相互作用的研究[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，29（4）：374-377.

[13] 田莉莉.天然酚酸類對DNA損傷的抑制效應(yīng)研究[D].天津：天津大學(xué)，2010：33-46.

[14] 呂夢嬌.小分子化合物與DNA相互作用的光譜性質(zhì)的研究[D].保定：河北大學(xué)，2014：21-31.

[15] Sarwar T，Husain MA，Rehman SU，et al.Multi-spectroscopic and molecular modelling studies on the interaction of esculetin with calf thymus DNA[J].Mol Bio Syst，2015，11（2）：522-531.

[16] Zhou X，Zhang G，Wang L.Probing the binding mode of psoralen to calf thymus DNA[J].Int J Biol Macromol，2014，67（3）：228-237.

[17] Hoshyar R，Bathaie SZ，Kyani A，et al.Is there any interaction between telomeric DNA structures，G-quadruplex and I-motif，with saffron active metabolites?[J].Nucleos Nucleot Nucl，2012，31（11）：801-812.

[18] Rajesh J，Rajasekaran M，Rajagopal G，et al.Analytical methods to determine the comparative DNA binding studies of curcumin-Cu（Ⅱ）complexes[J].Spectrochim ActaA，2012，doi：10.1016/j.saa.2012.05.006.

[19] Ahmadi F，Alizadeh AA，Shahabadi N，et al.Study binding of Al-curcumin complex to ds-DNA，monitoring by multispectroscopic and voltammetric techniques[J].Spectrochim Acta A，2011，doi：10.1016/j.saa.2011.05.002.

[20] 謝余寰.酚酸類及生物堿類藥物小分子和牛血清蛋白相互作用研究[D].桂林：廣西師范大學(xué)，2008：20-51.

[21] 王靜.綠原酸與3種生物大分子相互作用的研究[D].揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2012：19-46.

[22] 吳愛芝，林朝展，趙小寧，等.肉蓯蓉苷F與牛血清白蛋白相互作用的光譜學(xué)研究[J].中國中藥雜志，2012，37（10）：1392-1397.

[23] 宋志英.三類中藥活性成分與溶菌酶的作用機(jī)制及構(gòu)效關(guān)系研究[D].太原：山西醫(yī)科大學(xué)，2013：8-70.

[24] 岳園園.某些染料、藥物小分子與蛋白質(zhì)的相互作用研究[D].蘭州：蘭州大學(xué)，2010：66-95.

[25] 王瑛.陳皮中黃酮類化合物和免疫球蛋白E相互作用的光譜學(xué)研究[D].長春：吉林大學(xué)，2015：20-40.

[26] 吳錦繡，張胤，李梅，等.蘆丁對血清白蛋白構(gòu)象的影響[J].光譜學(xué)與光譜分析，2008，28（11）：2619-2622.

[27] 王春，吳秋華，王志，等.槲皮素與牛血清白蛋白相互作用的研究[J].光譜學(xué)與光譜分析，2006，26（9）：1672-1675.

[28] 黃燦.龍血竭化學(xué)成分分析及其與牛血清白蛋白相互作用研究[D].武漢：中南民族大學(xué)，2009：32-53.

[29] 閆家凱.木犀草素對黃嘌呤氧化酶、α-葡萄糖苷酶抑制機(jī)理的探討[D].南昌：南昌大學(xué)，2014：40-49.

[30] 王亞杰，張國文.桑色素對黃嘌呤氧化酶活性的抑制作用[J].食品科學(xué)，2014，35（13）：143-146.

[31] 田建裊，黎彩鳳，趙彥春，等.柚皮苷與α-糜蛋白酶相互作用的光譜研究[J].廣西師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，27（4）：70-73.

[32] Shao J，Chen J，Li T，et al.Spectroscopic and molecular docking studies of the in vitro interaction between puerarin and cytochrome P450[J].Molecules，2014，19（4）：4760-4769.

[33] Tang L，Li S，Bi H，et al.Interaction of cyanidin-3-O-glucoside with three proteins[J].Food Chem，2016，doi：10.1016/j.foodchem.2015.09.089.

[34] He W，Li Y，Xue C，et al.Effect of Chinese medicine alpinetin on the structure of human serum albumin[J].Bioorgan Med Chem，2005，13（5）：1837-1845.

[35] He Y，Wang Y，Tang L，et al.Binding of puerarin to human serum albumin：a spectroscopic analysis and molecular docking[J].J Fluoresc，2008，18（2）：433-442.

[36] 劉金河，許厚強(qiáng)，孟惠惠，等.甘草次酸對Bloom解旋酶生物學(xué)特性的影響[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2014，30（9）：919-926.

[37] 劉璐莎，樊君，胡春梅，等.土貝母皂苷Ⅱ與人血清白蛋白相互作用機(jī)制的光譜研究[J].化學(xué)學(xué)報(bào)，2011，69（21）：2589-2596.

[38] 劉志芳，田萌，馬躍文，等.熊果酸和齊墩果酸對胰脂肪酶活性及構(gòu)象的影響[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2009，20（10）：2600-2602.

[39] 丁蘭，彭舒，柳志軍，等.熒光、圓二色及共振光散射光譜研究熊果酸與牛血清白蛋白的相互作用[J].西北師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，49（1）：78-85.

[40] 丁蘭，王帆，陳廣德，等.紫外和圓二色光譜研究Leukamenin E與牛血清白蛋白的相互作用[J].西北師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，48（2）：70-73.

[41] Chen YC，Wang HM，Niu QX，et al.Binding between saikosaponin C and human serum albumin by fluorescence spectroscopy and molecular docking[J].Molecules，2016，21（2）：153-166.

[42] Xu F，Wu Q，Chen J，et al.The binding mechanisms of plasma protein to active compounds in Alismaorientale rhizomes（Alismatis Rhizoma）[J].Bioorg Med Chem Lett，2014，24（17）：4099-4105.

[43] 徐飛，張林群，何立巍，等.澤瀉醇類化合物與血清白蛋白相互作用的分子機(jī)理研究[J].化學(xué)學(xué)報(bào)，2011，69（19）：2228-2234.

[44] 苑莉莉，劉雄，張業(yè)中，等.光譜法研究羥喜樹堿與牛血清白蛋白的相互作用[J].化學(xué)與生物工程，2012，29（4）：18-22.

[45] 周能，梁逸曾，王平，等.荷花堿與牛血清白蛋白的相互作用[J].分析化學(xué)，2008，36（8）：1066-1070.

[46] 周能，梁逸曾，劉韶.甲基蓮心堿與人血清白蛋白相互作用的研究[J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2010，27（1）：49-54.

[47] 楊健，余睿，陳杏.青藤堿與牛血清白蛋白相互作用的光譜研究[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，27（6）：571-574.

[48] 楊美玲，高琦寬，宋玉民.苦參堿Fe（Ⅲ）化合物的合成及其與HSA相互作用的光譜研究[J].化學(xué)研究與應(yīng)用，2014，26（10）：1551-1556.

[49] 徐香玉，孫祥軍，劉敏，等.氧化苦參堿與牛血清白蛋白相互作用的熱力學(xué)研究[J].化學(xué)學(xué)報(bào)，2009，67（18）：2155-2158.

[50] 閆瀟娜.光譜法研究蛋白質(zhì)與藥物小分子的相互作用及共存金屬離子的影響[D].保定：河北大學(xué)，2013：28-45.

[51] 田萌，劉克武.大黃3種有效成分對胰蛋白酶活性及結(jié)構(gòu)的影響[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，47（1）：192-196.

[52] 劉華，李仕祥，鐘業(yè)俊，等.大黃酸對α-淀粉酶的抑制機(jī)理分析及分子模擬[J].現(xiàn)代食品科技，2015，31（2）：47-51.

[53] 馬躍文，田萌，劉克武.大黃酸和大黃素與過氧化氫酶相互作用的研究[J].華西藥學(xué)雜志，2010，25（6）：694-696.

[54] 趙芳，梁慧，程惠，等.大黃酸銅（Ⅱ）配合物與牛血清白蛋白的相互作用[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2011，32（6）：1277-1283.

R913

A

1001-0408（2017）10-1402-06

2016-06-21

2016-08-23）

（編輯：余慶華）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81303173，No. 81173483）；江蘇省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（No.BK20161576）；江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目（No.14KJB360001）；江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程資助項(xiàng)目（No.PPZY2015A070）

＊副教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中藥藥效物質(zhì)的化學(xué)生物學(xué)研究。電話：025-85811520。E-mail：6612386@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.10.29