高表達(dá)的Wnt分泌蛋白1促進(jìn)肺癌化療耐受

賈小婷 羅利云 李 楠 (廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣東 廣州 510095)

高表達(dá)的Wnt分泌蛋白1促進(jìn)肺癌化療耐受

賈小婷 羅利云 李 楠 (廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣東 廣州 510095)

目的探討Wnt分泌蛋白(WISP)1在肺癌中的表達(dá)量及作用。方法生物信息學(xué)分析WISP1在肺癌及癌旁組織中的表達(dá)量，qRT-PCR檢測(cè)肺癌組織及癌旁組織中WISP1 mRNA的表達(dá)。在肺癌細(xì)胞中干預(yù)WISP1的表達(dá)，檢測(cè)處理后細(xì)胞化療敏感性的變化。結(jié)果生物信息學(xué)分析免疫組化數(shù)據(jù)庫聯(lián)合qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WISP1 mRNA在肺癌中的表達(dá)量顯著高于癌旁組織，且WISP1在肺癌化療耐受組的表達(dá)量顯著高于化療敏感組。在肺癌細(xì)胞中敲低WISP1對(duì)化療藥物奧沙利鉑的敏感性增加，反之亦然。結(jié)論WISP1在肺癌中高表達(dá)且促進(jìn)肺癌化療耐受。

Wnt分泌蛋白1；肺癌；化療敏感性

肺癌治療耐受機(jī)制不清楚，是其死亡率居高不下的主要原因〔1，2〕。Wnt分泌蛋白(WISP)1是結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CCN)家族的生長(zhǎng)因子，能夠被Wnt-1和β-cantenin誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄〔3〕；其在整個(gè)胚胎發(fā)育過程中都有表達(dá)，而且參與傷口愈合及組織修復(fù)〔4〕。WISP1異常表達(dá)與多種疾病(如骨關(guān)節(jié)病變、纖維化及腫瘤等)密切相關(guān)〔5〕。本文旨在探討WISP1對(duì)肺癌化療敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1一般資料 人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B及肺癌細(xì)胞H1650、H460、A549、95D、HCC827、H1975和H1299由本實(shí)驗(yàn)室保存。將上述細(xì)胞接種于含10%胎牛血清(Gibco公司)的DMEM(Gibco公司)培養(yǎng)液中，在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)標(biāo)本均來自本院組織標(biāo)本庫。收集未經(jīng)過化療或放療處理的肺癌組織標(biāo)本55例，其中化療敏感組21例，化療耐受組34例，同時(shí)收集肺癌患者癌旁組織標(biāo)本38例。

1.2RNAs提取及逆轉(zhuǎn)錄 購買Omega公司生產(chǎn)的RNA Isolation Kit I試劑盒提取組織及細(xì)胞總RNAs。從液氮中取出30 mg組織放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮磨碎組織。加入700 μl RTK裂解液(事先已加入β-巰基乙醇)，用1 ml注射器來回吹打液體10次，加入700 μl無水乙醇，輕微顛倒混勻，12 000 r/min，4℃離心15 min。上清上柱，10 000 r/min離心1 min。棄去廢液，用500 μl RW1洗滌柱子1次，10 000 r/min離心1 min。棄去廢液，用700 μl RW2洗滌柱子2次?？账?，12 000 r/min，3 min。用30 μl無核酶水溶解RNA，靜置2 min。12 000 r/min離心2 min，獲得RNA樣品，用于后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄。將目標(biāo)細(xì)胞用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次，棄廢液，加入700 μl RTK裂解液(事先已加入β-巰基乙醇)，后續(xù)操作與組織提取RNA一致。購買Fermentas cDNA First Strand Reversing kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。配置逆轉(zhuǎn)錄體系：RNA 2 μg，oligo d(T)1 μl，水補(bǔ)足12 μl。65℃ 5 min，立即冰置2 min。加入4 μl反應(yīng)緩沖物，1 μl RNA酶抑制劑，2 μl dNTP，1 μl 反轉(zhuǎn)錄酶。42℃ 1 h，70℃ 5 min。-20℃保存cDNA。

1.3qRT-PCR 反應(yīng)：qRT-PCR購自Fermentas公司 SYBR Master Mix試劑盒，檢測(cè)體系：SYBR 10 μl，正向引物0.8 μl，反向引物0.8 μl，cDNA 1 μl，用水補(bǔ)足20 μl體系。在BioRad熒光定量PCR儀上50℃ 2 min，95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s共40個(gè)循環(huán)。

根據(jù)2-ΔΔct值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物序列：GAPDH-正向5′-ATTCCATGGCACCGTCAAGGCTGA-3′，GAPDH-反向5′-TTCTCCATGGTGGTGAAGACGCCA-3′；WISP1-正向5′-GATGCCTGTGCCACTGACGT-3′，WISP1-反向5′-GTTAGTCCCCAAGACCCA-AGATTT-3′。

1.4載體構(gòu)建 使用軟件Primer Premier 5設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增WISP1開放閱讀框。上游引物：5′-ATAggatccATGGCTGTGAGTGCTGTAAGAT-3′；下游引物：5′-TATctcgagCTAGTTGGCAATT-TCTGAGAAGTC-3′，其中小寫字母表示限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。用BamHI和XhoI消化PCR產(chǎn)物和pCMV-Flag載體，再用T4連接酶將酶切后的WISP1片段和載體連接起來，轉(zhuǎn)化，測(cè)序鑒定陽性克隆并命名為pCMV-WISP1。

1.5Western印跡 RIPA溫和裂解液(購自碧云天)裂解目標(biāo)細(xì)胞，采用二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度。40 mg每孔蛋白的上樣量將目標(biāo)蛋白置于點(diǎn)樣孔，待電泳結(jié)束，將其轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%牛奶封閉2 h，一抗4℃孵育過夜(抗β-actin，1∶500；抗WISP1，1∶1 000)，耦聯(lián)的辣根過氧化酶(HRP)二抗孵育2 h，化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光法(ECL)染色發(fā)光。在正常肺上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCMV-WISP1，在肺癌細(xì)胞H1975中轉(zhuǎn)染靶向WISP1的siRNAs(購自廣州銳博生物有限公司)，48 h后Western印跡檢測(cè)WISP1表達(dá)量。

1.6細(xì)胞活力測(cè)定(MTS)實(shí)驗(yàn) 以4 000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種目標(biāo)細(xì)胞于96孔板，37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。每組細(xì)胞分別加入0.00、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/L的奧沙利鉑(oxaliplatin)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)5個(gè)副孔。72 h后，加入20 μl/孔MTS，3 h后490 nm測(cè)量各孔的絕對(duì)吸光值。統(tǒng)計(jì)分析各組細(xì)胞的存活率。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)的組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1WISP1 mRNA在肺癌中的表達(dá) WISP1 mRNA在肺癌組織中的表達(dá)量(6.43±2.29)顯著高于癌旁組織(2.40±0.89，P=0.000)。在肺癌細(xì)胞H1650、H460、950、A549、HCC827、H1299、H1975中的表達(dá)量(1.36±0.08，1.99±0.06，2.74±0.23，2.96±0.06，3.58±0.19，5.19±0.15，24.92±4.19)顯著高于肺上皮細(xì)胞BEAS-2B(1.00±0.00；P=0.027，0.002，0.009，0.000，0.003，0.001，0.015)。

2.2WISP1與肺癌化療敏感性的關(guān)系 WISP1在化療耐受組的表達(dá)量(7.17±2.40)顯著高于化療敏感組(5.24±1.47，P=0.002)。在BEAS-2B細(xì)胞中過表達(dá)WISP1，MTS結(jié)果顯示W(wǎng)ISP1可明顯增加BEAS-2B細(xì)胞對(duì)化療藥物oxaliplatin的耐受性。采用siRNAs(購自廣州銳博生物有限公司)沉默WISP1，Western印跡結(jié)果顯示si-#3沉默效果最佳，用于后續(xù)研究。MTS結(jié)果顯示敲低WISP1可顯著提高H1975細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性。見圖1。

3 討 論

目前關(guān)于WISP1在腫瘤中的作用尚未有定論。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)WISP1在乳腺癌中扮演抑癌基因，WISP1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)量低于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組，在預(yù)后差組的表達(dá)量低于預(yù)后良好組的表達(dá)量〔6〕。但有研究發(fā)現(xiàn)WISP1發(fā)揮原癌分子效應(yīng)。WISP1在多種腫瘤中過表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤的發(fā)展進(jìn)程，與患者預(yù)后負(fù)相關(guān)〔7〕。在用人前列腺癌細(xì)胞建立的異種移植小鼠模型中，用WISP1中和抗體處理能夠顯著抑制瘤體生長(zhǎng)和骨轉(zhuǎn)移〔8〕。使用WISP1中和抗體缺失WISP1后能夠引起放療耐受的食管癌細(xì)胞有絲分裂障礙，但是對(duì)正常的食管癌細(xì)胞無影響〔8〕。WISP1可上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2，促進(jìn)黏著斑激酶(FAK)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(MEK)及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)發(fā)生磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移〔9〕。本研究發(fā)現(xiàn)WISP1在肺癌組織高表達(dá)，且與肺癌化療耐受正相關(guān)。在肺癌細(xì)胞中敲低WISP1將增加該細(xì)胞的化療敏感性。

1Torre LA，Bray F，Siegel RL，etal.Global cancer statistics，2012〔J〕.CA Cancer J Clin，2015；65(2)：87-108.

2Siegel RL，Miller KD，Jemal A.Cancer statistics，2016〔J〕.CA Cancer J Clin，2016；66(1)：7-30.

3Xu L，Corcoran RB，Welsh JW，etal.WISP-1 is a Wnt-1-and beta-catenin-responsive oncogene〔J〕.Genes Dev，2000；14(5)：585-95.

4Berschneider B,K?nigshoff M.WNT1 inducible signaling pathway protein1 (WISP1)：a novel mediator linking development and disease〔J〕.Int J Biochem Cell Biol，2011；43(3)：306-9.

5Gurbuz I,Chiquet-Ehrismann R.CCN4/WISP1 (WNT1 inducible signaling pathway protein 1)：a focus on its role in cancer〔J〕.Int J Biochem Cell Biol，2015；62(2)：142-6.

6Davies SR，Watkins G，Mansel RE，etal.Differential expression and prognostic implications of the CCN family members WISP-1，WISP-2，and WISP-3 in human breast cancer〔J〕.Ann Surg Oncol，2007；14(6)：1909-18.

7Ono M，Inkson CA，Sonn R，etal.WISP1/CCN4：a potential target for inhibiting prostate cancer growth and spread to bone〔J〕.PLoS One，2013；8(8)：e71709.

8Li WF，Zhang L，Li HY，etal.WISP-1 contributes to fractionated irradiation-induced radioresistance in esophageal carcinoma cell lines and mice〔J〕.PLoS One，2014；9(4)：e94751.

9Hou CH，Chiang YC，F(xiàn)ong YC，etal.WISP-1 increases MMP-2 expression and cell motility in human chondrosarcoma cells〔J〕.Biochem Pharmacol，2011；81(11)：1286-95.

R734.2

A

1005-9202(2017)24-6025-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.009

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81602016，81472184)；廣州市衛(wèi)計(jì)委一般引導(dǎo)項(xiàng)目(20171A011321)；廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金(A2017362)

李 楠(1983-)，女，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤化療耐受機(jī)制研究。

賈小婷(1985-)，女，實(shí)驗(yàn)師，主要從事腫瘤化療耐受機(jī)制研究。

〔2017-05-23修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)